Summary

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

Abstract

איפיון תאים חיסוניים מסתמך בכבדות על cytometry זרימה ססגוניות לזהות subpopulations מבוסס על ביטוי דיפרנציאלי של סמני פני השטח. ההתקנה של לוח ססגוניות הקלאסי דורש כלים באיכות גבוהה, נוגדנים עם תוויות מותאמות אישית ועיצוב ללמוד בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלי. פיתחנו ניתוח multiparametric לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בדם היקפי על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות fluorochromes רק שני. האסטרטגיה שלנו מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני כל הזמן לידי ביטוי שילוב ייחודי לכל אוכלוסיית תאים. שילוב של מידע זה עם טיטור זהיר של הנוגדנים מאפשרת החוקרים להקליט חמישה סמנים נוספים, להרחיב את מגבלת אופטי של רוב cytometers זרימה. השוואה עפות הוכיח כי ניתן לאפיין את הרוב המכריע של אוכלוסיות תאים חיסוניים בדם היקפי עם דיוק השוואה בין השיטה שלנו קלאסי “סמן fluorochrome-אחד אחד הגישה”, למרות שהאחרון הוא עדיין מדויקת יותר לזיהוי אוכלוסיות כגון NKT תאים ותאים γδ T. שילוב של שבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes מאפשר הניתוח של אוכלוסיות תא החיסון מורכבות ודוגמאות קליניים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, וכן 2-3 fluorochrome כלי נגינה שדה באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד לסינון מספר אוכלוסיות תאים במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

Introduction

Cytometry זרימה היא טכניקה שפותחה כדי לנתח פרמטרים מרובים על חלקיקי יחיד בשיעור של אלפי אירועים לכל השני1. דוגמאות של דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה כוללים, אך אינם מוגבלים, תאים, חרוזים, חיידקים, שלפוחית, כרומוזומים. מערכת fluidic מנחה את החלקיקים בשלב החקירה שבו כל חלקיק חותך הנתיב שלו עם לייזרים אחד או יותר, פרמטרים מרובים נרשמים לצורך ניתוח נוסף. קדימה ואת הצד בסורקים, שנוצר על ידי פיזור של האור לייזר טהור, משמשים כדי לזהות אוכלוסית היעד ולאחזר מידע על גודלו היחסי פנימיות מורכבות צפיפות החלקיקים, בהתאמה. כל הפרמטרים האחרים, זה חשבון עבור רוב הנתונים בניתוח cytometric זרימה, נגזרים על ידי הגששים התווית על-ידי fluorochrome מזהה, לאגד מטרות ספציפיות על החלקיקים עניין.

Cytometry זרימה הוא כלי ראשי ללימודי אימונולוגי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים. לנתח את המורכבות של מערכת החיסון, לוחות ססגוניות מתפתחים כל הזמן כדי להרחיב את מספר סמנים שנרשם בו-זמנית עבור immunophenotyping עמוק של אוכלוסיות תא1. זה מוביל להתפתחות של fluorochromes, והכלים כשרוני עם האחרונים cytometers זרימה באיכות גבוהה העולה על 20 פרמטרים פלורסנט. התוצאה היא תכנון המחקר מורכבים בשל חפיפה ספקטרלי fluorochrome, עלויות גבוהות יותר הקשורים עם מפעילי labelling ומיומנים נוגדנים מותאמים אישית. במספר מקרים, מורכבות ועלויות מופחתים באמצעות לוחות נפרדים של סמנים עבור אוכלוסיות תאים שונים. גישה זו, עם זאת, מועדת לשגיאות, מפחית את המידע בחלונית כל אחד, יכול להיות קשה להחיל על דגימות עם מספר מצומצם של תאים. יתר על כן, הגדלת מספר סמנים מונע עמוק immunophenotyping על מכשירים עם פרמטרים פלורסנט פחות. קודם לכן פיתחנו פרוטוקול מכתימים לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בתוך תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות רק שני fluorochromes במקום ה-7 הנדרש באמצעות המסורתי “סמן אחד fluorochrome אחד” הגישה (www.hcdm.org)2,3. הדו ח הראשוני שלנו חקר ואומת הרעיון של שילוב סמני שבע שני fluorochromes עבור immunophenotyping עמוק. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול צעד צעד-מאת לבודד, כתם כדוריות דם היקפיים, התמקדות בהיבט המעשי ופתרון צעדים כדי להשיג מכתים מוצלחת.

פרוטוקול זה מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני יש ביטוי קבוע על פני התא, כי האוכלוסייה בכל תא יש שילוב בלעדי של שושלת היוחסין סמנים. ב- PBMCs, ביטוי CD3 subdivides תאים חיסוניים לשתי קטגוריות עיקריות: CD3-חיובי T לימפוציטים ותאי CD3-שלילי. בתוך קבוצת חיובית CD3, CD4+, CD8+ γδ T תאים יכולים להיות מופרדים באמצעות נוגדנים המיועדים אך ורק CD4, CD8, הקולטן γδ. באופן דומה, בתוך קבוצת שלילי CD3, בתאי B, תאי NK, ומונוציטים יכול להיות ייחודי מזוהה באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה. בגישה fluorochrome-אחד סמן סטנדרטי אחד, נגד-CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-CD19, – CD56 ו- TCR נוגדנים γδ מזוהים עם שבעה fluorochromes שונים. הגישה שלנו משלבת אנטי CD3-CD56, ו- – TCR נוגדנים γδ אחד fluorochrome (הנקראת עבור נוחות fluorochrome A), אנטי-CD4,-CD8, – CD14 ו- CD19 נוגדנים בבית fluorochrome שונים (fluorochrome B). הדבר אפשרי ע י שילוב של נוגדן טיטור וביטוי אנטיגן דיפרנציאלית. CD4 בשני+ ו CD8+ T תאים הן חיוביות עבור נוגדן anti-CD3 ב- fluorochrome A, אבל הם יכולים להיות מופרדים ב- fluorochrome B למקסם את הביטוי של האות CD8 תוך הצבת, עם טיטור אד הוק, האות CD4 בין CD8, התאים חיובי-CD4/CD8 כפול שלילי CD3. תאי T γδ מבטא רמה גבוהה יותר של CD3 מאשר CD4 ו CD8, ולכן הם יכולים להיות מזוהה CD3 גבוהה4. האות הזה הוא מועלה על ידי תיוג γδ תאי T ב- fluorochrome A עם נוגדנים γδ anti-TCR, ובכך לשפר את ההפרדה בין תאי T נמוך CD3 CD3 גבוהה γδ T תאים. בתאי B יכול להיות מזוהה CD3 ב fluorochrome A ו- CD19+ ב- fluorochrome B. כדי להפריד CD3 שליליים תאי NK מתאי B, נוגדן anti-CD56 שימש ב- fluorochrome A האנטי-CD3. דבר זה אפשרי משום CD56 הביע על תאי NK ברמה נמוכה יותר מאשר CD3 על תאי T5. לבסוף, ומונוציטים ניתן לזהות באמצעות שילוב של מאפיינים לפנים לצד פיזור וביטוי של CD14 ב- fluorochrome B.

הרעיון של שילוב עד ארבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes יש ניסיון כבר בהצלחה לפני6,7,8, נעשה שימוש ב פרוטוקול קליני כדי לזהות אוכלוסיות לימפוציטית ממאיר9 . הדוח הקודם גם משולב 7 סמנים (עם ירידה לפרטים שונים של הסמנים פעם בפרוטוקול שלנו) באמצעות שתי fluorochromes, אך גישה זו התבססה על תוויות מתחם של כל נוגדן עם כמות משתנה של fluorochrome10. זהו לעומת השיטה שלנו, אשר משתמשת נוגדנים זמינים מסחרית, ניתן להתאים את תצורת המכשיר והוא יכול לנצל הדור החדש של פולימר fluorochromes.

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להרחיב את הגבולות אופטי של רוב cytometers זרימה המאפשר ההקלטה של חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבים. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוח אימונולוגי מתקדמים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, 2-3 fluorochrome שדה מכשירים ניתן להשיג תוצאות יוצא דופן באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה כדי ליצור זרימה מודולרי cytometric לוחות מיקוד מספר שושלות באותו הזמן11. זה יכול באופן פוטנציאלי להפחית את מספר לוחות המשמשים cytometry זרימה immunophenotyping מודולרית, להפחית עלויות, שגיאות זמן טיפול. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

Protocol

כל המחקרים חומרים אנושיים אושרו על-ידי ג’ונס הופקינס מוסדיים ועדת הבדיקה תחת ביטוח בריאות ניידות דין וחשבון. דוגמאות החולה ושליטה היו de-מזוהה. PBMCs ודם מפני פקדי בריא התקבלו על ידי הסכמה מדעת. הערה: פרוטוקול זה נבדק על טריות או קפואות מבודדות תאי דם היקפיים, דם מלא. <…

Representative Results

הגדרה וניתוח של ניסוי cytometry זרימה תאי דם היקפיים האנושי צבעונית עם שבעה סמנים השושלת (anti-CD3,-CD4,-CD8, – CD14,-נוגדנים γδ CD19, – CD56 ו- TCR) משתמשת רק בשני fluorochromes מוצגים. התוצאות נציג מתוארים אנטי-CD8 ו- CD56 נוגדן טיטור. עבור כל נוגדן (בדוגמה זו, אנטי-CD8), נתונ…

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן הוכח להיות די גמיש וחסר רגישות לשינויים מכתים מאגר בטמפרטורה, תא דם היקפיים הכנה בשל ביטוי גבוהה של שושלת היוחסין סמנים על פני התא. השלב הקריטי ביותר עבור קבלת נתונים באיכות גבוהה, לשחזור הוא נוגדן טיטור. ראוי לציין, מאז טיטרציה של נוגדנים תמיד להתבצע במהלך ההגדרה של לו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ועל מחלות עור, , פרס מספר P30-AR053503; קרן גם אני, www.stablerfoundation.org; לאומי המכון לאלרגיה, מחלות זיהומיות, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; נינה אירלנד תוכנית עבור ריאות בריאות (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

Materials

CD3 BD Biosciences 562426 Antibody for staining
RRID: AB_11152082
CD56 BD Biosciences 562751 Antibody for staining
RRID: AB_2732054
TCRgd BD Biosciences 331217 Antibody for staining
RRID: AB_2562316
CD4 BD Biosciences 555347 Antibody for staining
RRID: AB_395752
CD8 BD Biosciences 555367 Antibody for staining
RRID: AB_395770
CD14 BD Biosciences 555398 Antibody for staining
RRID: AB_395799
CD19 BD Biosciences 555413 Antibody for staining
RRID: AB_395813
CD3 BD Biosciences 555335 Antibody for staining
RRID: AB_398591
CD56 BD Biosciences 555518 Antibody for staining
RRID: AB_398601
TCRgd BD Biosciences 331211 Antibody for staining
RRID: AB_1089215
CCR7 Biolegend 353217 Antibody for staining
RRID: AB_10913812
CD45RA BD Biosciences 560674 Antibody for staining
RRID: AB_1727497
CCR4 BD Biosciences 561034 Antibody for staining
RRID: AB_10563066
CCR6 BD Biosciences 353419 Antibody for staining
RRID: AB_11124539
CXCR3 BD Biosciences 561730 Antibody for staining
RRID: AB_10894207
CD57 BD Biosciences 562488 Antibody for staining
RRID: AB_2737625
HLA-DR BD Biosciences 563083 Antibody for staining
RRID: AB_2737994
CD16 BD Biosciences 563784 Antibody for staining
RRID: AB_2744293
Dead cells Life technologies L-23105 Live/dead discrimination
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap BD Bioscience 352235 to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube BD Bioscience 352001 to stain whole blood
Recovery Cell Culture Freezing Medium Thermo fisher 12648010 Freezing cells
96-well V-bottom plate Thermo fisher 249570 plate for staining
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences Flow cytometer
FCS Express 6 De Novo Software FACS analysis
Graphpad Prism GraphPad software Data analysis

References

  1. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).
  2. Boin, F., et al. Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes. PLoS ONE. 12 (11), (2017).
  3. Zola, H., et al. . Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers. , (2007).
  4. Lambert, C., Genin, C. CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).
  5. Ginaldi, L., et al. Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry. Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).
  6. Park, J., Han, K. Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome. Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).
  7. Mansour, I., et al. Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two. Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).
  8. Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes. Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).
  9. Van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).
  10. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).
  11. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
  12. Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLOS ONE. 12 (11), e0187440 (2017).
  13. Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 49, (1997).
  14. Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis. Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).
  15. Maecker, H. T., et al. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry Part A. , (2004).
  16. Noonan, K. A., et al. Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma. Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).
  17. Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells. Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).
  18. Bonecchi, R., et al. Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s. The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).
  19. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).
  20. Rivino, L., et al. Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells. The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).
  21. Ye, Z. -. J., et al. Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. PloS One. 7 (2), e31710 (2012).
  22. Speiser, D. E., et al. Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells. European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).
  23. Caruso, A., et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).
  24. Brenchley, J. M., et al. Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells. Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).
  25. Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction. The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).
  26. Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).

Play Video

Cite This Article
Torchia, M. L. G., Cimbro, R. Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (145), e58955, doi:10.3791/58955 (2019).

View Video