方法文章

利用微阵列研究微环境对癌症细胞表型的影响

DOI：

10.3791/58957

⸱

2019年5月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, 2Quantitative Imaging Systems LLC

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的方法的目的是展示如何制造微环境微阵列 (MEMA) 并用于询问数千种简单组合微环境对培养细胞表型的影响。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于可溶性生长因子和基质相关蛋白在体内微环境中的混合混合,理解微环境对细胞表型的影响是一个难题。此外,用于体外微环境建模的现成试剂通常利用未完全定义的蛋白质的复杂混合物,并遭受批次到批次的变异。微环境微阵列 (MEMA) 平台允许评估数千种微环境蛋白的简单组合,以在单个测定中评估其对细胞表型的影响。MEMEA在井板中制备,允许添加单独的配体来分离含有阵列细胞外基质(ECM)蛋白质的孔。可溶性配体与每个印刷的 ECM 的组合形成了独特的组合。典型的 MEMA 测定包含超过 2,500 个独特的组合微环境,细胞在单个检测中暴露。作为测试案例,乳腺癌细胞系MCF7被镀在MEMA平台上。分析这种测定确定了增强和抑制这些细胞的生长和增殖的因素。MEMA 平台非常灵活,可扩展用于癌症研究以外的其他生物学问题。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在二维(2D)单层塑料上培养癌细胞系仍然是癌症研究人员的主要工作之一。然而,微环境因其影响细胞表型的能力而日益得到认可。在癌症中,肿瘤微环境已知影响多种细胞行为,包括生长、存活、入侵和对治疗1、2的反应。传统的单层细胞培养通常缺乏微环境影响,这导致开发更复杂的三维(3D)检测来生长细胞,包括市售的纯化基底膜提取物。然而,这些纯化的基质通常使用复杂,并遭受技术问题,如批次变异性3和复杂组合物3。因此,很难将功能分配给可能影响细胞表型3的特定蛋白质。

为了弥补这些限制,我们开发了微环境微阵列 (MEMA) 技术,该技术将微环境简化为细胞外基质 (ECM) 和可溶性生长因子蛋白4、5 的简单组合.MEMA 平台能够识别影响细胞行为的显性微环境因素。通过使用数组格式,可以在单个实验中测定数千个微环境因子的组合。此处描述的 MEMA 询问了 2,500 种不同的独特微环境条件。印在井板的ECM蛋白形成生长垫,细胞可以赖以培养。可溶性配体被添加到单个孔中,在细胞暴露的每个不同点上创建独特的组合微环境(ECM + 配体)。细胞被培养数天,然后固定,染色和图像,以评估细胞表型作为暴露于这些特定的微环境组合的结果。由于微环境是简单的组合,因此很容易识别驱动细胞中主要型型变化的蛋白质。MEMEA已经成功地用于识别影响多细胞表型的因素,包括那些驱动细胞命运决定和对治疗4、5、6、7的反应的因素。这些反应可以在简单的2D实验中验证,然后可以在更全面地概括肿瘤微环境复杂性的条件下进行评估。MEMA 平台高度适应各种细胞类型和端点,前提是提供良好的型型生物标志物。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:图 1所示的流程图概述了整个 MEMA 流程(包括估计时间) 。该协议详细介绍了 8 孔板中 MEMEA 的制造。该协议可适用于其他板或幻灯片。

1. 蛋白质、稀释剂和染色缓冲液的制备

  1. 将 EMS、配体和细胞因子小瓶与室温 (RT) 和短暂离心器进行平衡。如产品数据表所示,添加适当的 RT 缓冲区的适当体积。按照制造商关于库存集中的建议进行操作。
    注:表1及表2列有配体及EECM及其储存及最终浓度的完整清单。配体和 EEC 通常以制造商建议的最高浓度使用,在标准 2 天培养性检测中产生生物效应。在层流下轻轻处理蛋白质,在生物安全柜中处理,以避免污染。
  2. 在RT下用柔和的摇动孵育小瓶1小时。不要涡旋蛋白质,因为这可能导致它们变性。
  3. 用于长期存储的等分蛋白,以便所有等分只用于避免重复的冻结/解冻循环降解。将冻干蛋白储存在-80°C(除非另有说明),直到需要为止。注意收集所有元数据以供将来参考,例如:(一) 蛋白质名称、(ii) 准备日期、(iii) 批号/批号、(iv) 供应商、(v) 目录号、(vi) 浓度、(vii) 体积和(八) 准备者。
  4. 准备含有20%(v/v)甘油、10mM EDTA、200 mM Tris-HCl、pH 7.2和过滤器消毒的稀释液缓冲液。保持此缓冲液无菌并储存在 RT 处。
  5. 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备含有2%(w/v)BSA、1 mM MgCl2和0.02%NaN3的染色缓冲液。过滤并储存在4°C。

2. 准备 ECM 源板

  1. 去除要打印的ECM蛋白的并键库存,并在冰上解冻。记录所有批号以进行元数据跟踪。
  2. 轻轻轻拂解冻蛋白质的管,以确保在离心机中正确重新悬浮和旋转。
  3. 使 ECM 打印混合物 (EEP) 和荧光基准由液体处理机器人使用,以创建随机 384 孔源板。
    注:    触摸引脚阵列打印机将使用 384 孔源板创建 8 孔板中的打印阵列。
    1. 为每个 EPM 和基准标出 1.5 mL 微离心管。
    2. 将 125 μL 稀释剂缓冲液(参见步骤 1.4)与适当的 ECM 库存量相结合,将混合液的总体积与 PBS 结合至 250 μL,从而制备每个 EPM。每个 EPM 管的最终浓度为 1x ECM 蛋白、5 mM EDTA、10% 甘油和 100 mM Tris。
    3. 在制造商指定的适当缓冲液中溶解荧光基准,并将其转移到标有基准管的 250 μL。

3. 使用液体处理程序创建源板

  1. 设计 384 孔板布局,随机化 EVM 的位置,并针对所使用的阵列打印机销头进行了优化。设计基准的位置,使其打印在每口井的第 1 行第 1 列位置中,以帮助阵列方向。
    注:每个 ECM 总共使用 14-15 个复制来确保可靠的数据。包括胶原蛋白或其他ECM的附加复制,产生强大的附件,以评估结合的均匀性。布局可能需要使用多个 384 孔板,具体取决于感兴趣的 EVM 数量。
  2. 将 EPM 管转移到液体处理器上,使用冷却管架或使用位于冷室的液体处理机器人将管保持在 4°C。
  3. 使用液体处理程序的软件,运行一个程序,将每个 EPM 的 15 μL 和基准转移到 384 孔源板内的预先指定的井。
  4. 将 PBS 移入任何未使用的井中,以增加湿度,防止在打印过程中干燥。
    注:参见图2,了解针对 4 x 7 引脚头进行优化且包括胶原蛋白 I 块和 PBS 的 384 孔源板集的示例。
  5. 密封板,并保持在 4°C,直到准备打印。

4. 使用阵列打印机器人打印 MEMA

注:协议的第以下部分特别描述了MEMA的制备和使用,以研究不同微环境蛋白对MCF7细胞生长和增殖的影响。然而,该协议可以很容易地适应使用不同的配体、EVM和细胞来研究其他细胞系和感兴趣的端点。

  1. 使用触摸销打印机将 EVM 和基准点打印到 8 个孔板中。打印每个 ECM 条件的多个副本,以确保可重复性。
    注:    其他印版格式或幻灯片可用于打印,但可能需要优化缓冲器以实现最佳的点形成。
    1. 使用 4 x 7 打印头配置中排列的 350 μm 直径引脚打印 MEMA 的 EVM。将 8 孔板中的数组打印为 20 列,由 35 行打印,总计约 700 个点。这些板中可以有较大的阵列,但附带了在细胞结合和染色中增加边缘效应的权衡。
  2. 打印后,在干燥器中存放印版至少 3 天,否则使用时间将提前。

5. 制作木质处理板

  1. 设计 96 孔板布局,包括感兴趣的配体。为了便于同时处理许多MEMA板,设计这个带间距的板,允许使用带有4个间隔尖端的多通道移液器,在8孔MEMA和96孔板之间的液体转移。
    注:在此协议中,使用了表 2中列出的全套配体。
  2. 在冰上解冻配体。短暂轻拂并旋转每个管。
  3. 使用制造商推荐的缓冲液(通常为 PBS)将配体稀释到 200x 工作库存中。
  4. 将每个 200x 配体股票的移液 10 μL 放入 96 孔板内的相应井中。
  5. 密封并储存板在-20°C。
    注:分批制作配体处理板,捕获所有元数据进行下游分析。

6. 在MEMEA上培育细胞

  1. 在双蒸馏水中(ddH2O)中,用每口2 mL的非结垢阻隔缓冲液(含1%的非污物阻隔剂(材料表))块住MEM2分钟。
  2. 吸气阻隔缓冲液和三重冲洗井与PBS。为了防止干燥,将PBS的最终体积留在井中,直到准备好进行细胞电镀。
    注:在 MEMEA 上为细胞培养步骤提供两个工作台工作人员是非常有帮助的。一个工作台工作人员可以执行吸入步骤,而第二个工作台执行加步。建议使用带间距的 1 mL 多通道移液器,以匹配用于移液的 8 孔板,以及带有两个巴斯德移液器的 Y 分孔器,以便同时吸出多个孔。
  3. 种子 2 x 105 MCF7 细胞每井 2 mL 的 Dulbecco 的改性 Eagle 培养基 (DMEM) 培养基含有 10% 的胎儿牛血清 (FBS)。
    注:在进行完整的MEMA实验之前,执行细胞滴定实验以优化细胞数量,使MEMA点在所需的实验持续时间结束时具有高细胞数(但不汇合)。
  4. 粘附2~18小时后,吸气介质,用2mL的减生长介质(DMEM,0.1%FBS)代替。
    注:减少的血清(例如0.1%FBS)或生长因子耗尽条件可用于此时分离特定配体的刺激作用。
  5. 在冰上解冻配体处理板。离心解冻板在200 x g 1分钟。
  6. 将200μL的介质从培养板中的每个孔转移到处理板中的相应孔。上下移管,将配体体积与介质混合,并将混合物移回MEMA板中的相应孔。
  7. 用手轻轻摇动,将MEMA板返回到孵化器。在37°C和5%CO2下,在配体/ECM组合存在的情况下,在实验期间培养。
    注:典型的MEMA实验运行72小时;较长的实验可能需要更换介质和重新处理配体。
  8. 脉冲MEMA井在71小时与100x 5-ethynyl-2'-脱氧尿氨酸(EdU)的最终浓度为10μM。在实验条件下孵育与EdU在37°C和5%CO2的1小时。
    注:此时也可使用其他活细胞治疗。

7. 修复和染色 MEMA

  1. 经过72小时和任何活细胞治疗,吸气井。在RT处将MEMA固定在2 mL中,每口2%的甲醛(PFA)为15分钟。
  2. 吸气PFA。每口2mL的渗透剂为0.1%非离子表面活性剂,15分钟。
  3. 吸气非离子表面活性剂,每井PBS用2 mL洗涤。吸气PBS。用 0.05% 聚索巴20 (PBS-T) 用 2 mL 的 PBS 清洗。
    注:MEMA 表面是疏水性的,在染色和抗体孵育之前不用 PBS-T 清洗将导致在孵育步骤期间在井中形成空隙,并产生染色伪影。
  4. 吸气 PBS-T.添加 EdU 检测反应试剂。在RT孵育1小时,摇动,免受光线照射。1小时孵育后,用提供的商业淬火缓冲液淬火反应。
    注:EdU 检测和染色/抗体步骤可在每口井 1.5 mL 下执行,以降低成本。
  5. 吸气缓冲液,在用污渍或抗体孵育之前用PBS-T清洗。
  6. 在含有2%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)、1 mM MgCl2和0.02%NaN3在4°C过夜的染色缓冲液中孵育MEMA井,以抑制组蛋白H3K9me3(1:1,000)和纤维素(1:400)。
    注:在一个完整的MEMA集上使用抗体点位之前,先确定最佳浓度。
  7. 原发抗体或染色孵育后,用PBS清洗井2倍,用PBS-T洗净。
  8. 添加二级抗体(驴抗小鼠IgG和驴抗兔子IgG,均为1:300)和0.5微克/mL 4°6°二酰胺2_phenyinole(DAPI)。在黑暗中在RT孵育1小时。
  9. 洗井 2x 每井 PBS 2 mL,将其留在最后 2 mL PBS 中。
  10. 继续成像或存储染色MEMA,以便以后在PBS中以4°C进行成像,防止光线照射。

8. MEMEA成像

  1. 在具有适当荧光检测通道的自动成像系统上成像 MEMA。
  2. 将生成的图像数据输出到图像管理系统。使用细胞探查器8对单元格进行分割并计算强度水平。

9. 数据分析

注:数据分析包括原始CellProfiler派生数据的规范化、变异校正和汇总。在这种情况下,具有自定义代码的 R 环境用于执行所有步骤。但是,可以使用任何统计环境或软件程序来执行等效操作。用于分析的 R 环境的开源自定义代码的示例位于:https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486 。

  1. 预处理和规范化分段图像数据。
  2. 使用 DAPI 染色核确定点细胞计数。
  3. 自动栅极 EdU 强度将单元格标记为 EdU=。使用每个点中的 EdU+细胞比例测量增殖。
  4. 中位数汇总了细胞质污渍和现场水平的核形态测量。
  5. 对数据执行删除不需要的变体 (RUV) 规范化,以提高数据质量9。
    注:此方法作为矩阵独立应用于每个强度和形态信号,数组使用行和点作为前面描述的列。
  6. 使用数组行和数组列作为独立变量对 RUV 规范化残差应用双变量黄土规范化,以校正空间或强度相关效果。
  7. 完成规范化后,中位数将汇总每个微环境条件的复制,以便进行报告和进一步分析。

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结果

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为了简化微环境对细胞生长和增殖的影响,并确定促进或抑制细胞生长和增殖的条件,乳腺癌细胞系MCF7被播种在协议中描述的一组8 8孔MEMA上。这种测定使细胞接触48种不同的EMS和57种不同的配体,共2736个组合微环境条件。在培养71小时后,用EdU脉冲细胞,固定,渗透,并沾染DAPI,EdU检测反应,抗纤维蛋白抗体,抗H3K9me3抗体。细胞在高含量显微镜上成像。图像被上传到一个Omero服务器10,分段使用CellProfiler8,并在R9规范化和分析。下面描述的结果侧重于 DAPI 和 EdU 信号。

MEMA的图像分析平台产生一些类似于流式细胞学方法的结果,例如,基于DAPI,DNA含量图显示使用给定配体治疗的细胞的2N和4N分数(图3A)。强度和面积。这些图提供了促进活性细胞循环的条件的证据,而与G1或G2相中与生长促动细胞对应的透明双...

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讨论

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"维数"和语境的重要性一直是体外培养系统发展的动力,通过它们与微环境的相互作用,以及体外细胞的能力,作为癌细胞表征的工具。模仿体内环境的文化系统是寻求改善这些文化系统的动力。然而,体外系统仍然是癌症研究的重要工具,正是因为它们能够将复杂的体内情况提炼为简化的12型。

虽然 2D 系统可以包括 EVM 和配体,但它们传统上缺乏对宽范围组合式 pertubagen 进行质询的吞吐量能力。流行的商业基底膜提取物允许在3D中培养,但缺乏精心定义的蛋白质面板的来源。商业提取物通常受到不完全定义的成分的影响,这可能混淆分析,并导致大量的批次到批次的变化3,13。MEMA平台克服了这些障碍,允许研究细胞表型的变化,代谢活性,分化状态,以及细胞生长和增殖的变化,因为它们是由特定和定义的内源性调节的因素。

MEMA 平台是一种强大的中...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了NIH网络蜂窝签名共同基金图书馆(LINCS)赠款HG008100(J.W.G.、L.M.H.和J.E.K)的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aushon 2470Aushon BioSystems阵列机器人系统用于方案
尼康 HCA尼康高内涵成像系统 围绕尼康 Eclipse Ti 倒置显微镜设计
BioTek Precision XS 液体处理器BioTek液体处理机器人
用于方案 Trizma 盐酸盐缓冲溶液SigmaT2069
EDTAInvitrogen15575-038
甘油SigmaG5516
Triton X100SigmaT9284
吐温 20SigmaP7949
Kolliphor P338BASF50424591
384 孔微阵列板、圆柱孔Thermo Fisherab1055
Nunc 8井培养皿Thermo Fisher267062
多聚甲醛 16% 溶液电子显微镜科学15710
BSAFisherBP-1600
叠氮化钠SigmaS2002
细胞掩膜探针H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor分子探针C10357
DAPI促销 KinePK-CA70740043
ALCAMR &D Systems656-ALECM
钙粘蛋白-20 （CDH20）R &D Systems5604-CAECM
钙粘蛋白-6 （CDH6）R &D Systems2715-CAECM
钙粘蛋白-8 （CDH8）R &D 系统188-C8ECM
CD44R &D Systems3660-CDECM
CEACAM6研发D Systems3934-CMECM
胶原蛋白 ICultrex3442-050-01
ECM 胶原蛋白 II 型MilliporeCC052ECM
胶原蛋白 III 型MilliporeCC054ECM
胶原蛋白 IV 型SigmaC5533ECM
胶原蛋白 V 型MilliporeCC077ECM
COL23A1R&D Systems4165-CLECM
桥粒核心糖蛋白 2R &D Systems947-DMECM
E-钙粘蛋白 （CDH1）R &D Systems648-ECECM
ECM1研发D Systems3937-ECECM
纤连蛋白R &D Systems1918-FNECM
GAP43Abcamab114188ECM
HyA-500KR &D SystemsGLR002ECM
HyA-50K研发D SystemsGLR001ECM
ICAM-1研发D Systems720-ICECM
层粘连蛋白SigmaL6274ECM
层粘连蛋白-5Abcamab42326ECM
LumicanR &D Systems2846-LUECM
M-CAD （CDH15）R &D Systems4096-MCECM
Nidogen-1研发D Systems2570-NDECM
骨粘附素/OSAD研发D Systems2884-ADECM
骨桥蛋白 （SPP）R &D Systems1433-OPECM
P-钙粘蛋白 （CDH3）R &D Systems861-PCECM
PECAM1研发D SystemsADP6ECM
Tenascin CR &D Systems3358-TCECM
VCAM1研发D SystemsADP5ECM
玻连蛋白R &D Systems2308-VNECM
Biglycan研发D Systems2667-CMECM
核心蛋白聚糖R &D Systems143-DEECM
PeriostinR &D Systems3548-F2ECM
SPARC/骨连接蛋白R &D Systems941-SPECM
血小板反应蛋白-1/2R &D Systems3074-THECM
Brevican研发D Systems4009-BCECM
弹性蛋白BioMatrix5052ECM
原纤维蛋白Lynn Sakai 实验室 OHSUN/AECM
ANGPT2RnD_Systems_Own623-AN-025配体
IL1BRnD_Systems_Own201-LB-005配体
CXCL8RnD_Systems_Own208-IL-010配体
IGF1RnD_Systems_Own291-G1-200配体
TNFRSF11BRnD_Systems_Own185-OS配体
BMP6RnD_Systems_Own507-BP-020配体
FLT3LGRnD_Systems_Own308-FK-005配体
CXCL1RnD_Systems_Own275-GR-010配体
DLL4RnD_Systems_Own1506-D4-050配体
HGFRnD_Systems_Own294-HGN-005配体
Wnt5aRnD_Systems_Own645-WN-010配体
CTGFLife_Technologies_OwnPHG0286配体
LEPRnD_Systems_Own398-LP-01M配体
FGF2Sigma_Aldrich_OwnSRP4037-50UG配体
FGF6RnD_Systems_Own238-F6配体
IL7RnD_Systems_Own207-IL-005配体
TGFB1RnD_Systems_Own246-LP-025配体
PDGFBRnD_Systems_Own220-BB-010配体
WNT10AGenemed_Own90009配体
PTNRnD_Systems_Own252-PL-050配体
BMP3RnD_Systems_Own113-BP-100配体
BMP4RnD_Systems_Own314-BP-010配体
TNFSF11RnD_Systems_Own390-TN-010配体
CSF2RnD_Systems_Own215-GM-010配体
BMP5RnD_Systems_Own615-BMC-020配体
DLL1RnD_Systems_Own1818-DL-050配体
NRG1RnD_Systems_Own296-HR-050配体
KNG1RnD_Systems_Own1569-PI-010配体
GPNMBRnD_Systems_Own2550-AC-050配体
CXCL12RnD_Systems_Own350-NS-010配体
IL15RnD_Systems_Own247-ILB-005配体
TNFRnD_Systems_Own210-TA-020配体
IGFBP3RnD_Systems_Own675-B3-025配体
WNT3ARnD_Systems_Own5036-WNP-010配体
PDGFABRnD_Systems_Own222-AB配体
AREGRnD_Systems_Own262-AR-100配体
JAG1RnD_Systems_Own 1277-JG-050配体
BMP7RnD_Systems_Own354-BP-010配体
TGFB2RnD_Systems_Own302-B2-010配体
VEGFARnD_Systems_Own293-VE-010配体
IL6RnD_Systems_Own206-IL-010配体
CXCL12RnD_Systems_Own351-FS-010配体
NRG1RnD_Systems_Own378-SM配体
IGFBP2RnD_Systems_Own674-B2-025配体
SHHRnD_Systems_Own1314-SH-025配体
FASLGRnD_Systems_Own126-FL-010配体
分子

参考文献

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