本文所述方法的目的是展示如何制备微环境微阵列（MEMA），并利用其研究数千种简单组合微环境对培养细胞表型的影响。
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本文内容
摘要
摘要
理解微环境对细胞表型的影响是一个难题，因为在体内微环境中存在可溶性生长因子和基质相关蛋白的复杂混合物。此外，目前常用的体外微环境建模试剂通常依赖成分复杂且未完全明确的蛋白质混合物，且存在批次间差异的问题。微环境微阵列（MEMA）平台能够在单次实验中评估数千种简单的微环境蛋白组合对细胞表型的影响。MEMA在孔板中制备，可在含有阵列化细胞外基质（ECM）蛋白的不同孔中分别加入单独的配体。每种可溶性配体与打印的ECM组合形成独特的微环境组合。一次典型的MEMA实验可在单次检测中使细胞暴露于超过2,500种不同的组合微环境中。以乳腺癌细胞系MCF7作为测试案例，在MEMA平台上进行培养。对该实验的分析鉴定出能够促进或抑制这些细胞生长与增殖的多种因子。MEMA平台具有高度灵活性，可拓展应用于癌症研究以外的其他生物学问题。
引言
在塑料表面进行二维（2D）单层培养癌细胞系，仍是癌症研究人员的主要实验手段之一。然而，微环境对细胞表型的影响正日益受到重视。在癌症中，肿瘤微环境已被证实可影响多种细胞行为，包括生长、存活、侵袭以及对治疗的反应1,2。传统的单层细胞培养通常缺乏微环境的影响，这促使了更为复杂的三维（3D）细胞培养检测方法的发展，其中包括 commercially available purified basement membrane extracts（商品化的纯化基底膜提取物）。然而，这些纯化基质通常使用复杂，并存在批次间差异3和成分复杂3等技术问题。因此，很难将特定蛋白质的功能归因于其对细胞表型的潜在影响3。
为解决这些局限性，我们开发了微环境微阵列（microenvironment microarray, MEMA）技术，该技术将微环境简化为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）与可溶性生长因子蛋白的简单组合4,5。MEMA 平台能够识别影响细胞行为的关键微环境因子。通过采用阵列形式，可在单....
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方案
注意：整个 MEMA 流程的概述（包括预计时间）如图1所示的流程图中所示。本方案详细描述了在8孔板中制备 MEMA 的方法。该方案可调整用于其他孔板或载玻片。
1. 蛋白质、稀释液和染色缓冲液的制备
- 将细胞外基质（ECMs）、配体和细胞因子的小瓶平衡至室温（RT），并短暂离心。根据产品数据表中的说明，加入适当体积的相应室温缓冲液。遵循制造商关于储存浓度的建议。
注意： 配体和细胞外基质的完整列表及其储存浓度和终浓度见表1和表2。配体和细胞外基质通常使用制造商推荐范围内能够诱导标准2天 培养实验中产生生物学效应的最高浓度。操作蛋白质时应轻柔，并在层流生物安全柜中进行，以避免污染。 - 在室温下轻轻摇动孵育小瓶1小时。切勿涡旋蛋白质，以免引起变性。
- 为长期储存分装蛋白质，确保每份均为一次性使用，以避免因反复冻融循环导致的降解。除非另有说明，冻干蛋白质应储存于-80 °C，直至使用。注意收集所有元数据以供将来参考，包括：(i) 蛋白质名称，(ii) 制备日期，(iii) 批号/批次号，(iv) 供应商，(v) 目录编号，(vi) 浓度，(vii) 体积，以及 (viii) 制备者。
- 制备....
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结果
为了简化微环境对细胞生长和增殖的影响，并鉴定促进或抑制细胞生长和增殖的条件，按照本实验方案所述，将乳腺癌细胞系 MCF7 接种于一组八联 8 孔 MEMA 上。该检测使细胞暴露于 48 种不同的细胞外基质（ECM）和 57 种不同的配体，共组合成 2736 种微环境条件。细胞培养 71 小时后，加入 EdU 进行脉冲标记，随后固定、透化，并用 DAPI、EdU 检测试剂、抗 fibrillin 抗体和抗 H3K9me3 抗体进行染色。利用高内涵显微镜对细胞成像。图像上传至 Omero 服务器10，使用 CellProfiler8 进行图像分割，并在 R9 中进行标准化和分析。下述结果主要聚焦于 DAPI 和 EdU 信号。
MEMA 的图像分析平台可产生一些与流式细胞术方法相似的结果，例如基于 DAPI 荧光强度和面积，显示经特定配体处理后细胞中 2N 和 4N 亚群的 DNA 含量图谱（图 3
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讨论
“"维度”和微环境背景的重要性一直是推动体外培养系统发展的关键因素，该系统被用作通过癌细胞与微环境相互作用来表征癌细胞的工具11；同时，体外培养系统模拟体内环境的能力，也是推动人们不断改进这些培养系统的动力。然而，体外系统之所以仍然是癌症研究的重要工具，正是因为它能够将复杂的体内情况简化为一个简化的模型12。
尽管二维系统可以包含细胞外基质（ECM）和配体，但传统上其通量能力有限，难以对大量组合性扰动因子进行系统性研究。市面上常用的商业 Basement Membrane Extracts 虽支持三维培养，但其蛋白质组成缺乏明确的定义。这些商业提取物通常存在成分未完全明确的问题，可能干扰实验分析，并导致显著的批间差异3,13。MEMA 平台克服了这些障碍，能够研究特定且明确定义的内源性因子调控下，细胞表型变化、代谢活性、分化状态以及细胞生长与增殖差异。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本手稿中的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）共同基金细胞信号网络文库（LINCS）U54资助项目HG008100（J.W.G.、L.M.H.和J.E.K）以及国家癌症研究所（NCI）癌症系统生物学联盟（CSBC）U54 CA209988资助项目（J.W.G.、L.M.H.和J.E.K）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | 本方案中使用的阵列机器人系统 | |
| Nikon HCA | Nikon | 基于Nikon Eclipse Ti倒置显微镜设计的高内涵成像系统 | |
| BioTek Precision XS液体处理仪 | BioTek | 本方案中使用的液体处理机器人 | |
| Trizma盐酸缓冲液 | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 吐温-100 | Sigma | T9284 | |
| 吐温-20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384孔微阵列板，圆柱形孔 | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8孔培养皿 | Thermo Fisher | 267062 | |
| 16%多聚甲醛溶液 | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher | BP-1600 | |
| 叠氮化钠 | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| 钙黏蛋白-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| 钙黏蛋白-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| 钙黏蛋白-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| I型胶原蛋白 | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| II型胶原蛋白 | Millipore | CC052 | ECM |
| III型胶原蛋白 | Millipore | CC054 | ECM |
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533 | ECM |
| V型胶原蛋白 | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| 桥粒芯糖蛋白-2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-钙黏蛋白 (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| 纤连蛋白 | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L6274 | ECM |
| 层粘连蛋白-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| 发光蛋白 | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-钙黏蛋白 (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| 网硬蛋白-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| 骨粘连蛋白/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| 骨桥蛋白 (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-钙黏蛋白 (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| 腱生蛋白-C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| 玻璃粘连蛋白 | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| 双糖链蛋白聚糖 | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| 核心蛋白聚糖 | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| 骨膜蛋白 | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/骨粘连蛋白 | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| 血小板反应蛋白-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| 脑聚糖 | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| 弹性蛋白 | BioMatrix | 5052 | ECM |
| 原纤维蛋白 | Lynn Sakai 实验室 OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | 配体 |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | 配体 |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | 配体 |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | 配体 |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | 配体 |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | 配体 |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | 配体 |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | 配体 |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | 配体 |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | 配体 |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | 配体 |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | 配体 |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | 配体 |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | 配体 |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | 配体 |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | 配体 |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | 配体 |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | 配体 |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | 配体 |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | 配体 |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | 配体 |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | 配体 |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | 配体 |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | 配体 |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | 配体 |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | 配体 |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | 配体 |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | 配体 |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | 配体 |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | 配体 |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | 配体 |
| 肿瘤坏死因子 | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | 配体 |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | 配体 |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | 配体 |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | 配体 |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | 配体 |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | 配体 |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | 配体 |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | 配体 |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | 配体 |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | 配体 |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | 配体 |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | 配体 |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | 配体 |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | 配体 |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | 配体 |
参考文献
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Med....
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