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基于腺相关病毒载体的生产、纯化与质量控制

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DOI：

10.3791/58960

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2019年1月29日

 ,  ,  ,  , 
1VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research, 2Department of Neuroscience, KU Leuven, 3Leuven Brain Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种高效且可重复的策略，用于生产、滴定和质控腺相关病毒载体批次。该方法可使使用者获得高滴度的载体制备物 （≥1 × 1013 病毒基因组/毫升）和高纯度，可直接用于 体外 或 体内 使用。

摘要

基于腺相关病毒（AAVs）的基因递送工具是将转基因递送至中枢神经系统（CNS）的常用选择，包括基因治疗应用。AAV 载体不具备复制能力，可感染分裂和非分裂细胞 ，并能实现长期的转基因表达。重要的是，某些血清型（例如新近报道的 PHP.B）在动物模型中经系统性给药后能够穿越血脑屏障（BBB）。AAV 载体可在实验室中高效制备。然而，为了获得足够纯度且滴度足以用于体内（in vivo）应用的 AAV 载体，需要稳健且可重复的实验方案。本方案描述了一种基于碘克沙醇梯度纯化策略的高效且可重复的 AAV 载体制备方法。与其他纯化方法相比，碘克沙醇纯化法适用于获得高滴度、高纯度的 AAV 载体批次。此外，该方法通常比目前报道的其他方法更快。同时，本文还介绍了一种基于定量聚合酶链式反应（qPCR）的策略，用于快速、准确地测定载体滴度，以及一种银染方法用于评估载体批次的纯度。最后，展示了系统给予 AAV-PHP.B 后向中枢神经系统递送基因的代表性结果。所有采用本文所述方案的实验室均应能获得此类结果。

引言

在过去的30年中，野生型AAV经过改造被用于构建重组AAV载体，这些载体已被证明是向中枢神经系统（CNS）进行基因转移 1,2,3,4,5,6以及开展疾病基因治疗（包括已获美国FDA和欧洲EMA批准的疗法）4,7的极为有用的工具。AAV载体适用于CNS的主要原因在于其能够感染中枢神经系统中常见的非分裂、终末分化细胞8。此外，AAV载体还具有可实现任何特定治疗性转基因长期表达4,9的优势，同时相较于其他病毒载体引发的免疫反应更轻微7,8,10,11,12。

AAV 载体的主要组分是基因组和衣壳。野生型 AAV 是单链（ss）DNA 病毒，其基因组大小约为 5 千碱基（kb）13用于重组AAV载体的生产， rep 和 帽 基因（对基因组复制和病毒衣壳组装至关重要）从野生型 AAV 的基因组中被删除，并另行提供 在转染中，为包含转基因的表达盒预留空间14,15腺相关病毒（AAV）载体中仅保留了原始病毒基因组的反向末端重复序列（ITRs），因为这些序列对于病毒的复制和包装至关重要。3,10,14腺相关病毒载体可经过改造以增强外源基因的表达；其中一个ITR的突变可导致发夹环结构的形成，从而有效促进互补DNA链的合成。3,7,15. 这种构型被称为自互补（sc）基因组，其主要优势在于无需经过 在腺相关病毒（AAVs）传统生命周期中典型的第二条链合成，显著加快了外源基因表达的速度并提高了表达水平1然而，使用scAAV基因组会将载体的载荷容量减少至约2.4 kb，其中包括转基因序列以及启动子或miRNA结合位点等调控序列，以限制在特定细胞类型中表达16.

AAV 衣壳决定了载体与宿主细胞的相互作用，并赋予特定 AAV 血清型一定程度的细胞类型或组织嗜性，这一特性也可被用于将转基因表达限制在特定部位。自然界中存在多种 AAV 血清型，而另一些则通过实验室中的重组技术产生（例如 PHP.B）。此外，某些衣壳还具备其他有益特性，例如能够穿越血脑屏障（BBB），从而在全身给药后实现转基因在整个中枢神经系统（CNS）的递送。这一现象已在 AAV9 以及近期报道的 PHP.B 衣壳中得到证实17。因此，这些血清型在针对 神经退行性疾病1,17,18的新型基因治疗策略中正显示出尤为重要的意义。

本方案旨在介绍一种经济高效的小规模制备高滴度、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的方法。尽管本文展示的结果使用了PHP.B衣壳和scAAV表达盒，但该方案适用于多种AAV载体血清型和基因组构型的制备，具有最大的实验灵活性。然而，载体产量和最终纯度可能因所选血清型的不同而有所差异。

该方案本身是病毒载体生产中经典三重转染方法的一种变体，并结合使用碘克沙醇梯度进行载体纯化。与传统的氯化铯（CsCl）梯度方法相比，该方法已被报道能够以更高效的时间获得纯度更高的腺相关病毒（AAV）载体19,20,21。

转染、纯化 和浓缩步骤应在适用于病毒载体操作的组织培养实验室中，按照良好实验室规范（GLP）进行。 各项操作必须遵守与病毒载体生产及使用相关的当地和国家法律法规。所有工作必须在超净工作台内无菌条件下进行。在病毒载体实验室内，除常规组织培养实验服外，建议穿戴实验围裙，并始终佩戴两副手套以及塑料鞋套。

在开始载体生产之前，确保所有必需的设备和质粒均已备齐。1) pCapsid 质粒包含 rep 编码四种复制所必需的非结构蛋白的基因，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，以及 帽 编码三种结构衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的基因。2）pHelper质粒包含这些基因 E4，E2A，以及 VA 来自腺病毒，可在HEK293T细胞中促进AAV的产生。3) pTransgene质粒包含由两个ITR侧翼包围的转基因表达盒。这些质粒可被合成 从头合成 在实验室中利用在线可获取的序列22用于质粒的制备 从头合成，尤其是含有新转基因的质粒，需要进行测序以确保转基因序列和ITRs正确无误。或者，也可通过在线质粒库直接获取预制质粒。必要时，可根据制造商说明书，使用标准试剂盒对质粒进行扩增和纯化23.

病毒载体滴度和纯度可能对载体的转导能力产生不利影响。另提供相关实验方案以评估所制备载体的质量。最终获得的载体将有助于研究中枢神经系统细胞在体内外的功能 体外 和 体内 应用。

方案

溶液成分
细胞培养与转染
DMEM1DMEM 1x
1% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
DMEM10DMEM 1x
10% FBS (v/v)
1% GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl4.380 g NaCl
加超纯水至 500 mL
AAV 纯化与脱盐
5 M NaCl146.1 g NaCl
加超纯水至 500 mL
1 M Tris HCl (pH 8.5)12.11 g Tris 碱CAUTION
加超纯水至 100 mL
用巴斯德移液管加入 1 M HCl，将 pH 调至 8.5
裂解缓冲液15 mL 5 M NaCl
25 mL 1 M Tris HCl (pH 8.5)CAUTION
加超纯水至 500 mL
10x 磷酸盐缓冲液 (PBS)80 g NaCl
2 g KClCAUTION
14.4 g Na2HPO4
2.4 g KH2PO4
加 dd水至 1 L
1 M MgCl220.33 g MgCl2-6H2O
加超纯水至 100 mL
1 M KCl7.45 g KClCAUTION
加超纯水至 100 mL
5x PBS 镁钾缓冲液 (PBS-MK) 储存液250 mL 10x PBS
2.5 mL 1 M MgCl2
6.25 mL 1 M KClCAUTION
加超纯水至 500 mL H2O
15% 碘克沙醇12.5 mL Optiprep 密度梯度介质CAUTION
10 mL 5 M NaCl
10 mL 5x PBS-MK
17.5 mL 超纯水
25% 碘克沙醇20.8 mL Optiprep 密度梯度介质CAUTION
10 mL 5x PBS-MK
19.2 mL 超纯水
100 µL 酚红
40% 碘克沙醇33.3 mL Optiprep 密度梯度介质CAUTION
10 mL 5x PBS-MK
6.7 mL 超纯水
60% 碘克沙醇50 mL Optiprep 密度梯度介质CAUTION
100 µL 酚红CAUTION
AAV 纯度检测
10x Tris 乙酸盐 EDTA (TEA) 缓冲液 44.8 g Tris 碱 CAUTION
11.4 mL 冰乙酸 (17.4 M)
3.7 g EDTA
加超纯水至 1 L
琼脂糖凝胶 0.8 g 超纯琼脂糖
加 1x TEA 缓冲液至 100 mL
凝胶缓冲液181.7 g Tris 碱 CAUTION
1.5 g SDSCAUTION
用 1 M HCl 调 pH 至 8.45CAUTION
加超纯水至 500 mL
阴极缓冲液 10x121.14 g Tris 碱CAUTION
179.2 g TricineCAUTION
1% SDS (w/w)CAUTION
加超纯水至 1 L
阳极缓冲液 10x242.3 g Tris 碱CAUTION
加超纯水至 1 L
用 1 M HCl 调 pH 至 8.9CAUTION
上样缓冲液 5x配制 20 mL：
605 mg Tris 碱CAUTION
4 g SDSCAUTION
10 mg Serva Blue G
12 g 甘油
用 1 M HCl 调 pH 至 6.8，分装后于 -20 °C 保存CAUTION
浓缩胶配制 2 块胶：
400 µL 丙烯酰胺CAUTION
750 µL 凝胶缓冲液
1.85 mL 超纯水
4 µL TEMEDCAUTION
20 µL 10% APS (v/v)CAUTION
灌胶前立即加入 TEMED 和 10% APS。两种试剂均需在化学通风橱中使用。
分离胶配制 2 块胶：
3.32 mL 丙烯酰胺CAUTION
3.35 mL 凝胶缓冲液
1.14 mL 超纯水
2.12 mL 50% 甘油
6 µL TEMEDCAUTION
50 µL 10% APS (w/v)CAUTION
灌胶前立即加入 TEMED 和 10% APS。两种试剂均需在化学通风橱中使用。
水饱和正丁醇10 mL 正丁醇CAUTION
1 mL 超纯水
CAUTION： 有关危险化学品的使用指南，请参见材料表。

表1：所需溶液的组成。

1. HEK293T 细胞的三重转染

注意：有关本方案中所用缓冲液和溶液的组成，请参见表1。
注意：本方案此部分的操作大约需要4天时间。

  1. 在设定为 37 °C.
    注意： 使用传代次数少于20次的细胞，以确保最佳转染效率。
  2. 以 2 x 10 的密度接种 HEK293T 细胞3 至 6 × 103 细胞/平方厘米2 在直径15 cm的细胞培养皿中使用DMEM10培养。
  3. 在设定为标准条件的培养箱中将细胞培养至70–80%汇合度 37 °C，置于95%湿度和5% CO₂的环境中2.
    注意： 使用本方案生产一批 AAV 载体需要 18 个细胞培养皿（直径 15 cm）。70% - 80% 的细胞汇合度相当于 6 x 103 至 7 × 103 细胞/厘米²2，维持在17–20 mL的DMEM10培养基中。
  4. 以1/3.5（w/w）的质量比配制聚乙烯亚胺（PEI）/DNA混合物。
    1. 在1个50 mL锥形管中，配制18个细胞培养皿所需的DNA混合液，混匀 360 µg pΔF6的 180 µg pCapsid的 180 µg pTransgene 溶于 18 mL 的 150 mM NaCl 中。
    2. 将DNA混合液分装至三个50 mL锥形管中（每管6 mL DNA混合液）。
    3. 在新的50 mL锥形管中配制六块细胞培养皿所需的PEI混合液，通过混合 840 µg PEI的1 µg/µL) 加入6 mL 150 mM NaCl溶液中。
    4. 将6 mL PEI混合液（步骤1.4.3制备）逐滴加入含有DNA混合液的锥形管（步骤1.4.2制备）中，室温孵育20分钟，制备PEI/DNA混合液。
      注意： 孵育20分钟后，PEI/DNA混合物将略微变浑浊。
  5. 从培养箱中取出六个细胞培养皿，在超净工作台中将每块培养皿中的培养基完全吸除。用5 mL预热的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗培养皿，以去除残留的培养基。
  6. 通过轻轻倾斜培养皿，确保DPBS均匀覆盖整个表面。
  7. 轻柔地吸除 DPBS，并向每皿中加入 12 mL DMEM1。
    注意： 从培养皿边缘用移液管缓慢加入培养基，避免将细胞冲起。
  8. 用移液器将PEI/DNA溶液上下吹打3至5次混匀。以逐滴加入的方式将2 mL PEI/DNA混合液加入六个细胞培养皿中，注意均匀分布至整个培养皿表面。加样完毕后，立即将各培养皿放回培养箱中。对剩余的培养皿重复步骤1.4.3–1.8。
  9. 将转染后的细胞在37°C、5% CO₂培养箱中孵育5小时 37 °C，置于95%湿度和5% CO₂的环境中2.
  10. 向每块培养皿中额外加入 12 mL DMEM10，不移除原有培养基（培养基总体积 = 25 mL）。
  11. 转染后将转染的细胞孵育至最多72小时 37 °C，湿度95%、5% CO₂2.

显示细胞转染效率、细胞形态和绿色荧光的荧光显微镜图像。
补充图1：通过相差显微镜观察HEK 293T细胞形态（左图），并通过荧光成像确认GFP表达（右图）。（A）通过荧光成像证实HEK293T细胞成功转染编码GFP的pTransgene质粒。（B）仅用转染试剂处理的HEK293T细胞未显示GFP表达。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 转染后72小时收集培养基和细胞。使用细胞刮刀小心地将细胞从培养皿上刮下，将培养基和细胞收集至预冷的50 mL离心管中。
    注意：两个细胞培养皿的内容物可收集至同一个50 mL离心管中。此步骤结束时，每个九个离心管中将含有约50 mL培养基。
  2. 将离心管在4 °C条件下以420 × g 离心10分钟，离心机的加速度和减速度均设为最大。
  3. 小心弃去每管中的上清液。请勿使用移液器，以防样品损失。应将上清液轻轻倾倒至废液容器中，并将含有细胞沉淀的离心管立即放回冰上。
  4. 直接在50 mL离心管中用2 mL裂解缓冲液重悬每个细胞沉淀，通过上下吹打5–10次使其充分悬浮。切勿涡旋震荡。将三个离心管的裂解液合并在一起。
    注意：此时将得到三个50 mL离心管，每个管中含有6 mL用裂解缓冲液重悬的细胞悬液。

2. AAV 载体纯化

注意： 本方案步骤的执行时间大约为1天。请在含有细胞重悬于裂解缓冲液中的三个50 mL锥形管上同时进行以下步骤（参见上一条注释）。

  1. 将重悬的细胞进行三次冻融以裂解细胞并释放腺相关病毒（AAV）颗粒。冷冻步骤通过将离心管置于装有干冰与乙醇混合物的容器中完成；解冻步骤则立即将细胞放入37 °C水浴中进行。
  2. 第三次解冻后，在4 °C条件下以1,167 × g离心15分钟。
    注意：将形成明显的由细胞碎片组成的沉淀。操作离心管时应避免剧烈移动，以防沉淀重新悬浮进入上清液，从而影响最终病毒载体的纯度。
  3. 小心地将上清液转移至洁净的50 mL锥形管中，然后向每管中加入核酸酶，使终浓度达到50 U/mL上清液。
  4. 在37 °C孵育30分钟。每隔10分钟用手轻轻摇动50 mL锥形管，确保核酸酶与上清液充分混合。
  5. 在4 °C条件下以13,490 × g离心20分钟，澄清上清液。
  6. 将一个0.45 µm滤器连接至10 mL注射器，并将其置于洁净的50 mL锥形管上方。小心取出活塞，用步骤2.5所得的上清液填充注射器。
  7. 使用活塞将裂解液推过滤器。每管步骤2.5所得的上清液均需使用新的滤器和注射器。
    注意：所得组分称为“粗制裂解液”。
  8. 根据表1中的说明，在四个独立的50 mL锥形管中分别配制15%、25%、40%和60%的碘克沙醇溶液。
  9. 按照以下顺序，在三根超速离心管中制备碘克沙醇梯度：8 mL 15%碘克沙醇、5.5 mL 25%碘克沙醇、5 mL 40%碘克沙醇和4.5 mL 60%碘克沙醇。
    注意：碘克沙醇可能对眼睛、皮肤以及胃肠道和呼吸道造成刺激。操作碘克沙醇梯度时应佩戴手套，并在层流罩内操作。
    1. 用移液器将8 mL 15%碘克沙醇加入每根超速离心管中。
    2. 将5.5 mL 25%碘克沙醇溶液移入一个洁净的50 mL锥形管中（图1A）。
    3. 使用无刻度的巴斯德移液器（因超速离心管颈部过窄，无法使用常规刻度移液器），将5.5 mL 25%碘克沙醇溶液小心地叠加在15%碘克沙醇溶液下方（图1B）。
      注意：由于巴斯德移液器每次仅能容纳约2 mL液体，可分三次加入以顺利完成此步骤。
    4. 按照步骤2.9.3所述方法加入40%和60%碘克沙醇溶液。在叠加过程中避免扰动不同浓度的碘克沙醇界面。
      注意：碘克沙醇溶液中已添加酚红，可通过肉眼观察确认各梯度是否正确制备（参见表1中的说明）。由于各梯度具有特定密度，若操作得当，叠加过程中不会相互混合（参见图1C）。
  10. 使用巴斯德移液器将粗制裂解液小心地叠加在15%碘克沙醇梯度上方。逐滴加入，避免扰动粗制裂解液与碘克沙醇溶液之间的界面。
  11. 用裂解缓冲液加满超速离心管，直至弯月面达到管颈底部，以确保在超速离心过程中产生的巨大离心力下离心管不会塌陷（图1C）。
  12. 使用合适的盖子封闭超速离心管。使用电子天平确保三根超速离心管重量一致。如有必要，可在“粗制裂解液”上方添加更多裂解缓冲液以调节重量。
    注意：超速离心管之间的重量差异必须小于0.1 g，以确保超速离心机的安全运行。超速离心机属于潜在危险设备，仅可由经过适当培训的人员操作。
  13. 使用固定角钛转子，在12 °C条件下以最大加速度和减速度，于301,580 × g离心1小时40分钟。
  14. 小心地将不锈钢钝头针插入40%与60%碘克沙醇界面处。
    1. 将针头连接至一个5 mL注射器（图1E）。
    2. 仅吸取含有病毒载体颗粒的透明组分。
      注意：收集的总体积约为2.5–3 mL。避免收集25–40%界面处的物质，因其含有非目标蛋白，会增加最终病毒批次的污染水平。
    3. 对收集的组分进行脱盐与浓缩处理，或在4 °C下保存过夜。

碘克沙醇梯度静态平衡法、离心实验装置、AAV纯化。
图1：碘克沙醇梯度纯化及后续载体收集的实验装置。（A）在将不同浓度的碘克沙醇梯度液移入超速离心管之前，先用移液器将每种碘克沙醇溶液适量移入单独的锥形管中。（B）然后使用巴斯德移液管依次将各碘克沙醇溶液转移至超速离心管中：应将碘克沙醇浓度逐渐升高的溶液层依次叠加于管底，新一层位于前一层之下。（C）梯度制备完成后，将粗制载体裂解液加于上层。该载体收集系统不使用锐利针头，从而避免了“针刺”伤害的风险。（D）将一根不锈钢316号注射针头穿过碘克沙醇梯度插入至40%/60%碘克沙醇界面处。（E）载体颗粒位于40%碘克沙醇相中，并在此处被收集。请点击此处查看该图的高清版本。

3. AAV 载体的脱盐与浓缩

注意：本实验步骤的执行时间大约需要 2 小时。

  1. 向离心过滤器的滤膜中加入 5 mL 1x PBS-MK，以 4,000 × g 离心 5 分钟，预清洗滤膜。
  2. 向收集的 AAV 载体组分中加入 5 mL 1x PBS-MK，混匀后将全部液体转移至滤膜中。加入 1x PBS-MK 后可观察到浑浊现象。在 4,000 × g 条件下离心，直至锥形滤膜中的液体体积减少至 1 mL。弃去外层收集管中的滤过液。
  3. 向锥形滤膜中加入 13 mL 1x PBS-MK，重复离心步骤，直至加入新鲜 1x PBS-MK 后不再出现浑浊（至少重复 3 次）。
  4. 在最后一次洗涤步骤中，向滤膜中加入 13 mL PBS + 0.01% (v/v) 非离子型表面活性剂，在 4,000 × g 条件下离心，直至液体体积减少至 300–350 µL。
  5. 用移液器将滤膜上剩余的液体全部转移至无菌带裙边的微量离心管中。
    注意：该组分含有脱盐并浓缩的 AAV 载体。在本实验方案的后续步骤中，此组分被称为“主要”组分。操作时应确保在生物安全柜中进行，并将样品保存于 4 °C。
  6. 用 200 µL 1x PBS-MK 冲洗滤膜，以回收残留在滤膜上的载体颗粒，并将洗脱液收集至无菌微量离心管中。
    注意：此为稀释后的载体储备液，可能适用于某些需要较低载体滴度的应用。在后续步骤中，该组分被称为“次要”组分。
  7. 短期储存时，将载体组分保存于 4 °C（不超过 2 周）。如需长期储存，应分装后于 ‑20 °C 保存。
  8. 按照第 4 节所述进行质量控制。

4. 通过定量聚合酶链式反应滴定载体

注意：本实验步骤的执行时间约为 3 小时。

  1. 标准曲线
    1. 线性化用于第1节中转染HEK-293T细胞的表达转基因质粒（pTransgene）。
    2. 在0.5 mL微量离心管中配制限制性消化反应体系（参见表2中限制性消化反应体系的组成）。
      注意：根据所使用的酶及生产商的相关指南调整限制性消化反应体系的组成。
    3. 在37 °C下孵育限制性消化反应体系1小时。
    4. 通过在100 V电压下运行0.8%（w/v）琼脂糖凝胶电泳1小时，检测限制性消化的效率。质粒完全消化后应产生一条大小明确的单一DNA片段。
    5. 使用PCR纯化试剂盒，按照生产商说明书24纯化线性化质粒DNA，并通过分光光度计在260 nm处测量吸光度以测定DNA浓度。滴定完成后，将剩余的线性质粒分装后于‑20 °C保存以备后续使用。
    6. 按以下步骤计算每微升质粒储备液中的分子数（即DNA拷贝数）。
      1. 首先，计算质粒的分子量。假设DNA碱基对（bp）的平均分子量为650道尔顿（Da），1摩尔碱基对的质量为650 g，则任何双链DNA模板的分子量可通过其长度（以bp计）与每个碱基对质量的乘积估算。
        质粒分子量 [g/mol] = 质粒大小 [bp] × 650 [Da/bp]
      2. 接着，计算每微升质粒的摩尔数。
        每微升质粒摩尔数 = 质粒浓度 [g/µL] / 质粒分子量 [g/mol]
        注意：分子量的倒数表示1 g该物质中所含质粒的摩尔数。
      3. 然后，利用阿伏伽德罗常数（6.022 × 1023 分子/摩尔）计算每微升质粒分子数。
        每微升质粒分子数 = 每微升质粒摩尔数 [mol/µL] × 阿伏伽德罗常数 [分子/mol]
      4. 最后，将质粒储备液（分子/µL）稀释，配制100 µL终体积、浓度为1 × 109 分子/µL（即每微升病毒基因组（vg））的溶液。
        质粒储备液（100 µL）=（目标浓度 [分子/µL] × 100 µL）/ 质粒分子数 [分子/µL]
    7. 将质粒储备液（1 × 109 vg/µL）进行连续三倍重复稀释：
      10 µL 1 × 109 vg/µL 质粒储备液 + 90 µL H2O = 1 × 108 vg/µL 溶液
      10 µL 1 × 108 vg/µL 稀释液 + 90 µL H2O = 1 × 107 vg/µL 溶液
      10 µL 1 × 107 vg/µL 稀释液 + 90 µL H2O = 1 × 106 vg/µL 溶液
      10 µL 1 × 106 vg/µL 稀释液 + 90 µL H2O = 1 × 105 vg/µL 溶液
      继续稀释，直至获得1 × 101 vg/µL 溶液。
    8. 将标准质粒储备液的系列稀释液置于冰上，直至上样至qPCR板（第4.3节）。
组分用量
10x 限制性内切酶缓冲液5 µL
限制性内切酶2,5 µL
质粒5 µg
H2O加至 50 µL

表2：限制性消化反应体系组成。

表3：质粒储备液体积计算器。请点击此处下载该表格。

  1. 从AAV载体中提取DNA
    1. 在条形管（PCR管）中将2 µL AAV载体原液（步骤3.5中的主要组分）与198 µL DNase I缓冲液（1x）混合，并加入2 µL DNase I。
      注意： DNase I会降解所有未被包裹在载体衣壳内的遗传物质（否则将干扰qPCR结果）。该溶液称为稀释液“dil1 x 10-2”。
    2. 在37 °C孵育30分钟，随后在95 °C孵育10分钟。
      注意： 此处可暂停实验流程，材料可在4 °C长期保存，以避免产物降解。
    3. 向dil1 x 10-2溶液（步骤4.2.1）中加入2 µL蛋白酶K，于50 °C孵育60分钟，随后在95 °C孵育20分钟。
      注意： 此步骤将解离AAV载体的衣壳结构，使AAV载体基因组释放到溶液中。由于样品中蛋白（衣壳）含量未知，应过量加入蛋白酶K。需注意，在进行qPCR前，必须通过变性彻底消除所有蛋白酶K的活性，以避免其对（部分）DNA聚合酶的降解作用影响最终结果。
    4. 在1.5 mL微量离心管中，对经蛋白酶K处理的dil1 x 10-2溶液（步骤4.2.3）进行1:10系列稀释，具体如下：
      10 µL dil1 x 10-2 + 90 µL H2O = dil1 x 10-3 稀释液
      10 µL dil1 x 10-3 + 90 µL H2O = dil1 x 10-4 稀释液
      10 µL dil1 x 10-4 + 90 µL H2O = dil1 x 10-5 稀释液
    5. 将从载体中提取的DNA系列稀释液置于冰上保存，直至加样至qPCR板（第4.3节）。
  2. 基于SYBR Green检测的qPCR滴定
    1. 在1.5 mL微量离心管中配制qPCR主混合液，用于样品和标准品。每反应使用10 µL SYBR Green主混合液、1 µL正向引物（10 µM原液）、1 µL反向引物（10 µM原液）和3 µL H2O。引物序列参见表4中的方案。
    2. 用移液器将qPCR主混合液吹打混匀，切勿涡旋振荡。
    3. 向每个孔中加入15 µL qPCR主混合液，随后加入5 µL第4.1节制备的标准曲线样品或第4.2节提取的AAV载体DNA。设置三个仅含qPCR主混合液的孔作为阴性对照。qPCR板布局参见图2。
    4. 用封板膜密封反应板，并在4 °C以1,500 x g短暂离心30秒。
    5. 使用表5中建议的条件，在基于板式的实时荧光定量PCR扩增与检测仪器上运行qPCR反应。
引物名称序列
正向引物5’-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3’
反向引物5’-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3’

表4：针对CBA启动子设计的引物序列。

微量滴定板实验；标准曲线、对照、初级/次级组分；数据分析。
图2：基于qPCR的病毒载体滴度测定的板式布局。 样品采用颜色编码：绿色 = 标准曲线；蓝色 = H2O对照；灰色 = 初级组分；橙色 = 次级组分。请点击此处查看该图的放大版本。

步骤时间温度循环数目的
预孵育5 min95 °Cx1DNA变性及聚合酶激活（热启动反应）。
扩增10 min95 °Cx1DNA扩增。若使用具有不同退火温度的其他引物，可对程序设置进行优化。
10 s95 °Cx40
40 s60 °C
1 s72 °C
冷却10 s40 °Cx1反应板冷却。PCR结束。

表5：基于SYBR Green的qPCR滴定热循环程序。

  1. 数据分析以确定 AAV 载体滴度
    1. 在电子表格的数据单元格（表6A）中填入第4.1节制备的标准样品不同稀释度所获得的Ct值，以生成标准曲线。
      注意：标准曲线的方程将显示（y = a ln(x) + b）以及 R2 效率（表6B）。qPCR的扩增效率必须接近100%，且R2 接近 1.0（≥ 0.96）。
    2. 使用计算得出的数值 a 和 b 填写电子表格中的相应数据单元格（表 6C）。
    3. 根据第4.2节中制备的AAV样品不同稀释度所获得的Ct值，填写完整该电子表格。
    4. 使用以下公式计算“主要组分”中每微升的平均 AAV 载体滴度（以载体基因组数表示）：
      滴度计算公式：滴度 = (Ct - b)/a × 400 × 1/稀释倍数 × 1/2；定量分析方法。
      注意：对于单链基因组使用400作为乘数因子，而sc基因组则使用200作为乘数因子25事实上，由于在每个qPCR循环中DNA数量会翻倍，与单链基因组相比，sc DNA的检测量为2倍。滴定的目的是计算每微升中的载体基因组数量。在进行qPCR时，若使用以下情况，则需进行校正 2 µL 起始材料的量（步骤 4.2.1）。 稀释 表示步骤 4.2.4 中的稀释倍数。‘次级’ AAV 载体组分（步骤 3.6）的滴度可同时计算。

表6：qPCR数据分析模板。 请点击此处下载该文件。

5. 通过 SDS-PAGE 和银染进行纯度检测

注意：本实验方案此部分的操作耗时约 5 小时。

  1. 使用 70% (v/v) 乙醇彻底清洁用于制胶的玻璃板。
  2. 组装凝胶制备系统。确保玻璃板底部无缺口或破损，以防止灌胶时丙烯酰胺混合液泄漏。
  3. 在两个独立的 50 mL 圆锥形离心管中分别配制浓缩胶和分离胶溶液。暂不加入四甲基乙二胺（TEMED）和 10% (w/v) 过硫酸铵（APS），因为它们会引发凝胶聚合。在灌胶前立即加入上述两种试剂。
    注意： 凝胶中丙烯酰胺的最终浓度会影响蛋白质的分离效果：通常，10% (v/v) 的丙烯酰胺终浓度足以用于检测 AAV 载体制剂的纯度。
  4. 通过轻轻旋转混匀含有凝胶组分的离心管。切勿使用涡旋振荡，因为过度氧化可能影响凝胶聚合。
  5. 向分离胶溶液中加入 TEMED 和 10% (w/v) APS，混匀后倒入凝胶模具中，使液面升至小玻璃板顶部以下 1–2 cm 处。
  6. 在丙烯酰胺混合液上层覆盖一层饱和正丁醇水溶液。这有助于聚合过程中形成平整的胶面。切勿使凝胶在醇中停留超过 30 分钟，否则会导致凝胶脱水，影响其功能。
    警告：正丁醇接触皮肤有害，且具有火灾风险。操作时需谨慎。
  7. 等待凝胶聚合完成后，倒掉正丁醇。提示：可检查离心管中残留的胶液是否已固化。聚合过程通常在 20 分钟内完成。用 H2O 冲洗凝胶表面，然后用纸巾小心吸干，注意不要破坏胶面。
  8. 向浓缩胶溶液中加入 TEMED 和 10% (w/v) APS，混匀后将浓缩胶灌注于已聚合的分离胶上方。
  9. 插入所提供的梳子。操作时应以一次平稳动作完成，避免在加样孔内产生气泡。
  10. 等待至少 20 分钟，使凝胶充分聚合。提示：可通过检查圆锥形离心管中多余胶液是否固化来判断聚合是否完成。
  11. 按照步骤 3.5 和 3.6，分别配制用于初级和次级 AAV 载体组分的两种混合液（见表 7）。
高量低量
AAV 载体原液5 µL1 µL
5x 上样缓冲液3 µL3 µL
H2O7 µL11 µL

表7：银染所需样品混合液的组成。

  1. 将样品混合物在 95 °C 下加热 5 分钟，使其完全变性。组装电泳槽时，注意电极的方向。
  2. 在电极组件内侧加入 1× 阴极缓冲液，外侧加入 1× 阳极缓冲液。
    注意：阳极缓冲液可重复使用；阴极缓冲液必须每次使用新鲜配制的。
  3. 从凝胶中取出梳子，并用 1× 阴极缓冲液清洗凝胶孔。
  4. 在某一加样孔中加入 1 µL 蛋白质分子量标记物。将样品混合物分别加入同一块凝胶的不同加样孔中（图 3）。以 50 V 电压开始电泳，待样品进入分离胶后，将电压升至 100 V，直至染料前沿迁移至凝胶底部。
  5. 小心地将凝胶从玻璃板间取出，并使用银染试剂盒（按照制造商说明书26）显影，以观察组成 AAV 衣壳的病毒蛋白（VP1、VP2 和 VP3 亚基），并检测可能存在的蛋白质污染（图 3）。

蛋白质电泳结果；显示条带分离的蛋白分子量标准及样品；分子量分析。
图3：利用SDS-PAGE和银染法评估载体纯度。 使用Tricine-SDS凝胶分离5 µL不同载体样品，随后通过银染法检测蛋白质。当VP1（82 kDa）、VP2（67 kDa）和VP3（60 kDa）以1:1:10的比例可见（泳道1），且无明显背景干扰（泳道2）或非特异性条带（泳道3）时，可认为载体纯度达标。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

AAV9 曾被认为是在外周给药后穿越血脑屏障并转导中枢神经系统细胞最有效的 AAV 载体血清型，直到最近。当 Deverman 实现了衣壳设计的重大进展时 等人报道了一种名为基于Cre重组的腺相关病毒靶向进化（CREATE）的衣壳筛选方法17采用该方法，他们鉴定出一种新的衣壳，命名为 PHP.B，据报告在全身注射后能够转导多个中枢神经系统区域中的大部分星形胶质细胞和神经元17需要指出的是，尽管PHP.B在C57/Bl6小鼠中可获得阳性结果（该品系为最初分离实验所用），但初步报道表明其效率可能因小鼠品系不同而存在差异。后续实验无疑将对此问题提供更深入的认识。31.

然而，尽管存在这些问题，PHP.B 为小鼠中枢神经系统（CNS）的非侵入性基因操作提供了令人期待的可能性，包括在疾病模型中开展概念验证性的基因治疗实验。因此，我们选择评估 PHP.B 介导外源基因表达的效率 与 AAV9 自2009年以来一直是外周给药后实现中枢神经系统转导的“金标准”载体2为了在转基因表达的最佳条件下对两种血清型进行直接比较，我们采用了sc基因组构型32两种载体均携带在普遍性鸡β-actin（CBA）启动子调控下的绿色荧光蛋白（GFP）转基因。出生后第42天（体重约20 g）的雌性C57/Bl6小鼠接受1 × 10¹¹ vg/kg剂量的载体静脉注射，每周监测体重与临床症状。12 每只小鼠注射 vg 的 scAAV2/PHP.B-CBA-GFP 或 scAAV2/9-CBA-GFP。载体给药操作如下进行 通过 尾静脉注射。实验已获得鲁汶大学伦理委员会的批准。

注射后三周，小鼠经心脏灌注冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注4%（w/v）冰冷的多聚甲醛（PFA）。取出脑组织，并在相同固定液中4℃过夜后固定，然后转移至含0.01%（w/v）叠氮化钠的PBS溶液中保存，待进一步分析。随后，使用振动切片机对脑组织进行切片，并进行免疫组织化学染色 50 µm 厚切片

为评估转基因表达水平，使用针对GFP的一抗（兔抗GFP）对组织切片进行染色，并用荧光染料标记的二抗（山羊抗兔Alexa Fluor 488）进行检测（图4A、B）。荧光强度测量值（以任意单位[au]表示）证实，与AAV9相比，使用sc基因组和PHP.B衣壳时GFP表达显著升高。在大脑（2105 ± 161 vs. 1441 ± 99 au；p = 0.0032）、小脑（2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au；p = 0.0032）以及脑干（3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au；p = 0.0038）中均观察到GFP表达的升高（图4C）。

脑切片中scAAV2/9与scAAV2/PHP.B的荧光检测；荧光强度比较图表
图4：全身递送scAAV2/PHP.B-CBA-GFP在中枢神经系统中导致高水平的GFP表达。 scAAV2/PHP.B-CBA-GFP 或 scAAV2/9-CBA-GFP（1 × 1012 将vg/mouse剂量通过尾静脉注射给予6周龄的C57/Bl6小鼠。注射后3周，对冠状脑切片进行免疫组织化学检测以观察GFP表达。A) 大脑和 (B) 小脑和脑干如图所示。比例尺 = 1 mm。C通过定量分析相对荧光强度来确定每种载体所达到的GFP信号水平（每只小鼠10个切片；每种载体组3只小鼠）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行双尾Student's t检验。 t-检验；数据以均值 ± 标准差表示；**p < 0.01；au，任意单位。pCapsid，用于AAV载体生产，包含该基因 rep 来自2型血清型和该基因 帽 根据血清型 PHP.B 或 AAV9 进行相应调整。此图已根据 Rincon 修改 等32. 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述的重组腺相关病毒（AAV）载体的制备方法使用了大多数分子生物学实验室和细胞培养设施中常见的材料和设备。该方法可使使用者获得高纯度、适用于临床前研究的AAV载体，可用于靶向多种细胞和组织类型，适用于多种体外（in vitro）和体内（in vivo）应用。与其它方法（例如基于氯化铯的纯化方法）相比，本方案最大的优势之一是所需操作时间更短。在HEK293T细胞初次转染后，最多6个工作日内即可获得可直接使用的AAV载体。

多种因素可能对腺相关病毒（AAV）载体的最终产量或质量产生不利影响。转染效率低下是导致病毒产量低的主要原因之一。33一个主要建议是使用未经传代的 HEK293T 细胞 超过20代，且在转染时细胞汇合度不超过90%21此外，所选择的转染方法对实验结果具有重要影响。本实验方案基于使用PEI。PEI是一种阳离子聚合物，可通过与核酸形成聚合物-核酸复合物（称为polyplexes）将外源DNA递送至细胞核，这些复合物可被细胞摄取 被细胞摄取并转运 通过 内体34PEI介导的转染操作简便快速，与其他常用方法（如DNA与磷酸钙共沉淀法）相比具有明显优势。35此外，与一些新引入的方法（如阳离子脂质转染和磁珠介导转染）相比，基于PEI的转染成本要低得多。36.

纯化策略在本实验方案中起着关键作用。与其他方法相比，基于碘克沙醇的纯化通常含有较高比例的空病毒颗粒（20%）20。然而，这一缺点在一定程度上被以下事实所抵消：基于碘克沙醇的纯化通常可获得粒子与感染性比值低于100的AAV载体制剂。这与传统的基于氯化铯（CsCl）的方法相比具有显著改进，后者据报道会造成病毒粒子感染性的大幅损失37。另一种常见的AAV载体纯化方法是基于层析的纯化。然而，该方法存在一个主要缺点，即每种使用的载体衣壳都需要特定的层析柱：例如，虽然AAV2通常可使用肝素柱进行分离，但该方法不适用于AAV4和AAV5，因为它们的衣壳上缺乏肝素结合位点38。考虑到层析纯化成本也较高，因此对于希望小规模制备高质量AAV载体批次的实验室而言，基于碘克沙醇的纯化通常更为合适33,39,40。然而，为了最大化最终载体的产量和纯度，在制备碘克沙醇梯度时必须格外小心。应使用无菌的巴斯德移液管将不同浓度的碘克沙醇组分转移至超速离心管中，移液管尖端需接触管壁，并缓慢而连续地将碘克沙醇从移液管中排出。由于载体颗粒会聚集在40%碘克沙醇层中，因此必须小心操作以避免梯度界面混合20。最后，应使用规格不超过20 G的不锈钢钝头针插入离心管来回收含有载体的组分。为最大化载体回收率，应完整收集透明组分。在此步骤中，时间控制至关重要。为避免影响制剂纯度，必须在收集到其他（污染性）梯度组分之前停止收集。

所获得的载体 滴度差异也可能归因于载体 自身产生包装 病毒颗粒的内在能力。不同AAV血清型之间的比较表明，某些AAV载体比其他类型（例如AAV2）更难获得高滴度41。在脱盐步骤中载体发生沉淀可能是导致滴度降低的一个原因，可通过避免过度浓缩而轻易避免33。此外，碘克沙醇梯度纯化效率在不同血清型之间也可能存在轻微差异，因此使用不同血清型时所获得的滴度可能出现差异41。

最后需要指出的是 尽管qPCR是一种非常精确的DNA定量方法 该技术本身可能存在一定的固有变异性。滴定结果的准确性主要取决于所有溶液的精确移液和充分涡旋混合。为获得最准确的滴定值，可独立重复进行qPCR检测，并对所得数值取平均值。本方案中所选用的引物基于本实验室所使用的pTransgene质粒中CBA启动子的序列。CBA启动子是一种强效的合成型启动子，在载体领域被广泛用于驱动多种细胞类型的基因表达。该启动子包含多个元件，如巨细胞病毒（CMV）早期增强子元件；CBA基因的启动子、第一外显子和第一内含子；以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体。然而，引物可针对表达盒内的几乎所有元件（包括启动子、目的基因和调控元件）进行设计。只要使用针对不同载体中共有序列区域的引物，即可实现不同批次间滴度的比较。

总之，本方案可用于生产具有多种衣壳、基因组构型和启动子类型的AAV载体 和转基因载体。这将使用户能够轻松调整其载体的最终特性，以最适配实验需求。在代表性结果示例中，使用可高效穿越血脑屏障（BBB）的 PHP.B 衣壳，获得了 尾静脉注射后中枢神经系统中高效的基因表达32中枢神经系统可穿透性载体的全身给药在潜在副作用方面具有显著优势2,17,32一种可能替代外周注射且避免侵入性技术局限性的方法是鞘内给药，该方法包括 将AAV载体递送至脑脊液中。该递送途径已被证实有效，显示出 中枢神经系统内转基因的广泛表达、外周器官脱靶效应较小以及免疫反应水平较低42然而，鞘内注射的难度要大得多，因其所需的技术水平高于尾静脉注射。

进一步优化该技术的衣壳开发将由腺相关病毒（AAV）载体在基因治疗应用中的机遇所推动。这类方法为治疗目前无法治愈的中枢神经系统疾病提供了极具吸引力的可能性，例如肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症 、帕金森病和阿尔茨海默病18。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

M.R. 获得佛兰德斯科学基金（Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen，FWO）博士后奖学金（133722/1204517N）的支持，并感谢哥伦比亚心血管基金会和科学技术创新行政部（Grant CT-FP44842-307-2016，项目编号 656671250485）的持续支持。M.M. 获得佛兰德斯科学基金（FWO）博士生奖学金（1S48018N）的支持。M.G.H. 获得VIB机构资助以及Thierry Latran基金会（SOD-VIP）、阿尔茨海默病研究基金会（SAO-FRA）（P#14006）、佛兰德斯科学基金（FWO）（Grant 1513616N）和欧洲研究理事会（ERC）（启动资助 281961 - AstroFunc；概念验证资助 713755 - AD-VIP）的外部支持。作者感谢Jeason Haughton在小鼠饲养方面的帮助，Stephanie Castaldo在尾静脉注射操作中的协助，以及Caroline Eykens提供转染的HEK293T细胞图像。M.G.H. 感谢Michael Dunlop、Peter Hickman和Dean Harrison。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
质粒制备
pTransgene 质粒从头设计，或从质粒库中获取N/A详见主方案第1步
pCapsid从头设计，或从质粒库中获取N/A详见主方案第1步
pHelperAgilent240071
质粒Plus大提试剂盒Qiagen12963
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
AAV 无辅助病毒系统Agilent240071
细胞培养与转染
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM），高糖，无谷氨酰胺Life technologies11960-044在 DMEM 中添加胎牛血清（FBS，1% 或 10% v/v）和 GlutaMAX 200 mM（1% v/v），然后使用 0.22 µm 滤器过滤除菌
胎牛血清（FBS）GIBCO10500-064
GlutaMAX 添加剂GIBCO35050038
(200 mM)
Corning 瓶顶式真空过滤系统Sigma-AldrichCLS430769
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS），无钙无镁GIBCO14190094
HEK293T 细胞American Tissue Culture CollectionCRL3216收到后立即解冻并按方案所述进行培养。经过最少次数的传代后，将部分细胞分装冻存以备将来使用。 始终使用传代次数低于20次的细胞。一旦培养细胞传代超过20次，需从冻存的分装细胞重新开始培养
细胞培养皿Greiner Cellstar639160直径15 cm的培养皿
细胞刮刀VWR10062-904
聚乙烯亚胺（PEI）Polyscience23966-2将粉末状 PEI 溶于去离子水（ddwater）中，配制成 1 µg/µL 的溶液，pH=2（使用 HCl 调节）。在烧杯中配制，搅拌 2–3 小时。溶解后，用 NaOH 将 pH 调回至 7。过滤除菌后，将重悬的储备液分装为 1 mL 每份，于 -20 °C 保存。PEI 分装液可多次冻融
Virkon 溶液Fisher ScientificNC9821357使用 Virkon 溶液对所有接触过组装病毒载体颗粒的材料进行消毒
长袖式 Mutexi 防护围裙Fisher Scientific11735423在常规实验服外穿戴围裙
Fisherbrand 最大防护型一次性鞋套Fisher Scientific15401952
AAV 纯化与脱盐
Optiprep 密度梯度介质Sigma-AldrichD1556Optiprep 是碘克沙醇在水中的 60%（w/v）溶液（无菌）。注意：在层流罩中操作，佩戴手套
酚红Sigma-AldrichP0290注意：在层流罩中操作
巴斯德移液管Sigma-AldrichZ627992使用前需灭菌
OptiSeal 聚丙烯管Beckman361625
苯并核酸酶（250 U/µL）Sigma-AldrichE1014以即用型溶液形式提供
Acrodisc 注射器滤器Pall corporation4614
Omnifix 注射器（5 mL）Braun4617053V
钝头注射器针头Sigma AldrichZ261378不锈钢 316 注射器针头，移液用钝头 90° 尖端，16 号，长度 4 英寸。文中称为钝端针头
Aqua EcotainerB. Braun0082479E无菌无内毒素水。文中称为“超纯水”
Amicon ultra-15 离心过滤装置MilliporeUFC910024通过连续离心步骤截留病毒载体颗粒，实现终产物的浓缩
Pluronic F68（100x）Thermo Fisher24040032非离子型表面活性剂。使用时用无菌 PBS 稀释至 0.01%（v/v）
Fisherbrand 带螺旋盖的无菌微量离心管（2 mL）Fisher Scientific02-681-374使用带裙边的管子以便于操作
AAV 滴定
限制性内切酶：StuI（10 U/µL）PromegaR6421
DNA酶 I（1 U/µL）Fisher ScientificEN0521
蛋白酶 KSigma-Aldrich3115852001用超纯水重悬，使用终浓度为 10 mg/mL。溶液可于 -20 °C 保存
EasyStrip Plus 管条（带附连盖）Fisher ScientificAB2000
Eppendorf 微量管 3810xSigma-AldrichZ606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I 主混合液Roche4707516001
LightCycler 多孔板，96 孔Roche4729692001白色聚丙烯板（带唯一识别条形码）
Microseal 'A' PCR 板及 PCR 板封膜Bio-Radmsa5001
AAV 纯度检测
过硫酸铵（APS）Sigma-AldrichA3678用超纯水配制成 10%（v/v）溶液。注意：在层流罩中操作，佩戴手套
四甲基乙二胺（TEMED）Sigma-AldrichT9281注意：在层流罩中操作，佩戴手套
Tris Base ULTROL 级Merck648311注意：在层流罩中操作，佩戴手套
UltraPure 琼脂糖Thermo Fisher16500-500
Rotiphorese® Gel 30（37.5:1）Carl Roth3029.330% 丙烯酰胺与双丙烯酰胺的水溶液，比例为 37.5:1。注意：在层流罩中操作，佩戴手套
Serva Blue GSigma-Aldrich6104-58-1
Precision Plus 预染蛋白 MarkerBio-Rad1610374edu
正丁醇（1-Butanol）Sigma-AldrichB7906注意：在层流罩中操作，佩戴手套
免疫组织化学
兔抗 GFP 抗体Synaptic Systems1320021:300 稀释
抗兔 Alexa Fluor 488 抗体InvitrogenA212061:1,000 稀释
设备公司货号备注
病毒载体生产实验室
Rotina 380 台式离心机 *Hettich1701
Optima XPN 80 超速离心机 *Beckmann CoulterA95765
Type 50.2 Ti 固定角钛转子 *Beckmann Coulter337901
Entris 电子天平 *Sartorius2202-1S
恒温水浴锅 *设定为 37 °C
冰桶 *VWR10146-290确保病毒载体生产实验室所用材料与常规实验区域所用材料分开
Pipetboy pro *Integra156,400
刻度移液管：Cell star *Greiner bio-one606180容量为 5 mL
刻度移液管：Cell star *Greiner bio-one607180容量为 10 mL
刻度移液管：Cell star *Greiner bio-one760180容量为 25 mL
CO2 培养箱 CB150 *Binder9040-0038设定为 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度
Nuaire 安全柜 NU 437-400E *Labexchange31324使用前后均需用 70% 乙醇和 Virkon 清洁所有表面
常规实验室
T100 热循环仪 *Bio-Rad1861096
LightCycler 480 仪器 II *Roche5015278001
ThermoMixer *EppendorfC 5382000015
Nanodrop *ThermoFisher ScientificND 2000
Mini-Protean Tetra 电泳槽*Bio-Rad1658001FC适用于手工制胶或预制胶
ProteoSilver 银染试剂盒Sigma-AldrichPROTSIL1高灵敏度蛋白检测，背景低
Centrifuge 5804 R *EppendorfB1_022628045适用于中等容量需求（最高 250 mL）的高速离心机
刻度移液管 Cell star *Greiner bio-one6061805 mL
刻度移液管 Cell star *Greiner bio-one60718025 mL
刻度移液管 Cell star *Greiner bio-one76018025 mL
滤芯吸头 *Greiner bio-one7502571250 µL
滤芯吸头 *Greiner bio-one738257300 µL
滤芯吸头 *Greiner bio-one77125710 µL
带盖冰桶 *VWR10146-290
Mini 隔膜真空泵，VP 86 *VWR181-0065
Pipetman P2GilsonF144801
Pipetman P20GilsonF123600
Pipetman P100GilsonF123615
Pipetman P200GilsonF123601
Pipetman P1000GilsonF123602
* 标有星号的材料为昂贵设备，通常为多个实验室共享的中心基础设施。如有替代品，可使用等效设备。注意：若使用不同的超速离心机，必须仔细选择匹配的转子和离心管。

参考文献

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