方法文章

人外周血中性粒细胞分离用于通过检测Rab10磷酸化研究帕金森病相关LRRK2激酶通路

DOI：

10.3791/58956

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2020年3月21日

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1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 4Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, 5Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, 6Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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富含亮氨酸重复序列的激酶2基因（LRRK2）的突变可导致遗传性帕金森病。我们开发了一种简便且稳健的方法，用于检测人外周血中性粒细胞中受LRRK2调控的Rab10磷酸化水平。该方法可能有助于识别LRRK2激酶通路活性升高的个体。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）是遗传性帕金森病（PD）中最常发生突变的基因，所有致病性LRRK2突变均会导致其激酶功能过度激活。本文介绍一种简便且稳健的检测方法，通过检测LRRK2对其生理底物Rab10在苏氨酸73位点（Thr73）的磷酸化水平，来定量评估人外周血中性粒细胞中LRRK2激酶通路的活性。该免疫印迹分析需要使用完全特异性的、针对LRRK2磷酸化Rab10 Thr73表位的磷酸化特异性抗体，例如MJFF-pRab10兔单克隆抗体。本方法采用人外周血中性粒细胞，因为外周血易于获取，且中性粒细胞数量丰富、细胞组成均一。重要的是，中性粒细胞中LRRK2和Rab10的表达水平相对较高。中性粒细胞的一个潜在缺点是其内在丝氨酸蛋白酶活性较强，因此裂解缓冲液中必须加入高效蛋白酶抑制剂，例如有机磷神经毒素二异丙基氟磷酸酯（DIFP）。尽管如此，中性粒细胞仍是研究体内LRRK2激酶通路活性的宝贵资源，应考虑将其纳入帕金森病生物样本库的采集范围。

引言

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迄今为止，试图减缓或阻止帕金森病（PD）进展的努力均未成功。富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）基因中存在激活突变，这些突变可导致或增加患帕金森病的风险，这一发现推动了LRRK2激酶抑制剂的开发1,2,3。目前，这些抑制剂已进入临床试验阶段4。LRRK2的确切功能尚不明确，但近年来取得的重要进展是发现了一类Rab GTP酶蛋白（包括Rab10）作为LRRK2激酶首个真正意义上的生理底物5,6,7。在疾病修饰治疗时代，面临的主要挑战是寻找能够反映LRRK2激酶激活状态的生化标志物，以及评估LRRK2激酶抑制剂靶点结合效果的指标。

迄今为止，体内LRRK2抑制剂的主要药代动力学标志物是LRRK2上一组组成型磷酸化的丝氨酸残基，特别是丝氨酸935，该位点在多种LRRK2抑制剂作用下会发生去磷酸化8,9。然而，丝氨酸935的磷酸化水平并不能反映细胞....

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方案

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根据英国当地规定，所有涉及人血的操作和移液均在二级生物安全柜中进行。所有实验步骤均符合当地伦理审查委员会的要求，所有参与者均已签署知情同意书。

1. 准备

  1. 配制含有 100 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS）100 mM EDTA 储存液 0.1 mL。
  2. 配制含有 1 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS）1 mM EDTA 储存液 60 mL。
  3. 配制裂解缓冲液，包含 50 mM Tris-HCl（pH = 7.5）、1%（v/v）Triton X-100、1 mM EGTA、1 mM Na3VO4、50 mM NaF、10 mM β-甘油磷酸钠、5 mM 焦磷酸钠、0.27 M 蔗糖、0.1%（v/v）β-巯基乙醇、1× 蛋白酶抑制剂混合物、1 μg/mL 微囊藻毒素-LR 和 0.5 mM 二异丙基氟磷酸酯（DIFP）。
    注意：作者通常使用不含 EDTA 的产品，但含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物也应有效。裂解缓冲液可预先配制，但不加入 β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊藻毒素-LR 和 DIFP，于 4 °C 保存至使用前。确保 β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊藻毒素-LR 和 DIFP 仅在使用前立即添加。
    注意：DIFP 具有毒性，应在通风橱中谨慎操作，并遵循当地健康与安全风险评估要求。DIFP 可加入裂解缓冲液后立即使用。....

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结果

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本实验通过检测LRRK2依赖性的Rab10蛋白磷酸化水平，用于评估与帕金森病相关的LRRK2激酶在人外周血中性粒细胞中的活性。中性粒细胞是一种均质且数量丰富的外周血白细胞群体，其LRRK2和Rab10蛋白的表达水平均较高（图1）。在其余外周血单个核细胞（PBMCs）中，仅有单核细胞同时具有较高拷贝数的这两种蛋白，但其仅占白细胞总数的2–12%。这表明，外周血中性粒细胞是研究LRRK2调控的Rab10磷酸化的更合适的生物基质。

采用我们的方法从10 mL血液中分离外周血中性粒细胞时，每位供体可获得0.5–0.75 mg的总蛋白裂解液（图2A），足以进行大量免疫印迹分析——每条凝胶加样孔仅需10 μg蛋白。尽管细胞纯度和活力检测非常规操作，但我们通过对三位健康供体的检测证明，分离所得中性粒细胞的纯度为94–98%，细胞活力约为99%，该结果通过流式细胞术分析获得，所用标记物为CD66b−异硫氰酸荧光素中性粒细胞标记物，并采用4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐（D.......

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讨论

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有力的临床、遗传和生化证据表明，LRRK2（富含亮氨酸重复序列的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2）在其激酶功能方面在帕金森病中发挥着重要作用7。目前已有LRRK2激酶抑制剂被开发出来，并正在进入临床试验阶段2,4,12。因此，有必要将LRRK2作为靶点参与度以及患者分层的生物标志物加以利用。本方案描述了一种稳健且简便的检测方法，用于分析LRRK2激酶通路的激活情况，该激活通过人外周血中性粒细胞均一细胞群中其生理底物Rab10的磷酸化水平来反映11,14。在进行定量免疫印迹分析时，我们强烈推荐使用高选择性的磷酸化特异性Rab10抗体（MJFF-pRab10单克隆抗体）14,17。

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢所有健康志愿者为本研究慷慨捐献血液。我们感谢帕金森病研究迈克尔·J·福克斯基金会（MJFF）以及Fox BioNet研究团队（FBN）对本方案撰写及视频制作提供的支持与建议。我们感谢奥地利维也纳大学的Alexander Zimprich教授对本实验方案的测试与合作。我们珍视Paul Davies（MRC蛋白质磷酸化与泛素化单位，PPU总负责人）对本项目所做出的贡献。我们还感谢MRC蛋白质磷酸化与泛素化单位（PPU）提供的出色技术支持，特别是化学合成团队（Natalia Shpiro负责MLi-2的合成）以及PPU试剂与服务部门的抗体纯化团队（由Hilary McLauchlan和James Hastie协调）。我们感谢Vivomotion公司的Mhairi Towler和Fraser Murdoch在视频与动画制作过程中提供的帮助。我们感谢81 films公司的Steve Soave在最终剪辑过程中提供的协助。Esther Sammler获得了苏格兰高级临床学术奖学金的支持，并获得了帕金森病英国组织（Parkinson's UK，项目编号K-1706）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 移液器吸头Sarstedt70.762或同等产品
1.5 mL 微量离心管Sarstedt72.690.001或同等产品
10 mL 移液器吸头 Sarstedt86.1254.025 或同等产品
10 μL 吸头Sarstedt70.113或同等产品
15 mL 离心管 Cellstar188 271或同等产品
200 μL 吸头Sarstedt70.760.002或同等产品
25 mL 移液器吸头 Sarstedt86.1685.001或同等产品
50 mL 离心管 Cellstar227 261或同等产品
BD Vacutainer Hemogard 封口塑料 K2-EDTA 管BD BD 367525或同等产品
Beckman Coulter Allegra X-15R 离心机贝克曼或配备适用于15 mL和50 mL Falcon管、转速为1000–1200 × g的水平转子离心机
II级生物安全柜
cOmplete（不含EDTA）蛋白酶抑制剂混合物罗氏11836170001
DIFP（二异丙基氟磷酸酯） SigmaD0879使用异丙醇配制 0.5 M 储存液，并采取特殊预防措施 
二甲基亚砜 Sigma6250
干冰或液氮
杜氏磷酸盐缓冲液 ThermoFisher14190094或同等产品
Easy 50 EasySep 磁力架 干细胞18002用于放置1个50 ml离心管
EasySep Direct 人中性粒细胞分离试剂盒 干细胞19666这包含称为的溶液 “分离混合液” 和 “RapidSpheres 磁珠
EGTASigmaE3889
Eppendorf centrifuge 5417R 离心机Eppendorf
喷雾瓶中的乙醇
乙二胺四乙酸 SigmaE6758
冰
异丙醇（无水级） Sigma278475
裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，1%（v/v）Triton X-100，1 mM EGTA，1 mM Na3VO4，50 mM NaF，10 mM） β-甘油磷酸盐，5 mM 焦磷酸钠，0.27 M 蔗糖，0.1% (v/v) β-巯基乙醇，1× cOmplete（无EDTA）蛋白酶抑制剂混合物（Roche），1 μg/ml 微囊藻毒素-LR，0.5 mM 二异丙基氟磷酸酯（DIFP）。 或者，可使用不含微囊藻毒素-LR和DIFP的裂解缓冲液，分装后冻存，试剂可从MRC-PPU试剂库获取（http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/）
默克LRRK2抑制剂II（MLi-2）默克438194-10MG或同等效力的（强效且选择性LRRK2抑制剂）
微囊藻毒素-LREnzo Life SciencesALX-350-012-M0011 mg/ml 储存液，溶于DMSO，-80 oC保存。 
Na₃VO₄Aldrich450243
NaFSigmaS7920
Odyssey CLx 扫描式 Western 印迹成像系统奥德赛
永久性记号笔
个人防护装备
RPMI 1640培养基 ThermoFisher21875034或同等产品
焦磷酸钠SigmaS22
蔗糖SigmaS0389
β-甘油磷酸盐Sigma50020
β-巯基乙醇SigmaM3148
<强>建议用于蛋白质印迹的抗体
抗RAB10（磷酸化T73）抗体 [MJF-R21]abcamab230261
抗-α-tubulin细胞信号传导技术5174以1:2000稀释比例使用
山羊抗小鼠IRDye 680LTLI-COR926-68020以1:10,000稀释比例使用
山羊抗小鼠IRDye 800CWLI-COR926-32210以1:10,000稀释度使用
IRDye 800CW 标记的山羊抗兔抗体LI-COR926-32211以1:10,000稀释度使用
MJFF-total Rab10 小鼠抗体由 nanoTools (nanotools.de) 生成不适用*2处使用 μg/ml 终浓度；* 由 nanoTools（www.nanotools.de）[11] 开发的 MJFF-total Rab10 抗体将于 2018 年由迈克尔·J·福克斯基金会进行商业化
小鼠抗LRRK2 C端抗体Antibodies Incorporated 75-2531 处使用 μg/ml 终浓度
pS935-LRRK2MRC PPU 试剂与服务UDD21 处使用 μg/ml 终浓度

参考文献

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  1. Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
  2. Fell, M. J., et al.

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标签

DIFP MLi 2 Rab10 Thr73

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