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方法文章

利用微阵列技术探究肿瘤微环境对细胞表型的影响

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DOI：

10.3791/58957

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2019年5月21日

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1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

本文内容

摘要

本文所述方法的目的是展示如何制备微环境微阵列（MEMA），并利用其研究数千种简单组合微环境对培养细胞表型的影响。

摘要

理解微环境对细胞表型的影响是一个难题，因为在体内微环境中存在可溶性生长因子和基质相关蛋白的复杂混合物。此外，目前常用的体外微环境建模试剂通常依赖成分复杂且未完全明确的蛋白质混合物，且存在批次间差异的问题。微环境微阵列（MEMA）平台能够在单次实验中评估数千种简单的微环境蛋白组合对细胞表型的影响。MEMA在孔板中制备，可在含有阵列化细胞外基质（ECM）蛋白的不同孔中分别加入单独的配体。每种可溶性配体与打印的ECM组合形成独特的微环境组合。一次典型的MEMA实验可在单次检测中使细胞暴露于超过2,500种不同的组合微环境中。以乳腺癌细胞系MCF7作为测试案例，在MEMA平台上进行培养。对该实验的分析鉴定出能够促进或抑制这些细胞生长与增殖的多种因子。MEMA平台具有高度灵活性，可拓展应用于癌症研究以外的其他生物学问题。

引言

在塑料表面进行二维（2D）单层培养癌细胞系，仍是癌症研究人员的主要实验手段之一。然而，微环境对细胞表型的影响正日益受到重视。在癌症中，肿瘤微环境已被证实可影响多种细胞行为，包括生长、存活、侵袭以及对治疗的反应1,2。传统的单层细胞培养通常缺乏微环境的影响，这促使了更为复杂的三维（3D）细胞培养检测方法的发展，其中包括 commercially available purified basement membrane extracts（商品化的纯化基底膜提取物）。然而，这些纯化基质通常使用复杂，并存在批次间差异3和成分复杂3等技术问题。因此，很难将特定蛋白质的功能归因于其对细胞表型的潜在影响3。

为解决这些局限性，我们开发了微环境微阵列（microenvironment microarray, MEMA）技术，该技术将微环境简化为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）与可溶性生长因子蛋白的简单组合4,5。MEMA 平台能够识别影响细胞行为的关键微环境因子。通过采用阵列形式，可在单次实验中检测数千种微环境因子的组合。本文所述的 MEMA 检测了约 2,500 种不同且独特的微环境条件。将 ECM 蛋白点样至孔板中形成细胞生长垫，用于培养细胞。向各个孔中加入可溶性配体，从而在每个不同的位点上形成独特的组合微环境（ECM + 配体），使细胞暴露于其中。细胞培养数天后，进行固定、染色和成像，以评估特定微环境组合对细胞表型的影响。由于微环境为简单的组合形式，因此可直接识别驱动细胞发生显著表型变化的蛋白质。MEMA 已被成功用于鉴定影响多种细胞表型的因子，包括调控细胞命运决定及治疗反应的因子4,5,6,7。这些响应可在简单的二维实验中进行验证，随后可在更充分模拟肿瘤微环境复杂性的条件下进一步评估。只要存在可靠的表型生物标志物，MEMA 平台即可高度适配于多种细胞类型和检测终点。

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方案

注意：整个 MEMA 流程的概述（包括预计时间）如图1所示的流程图中所示。本方案详细描述了在8孔板中制备 MEMA 的方法。该方案可调整用于其他孔板或载玻片。

1. 蛋白质、稀释液和染色缓冲液的制备

  1. 将细胞外基质（ECMs）、配体和细胞因子的小瓶平衡至室温（RT），并短暂离心。根据产品数据表中的说明，加入适当体积的相应室温缓冲液。遵循制造商关于储存浓度的建议。
    注意： 配体和细胞外基质的完整列表及其储存浓度和终浓度见表1和表2。配体和细胞外基质通常使用制造商推荐范围内能够诱导标准2天 培养实验中产生生物学效应的最高浓度。操作蛋白质时应轻柔，并在层流生物安全柜中进行，以避免污染。
  2. 在室温下轻轻摇动孵育小瓶1小时。切勿涡旋蛋白质，以免引起变性。
  3. 为长期储存分装蛋白质，确保每份均为一次性使用，以避免因反复冻融循环导致的降解。除非另有说明，冻干蛋白质应储存于-80 °C，直至使用。注意收集所有元数据以供将来参考，包括：(i) 蛋白质名称，(ii) 制备日期，(iii) 批号/批次号，(iv) 供应商，(v) 目录编号，(vi) 浓度，(vii) 体积，以及 (viii) 制备者。
  4. 制备含20% (v/v) 甘油、10 mM EDTA、200 mM Tris-HCl（pH 7.2）的稀释缓冲液，并过滤除菌。保持该缓冲液无菌，并在室温下储存。
  5. 制备染色缓冲液，成分为磷酸盐缓冲液（PBS）中含2% (w/v) BSA、1 mM MgCl2 和 0.02% NaN3。过滤后于4 °C储存。

2. 细胞外基质来源板的制备

  1. 取出需打印的细胞外基质（ECM）蛋白分装样品，置于冰上解冻。记录所有批号以用于元数据追踪。
  2. 轻轻弹动已解冻的蛋白管，确保充分重悬，随后在离心机中离心沉淀。
  3. 配制用于液体处理机器人的ECM打印混合物（EPM）及荧光定位标记，该机器人将用于制备随机化的384孔源板。
    注意：     384孔源板将由接触式点样阵列打印机用于在8孔板中生成打印阵列。
    1. 为每种EPM及定位标记分别标记1.5 mL微量离心管。
    2. 通过将125 µL稀释缓冲液（见步骤1.4）与适量ECM蛋白原液混合，并用PBS补足至总体积250 µL，配制每种EPM。每种EPM管中的终浓度为1x ECM蛋白、5 mM EDTA、10%甘油和100 mM Tris。
    3. 按照生产商指定的缓冲液溶解荧光定位标记，并将250 µL转移至已标记的定位标记管中。

3. 使用液体处理仪制备源板

  1. 设计一个384孔板布局，随机化细胞外基质（ECM）的位置，并优化以适配所用阵列打印机的针头。设计定位标记（fiducial）的位置，使其打印在每孔的第1行第1列位置，以辅助阵列方向定位。
    注意：每种ECM使用14−15个重复，以确保数据的可靠性。额外增加胶原蛋白或其他能产生强附着效果的ECM的重复数，用于评估结合的均匀性。根据感兴趣的ECM种类数量，布局可能需要使用多个384孔板。
  2. 将EPM管转移至液体处理仪中，并通过冷却管架或在低温室内使用液体处理机器人，保持管内温度为4 °C。
  3. 使用液体处理仪的软件运行程序，将每种EPM和定位标记各15 µL转移至384孔源板中预先指定的孔位。
  4. 向所有未使用的孔中加入PBS，以提高湿度，防止打印过程中样品干燥。
    注意：参见图2，了解一个优化用于4×7针头的384孔源板设置示例，其中包含I型胶原区块和PBS。
  5. 密封板子，并在4 °C保存，直至准备进行打印。

4. 使用阵列打印机器人打印 MEMA

注意：本方案的以下部分详细描述了MEMA的制备及其用于研究不同微环境蛋白对MCF7细胞生长和增殖影响的方法。然而，该方案可轻松调整，以使用不同的配体、细胞外基质（ECM）和细胞，从而研究其他细胞系及感兴趣的实验终点。

  1. 使用接触式点样打印机，将EPM和定位标记点印制到8孔板中。每种ECM条件需打印多个重复，以确保可重复性。
    注意：    也可使用其他板型或载玻片进行打印，但可能需要优化缓冲液以获得最佳的点样形态。
    1. 使用直径为350 µm的点样针，以4 × 7的打印头排列方式，为MEMA打印ECM。在8孔板中以20列 × 35行的格式打印微阵列，共约700个点。虽然在这些板中可打印更大的阵列，但会增加细胞结合和染色过程中的边缘效应。
  2. 打印完成后，将板置于干燥器中，至少保存3天后再使用。

5. 配体处理板的制备

  1. 设计一个96孔板布局，包括感兴趣的配体。为了便于同时处理多个MEMA板，请设计该板的孔间距，使得可以使用带有4个间隔吸头的多通道移液器在8孔MEMA板与96孔板的孔之间转移液体。
    注意：在本方案中，使用了表2中列出的全部配体。
  2. 将配体置于冰上解冻。轻轻弹动并短暂离心每根管子。
  3. 使用生产商推荐的缓冲液（通常为PBS）将配体稀释至200倍工作浓度。
  4. 将每种200倍浓度的配体储备液各取10 µL，加入96孔板中对应的孔内。
  5. 密封后于-20 °C保存。
    注意：应批量制备配体处理板，并记录所有元数据以供后续分析。

6. 在 MEMA 上培养细胞

  1. 用每孔2 mL含1%抗污染封闭剂（材料表）的非污染性封闭缓冲液，在去离子水（ddH2O）中封闭MEMA 20分钟。
  2. 吸除封闭缓冲液，并用PBS洗涤孔三次。为防止干燥，最后一次洗涤后在孔中保留PBS，直至准备进行细胞接种。
    注意：在MEMA上进行细胞培养步骤时，由两名实验人员协同操作极为有利。一名实验人员负责吸液操作，另一名负责加液操作。建议使用通道间距与8孔板匹配的1 mL多通道移液器进行加样，使用带有两个巴斯德吸管的Y型分流器同时吸取多个孔中的液体。
  3. 每孔接种2 × 105个MCF7细胞，接种体积为2 mL含10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
    注意：在正式开展完整的MEMA实验前，应先进行细胞滴定实验，以优化细胞接种数量，确保在目标实验周期结束时，MEMA斑点上的细胞数量较高但未达到汇合状态。
  4. 细胞贴壁2−18小时后，吸除培养基，更换为2 mL低生长培养基（含0.1% FBS的DMEM）。
    注意：此时可采用低血清（例如0.1% FBS）或去除生长因子的培养条件，以单独评估特定配体的刺激作用。
  5. 将配体处理板置于冰上解冻。解冻后以200 × g 离心1分钟。
  6. 从培养板的每个孔中转移200 µL培养基至处理板中对应的孔。上下吹打混匀配体与培养基，再将混合液转移回MEMA板中对应的孔。
  7. 手动轻轻摇动MEMA板，随后将其放回培养箱。在37 °C、5% CO2条件下，继续在配体/细胞外基质（ECM）组合存在下培养至实验所需时长。
    注意：典型的MEMA实验持续72小时；更长时间的实验可能需要更换培养基并重新添加配体。
  8. 在71小时时，向MEMA各孔加入100倍稀释的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），使终浓度为10 µM。在实验条件下（37 °C、5% CO2）继续孵育1小时。
    注意：此时也可使用其他活细胞处理方法。

7. 固定和染色 MEMA

  1. 72 小时后以及任何活细胞处理结束后，吸去孔内液体。每孔加入 2 mL 2% 多聚甲醛（PFA）固定 MEMA，室温孵育 15 分钟。
  2. 吸去 PFA。每孔加入 2 mL 0.1% 非离子型表面活性剂 ，室温孵育 15 分钟以进行透化处理。
  3. 吸去非离子型表面活性剂，每孔用 2 mL PBS 洗涤一次，吸去 PBS 后，再用含 0.05% 吐温 20（PBS-T）的 PBS 洗涤一次，每孔 2 mL。
    注意： MEMA 表面具有疏水性，若在染色和抗体孵育前未使用 PBS-T 洗涤，孵育过程中孔内将产生空隙，导致染色伪影。
  4. 吸去 PBS-T。加入 EdU 检测试剂。室温避光振荡孵育 1 小时。孵育 1 小时后，使用随试剂盒提供的商品化淬灭缓冲液终止反应。
    注意： 为降低成本，EdU 检测及染色/抗体步骤可每孔使用 1.5 mL 试剂。
  5. 吸去淬灭缓冲液，在加入染料或抗体孵育前，用 PBS-T 洗涤一次。
  6. 将 MEMA 孔板与组蛋白 H3K9me3 抗体（1:1,000）和 fibrillarin 抗体（1:400）在染色缓冲液（含 2% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）、1 mM MgCl2 和 0.02% NaN3）中 4 °C 过夜孵育。
    注意： 在将抗体用于完整的 MEMA 实验前，应先进行抗体滴定实验以确定最佳浓度。
  7. 一抗或染料孵育结束后，用 PBS 洗涤两次，每次每孔 2 mL，再用 PBS-T 洗涤一次。
  8. 加入二抗（驴抗小鼠 IgG 和驴抗兔 IgG，均为 1:300）以及 0.5 µg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。室温避光孵育 1 小时。
  9. 用 PBS 洗涤两次，每次每孔 2 mL，最后一次洗涤后保留 2 mL PBS。
  10. 立即进行成像，或在 4 °C 避光条件下将染色后的 MEMA 保存于 PBS 中以备后续成像使用。

8. MEMA的成像

  1. 使用配备适当荧光检测通道的自动化成像系统对 MEMA 进行成像。
  2. 将获得的图像数据输出至图像管理系统，利用 CellProfiler8 对细胞进行分割并计算荧光强度水平。

9. 数据分析

注意：数据分析包括对由 CellProfiler 获得的原始数据进行归一化、变异校正和汇总。在此示例中，使用 R 环境配合自定义代码完成所有步骤。然而，也可使用任何其他统计环境或软件程序执行等效操作。用于 R 环境分析的开源自定义代码示例可访问：https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486。

  1. 对分割的图像数据进行预处理和标准化。
  2. 利用DAPI染色的细胞核确定每个点中的细胞数量。
  3. 自动设门EdU荧光强度，将细胞标记为EdU+。通过每个点中EdU+细胞的比例来评估增殖情况。
  4. 在点水平上对细胞质染色和细胞核形态学测量指标进行中位数汇总。
  5. 对数据执行去除不必要变异（RUV）标准化，以提高数据质量9。
    注意：该方法针对每种强度和形态学信号独立应用，以矩阵形式处理，其中行代表阵列行，列代表点，具体方法如前所述9。
  6. 对RUV标准化后的残差应用双变量loess标准化，以阵列行和阵列列为独立变量，校正空间位置或强度相关效应。
  7. 完成标准化后，对每种微环境条件下重复样本的测量值进行中位数汇总，用于报告和进一步分析。

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结果

为了简化微环境对细胞生长和增殖的影响，并鉴定促进或抑制细胞生长和增殖的条件，按照本实验方案所述，将乳腺癌细胞系 MCF7 接种于一组八联 8 孔 MEMA 上。该检测使细胞暴露于 48 种不同的细胞外基质（ECM）和 57 种不同的配体，共组合成 2736 种微环境条件。细胞培养 71 小时后，加入 EdU 进行脉冲标记，随后固定、透化，并用 DAPI、EdU 检测试剂、抗 fibrillin 抗体和抗 H3K9me3 抗体进行染色。利用高内涵显微镜对细胞成像。图像上传至 Omero 服务器10，使用 CellProfiler8 进行图像分割，并在 R9 中进行标准化和分析。下述结果主要聚焦于 DAPI 和 EdU 信号。

MEMA 的图像分析平台可产生一些与流式细胞术方法相似的结果，例如基于 DAPI 荧光强度和面积，显示经特定配体处理后细胞中 2N 和 4N 亚群的 DNA 含量图谱（图 3

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讨论

“"维度”和微环境背景的重要性一直是推动体外培养系统发展的关键因素，该系统被用作通过癌细胞与微环境相互作用来表征癌细胞的工具11；同时，体外培养系统模拟体内环境的能力，也是推动人们不断改进这些培养系统的动力。然而，体外系统之所以仍然是癌症研究的重要工具，正是因为它能够将复杂的体内情况简化为一个简化的模型12。

尽管二维系统可以包含细胞外基质（ECM）和配体，但传统上其通量能力有限，难以对大量组合性扰动因子进行系统性研究。市面上常用的商业 Basement Membrane Extracts 虽支持三维培养，但其蛋白质组成缺乏明确的定义。这些商业提取物通常存在成分未完全明确的问题，可能干扰实验分析，并导致显著的批间差异3,13。MEMA 平台克服了这些障碍，能够研究特定且明确定义的内源性因子调控下，细胞表型变化、代谢活性、分化状态以及细胞生长与增殖差异。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本手稿中的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）共同基金细胞信号网络文库（LINCS）U54资助项目HG008100（J.W.G.、L.M.H.和J.E.K）以及国家癌症研究所（NCI）癌症系统生物学联盟（CSBC）U54 CA209988资助项目（J.W.G.、L.M.H.和J.E.K）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aushon 2470Aushon BioSystems本方案中使用的阵列机器人系统
Nikon HCANikon基于Nikon Eclipse Ti倒置显微镜设计的高内涵成像系统
BioTek Precision XS液体处理仪BioTek本方案中使用的液体处理机器人
Trizma盐酸缓冲液SigmaT2069
EDTAInvitrogen15575-038
甘油SigmaG5516
吐温-100SigmaT9284
吐温-20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384孔微阵列板，圆柱形孔Thermo Fisherab1055
Nunc 8孔培养皿Thermo Fisher267062
16%多聚甲醛溶液Electron Microscopy Science15710
牛血清白蛋白FisherBP-1600
叠氮化钠SigmaS2002
Cell MaskMolecular ProbesH32713
Click-iTEdU Alexa FluorMolecular ProbesC10357
DAPIPromo KinePK-CA70740043
ALCAMR & D Systems656-ALECM
钙黏蛋白-20 (CDH20)R & D Systems5604-CAECM
钙黏蛋白-6 (CDH6)R & D Systems2715-CAECM
钙黏蛋白-8 (CDH8)R & D Systems188-C8ECM
CD44R & D Systems3660-CDECM
CEACAM6R & D Systems3934-CMECM
I型胶原蛋白Cultrex3442-050-01ECM
II型胶原蛋白MilliporeCC052ECM
III型胶原蛋白MilliporeCC054ECM
IV型胶原蛋白SigmaC5533ECM
V型胶原蛋白MilliporeCC077ECM
COL23A1R & D Systems4165-CLECM
桥粒芯糖蛋白-2R & D Systems947-DMECM
E-钙黏蛋白 (CDH1)R & D Systems648-ECECM
ECM1R & D Systems3937-ECECM
纤连蛋白R & D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR & D SystemsGLR002ECM
HyA-50KR & D SystemsGLR001ECM
ICAM-1R & D Systems720-ICECM
层粘连蛋白SigmaL6274ECM
层粘连蛋白-5Abcamab42326ECM
发光蛋白R & D Systems2846-LUECM
M-钙黏蛋白 (CDH15)R & D Systems4096-MCECM
网硬蛋白-1R & D Systems2570-NDECM
骨粘连蛋白/OSADR & D Systems2884-ADECM
骨桥蛋白 (SPP)R & D Systems1433-OPECM
P-钙黏蛋白 (CDH3)R & D Systems861-PCECM
PECAM1R & D SystemsADP6ECM
腱生蛋白-CR & D Systems3358-TCECM
VCAM1R & D SystemsADP5ECM
玻璃粘连蛋白R & D Systems2308-VNECM
双糖链蛋白聚糖R & D Systems2667-CMECM
核心蛋白聚糖R & D Systems143-DEECM
骨膜蛋白R & D Systems3548-F2ECM
SPARC/骨粘连蛋白R & D Systems941-SPECM
血小板反应蛋白-1/2R & D Systems3074-THECM
脑聚糖R & D Systems4009-BCECM
弹性蛋白BioMatrix5052ECM
原纤维蛋白Lynn Sakai 实验室 OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025配体
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005配体
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010配体
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200配体
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OS配体
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020配体
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005配体
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010配体
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050配体
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005配体
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010配体
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286配体
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01M配体
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UG配体
FGF6RnD_Systems_Own238-F6配体
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005配体
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025配体
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010配体
WNT10AGenemed_Own90009配体
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050配体
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100配体
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010配体
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010配体
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010配体
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020配体
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050配体
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050配体
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010配体
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050配体
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010配体
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005配体
肿瘤坏死因子RnD_Systems_Own210-TA-020配体
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025配体
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010配体
PDGFABRnD_Systems_Own222-AB配体
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100配体
JAG1RnD_Systems_Own1277-JG-050配体
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010配体
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010配体
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010配体
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010配体
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010配体
NRG1RnD_Systems_Own378-SM配体
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025配体
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025配体
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010配体

参考文献

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