基于培养板的细胞毒性检测法用于评估大鼠胎盘自然杀伤细胞的杀伤功能

摘要

本文提供了一种通过比色板法分离并评估胎盘来源的自然杀伤细胞毒功能的详细方法。选用子宫灌注压降低的大鼠胎盘缺血模型，以展示通过抗体介导的方法分离并评估自然杀伤细胞毒功能的过程。

摘要

众所周知，蜕膜自然杀伤（NK）细胞在正常妊娠的建立与维持过程中发挥着关键作用。近期研究表明，在患有复发性流产和子痫前期等不良妊娠并发症的女性中，其循环系统及蜕膜中的NK细胞群体存在异常。本课题组的研究显示，妊娠期高血压与胎盘中活化NK细胞数量增加相关，该结论基于细胞表面活化标志物的表达情况。本文提供了一套详细的实验方案，用于评估在手术诱导胎盘缺血的子痫前期样动物模型中，从胎盘分离的NK细胞的细胞毒功能。文中详细描述了以下步骤：单细胞悬液的制备、NK细胞的分离、离体刺激、效应细胞与靶细胞的共培养，以及细胞毒性检测。

引言

子痫前期是一种妊娠期高血压疾病，其特征为胎儿生长受限、终末器官损伤以及慢性免疫系统激活。患有子痫前期的女性体内存在持续的免疫激活状态，导致循环系统和胎盘中炎症性细胞因子水平升高，CD4⁺ T细胞亚群失衡，以及活化的自然杀伤（NK）细胞数量增加¹。本实验室近期发表的研究表明，在子痫前期的子宫灌注压降低（RUPP）大鼠模型中，NK细胞参与了部分病理生理过程。通过流式细胞术检测NK细胞表面活化标志物的表达水平，发现与正常妊娠（NP）大鼠相比，RUPP大鼠的循环系统和胎盘中活化的NK细胞比例显著升高²。

为了验证流式细胞术的观察结果，对从正常妊娠（NP）和复发性不明原因流产模型（RUPP）大鼠胎盘中分离出的自然杀伤（NK）细胞进行了功能研究，以评估其细胞毒活性。目前有多种方法可用于评估细胞毒性CD8⁺ T细胞和NK细胞的细胞毒功能。功能性的细胞毒分析金标准是铬释放实验³。其他已开发并应用的方法包括流式细胞术⁴、成像细胞术⁵、钙黄绿素释放法⁶，以及最近发展的生物发光法⁷。本视频将详细介绍如何使用成熟的乳酸脱氢酶（....

方案

所有实验方案均经密西西比大学医学中心机构动物照护与使用委员会批准。动物的饲养与处理均遵循美国国立卫生研究院关于伦理动物治疗的指南。

1. 从胎盘中分离淋巴细胞

1. 取出一只大鼠子宫中的胎盘（妊娠第19天），置于10 mL冰冻的PBS⁸中。
2. 将一个胎盘放置在100 µm滤膜上，并放入含有13.5 mL RPMI和1.5 mL FBS（总体积为15 mL）的培养皿中。使用注射器活塞的平端将胎盘压过滤膜，使其进入培养皿中。
3. 为每份组织准备三个15 mL锥形管。向每根管中加入3 mL密度梯度介质（见材料表），然后小心地将5 mL匀浆后的胎盘组织覆盖在每根管的介质上方。
4. 在室温（RT）下以300 x g离心25分钟，禁止使用刹车。使用移液管收集薄层白色絮状层。
   注意：离心后可见三层：顶部为红色的RPMI层，中间为白色的絮状层，底部为透明的密度梯度介质层。使用移液管吸取管中的白色絮状层。将同一胎盘所有管中的絮状层合并至一根管中。
5. 向合并的絮状层中加入10 mL RPMI。在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。

结果

将从正常妊娠（NP）和RUPP大鼠获得的胎盘NK细胞与其各自培养基中的靶细胞以50:1（NK:靶细胞）的比例共同孵育5小时。在490 nm处记录吸光度，原始数据见表2。计算培养基背景孔和体积校正对照孔的平均吸光度。根据制造商提供的操作说明，从相应孔位的吸光度值中减去上述平均值，结果如表3所示。随后，利用校正后的数值并根据制造商提供的方案计算细胞毒性的百分比（%）（表4）。

1	2	3	4	5
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC

讨论

为获得最佳结果，需考虑若干关键要点。所用细胞的无菌性至关重要。在获取胎盘后，必须在生物安全柜内的无菌条件下进行自然杀伤细胞（NK细胞）的制备与分离。此外，由于所有细胞在受到损伤时均会释放乳酸脱氢酶（LDH），因此在分离后及共培养过程中应特别注意保持NK细胞的高存活率。NK细胞自发性释放过多LDH常会导致结果呈阴性，数据无法使用

本方案中某些方面将取决于使用者及其具体需求。例如，除本文所述方法外，还有多种从胎盘分离单个核细胞的方法，如机械法和酶消化法解离。此外，使用者需自行确定适合其实验的靶细胞最佳数量以及效应细胞与靶细胞的比例。在我们的实验中，10,000个靶细胞及50:1的效应细胞与靶细胞比例被确定为最优条件。这些数值可能因所选靶细胞类型及自然杀伤（NK）细胞来源组织的不同而有所变化。其他研究者已采用该方法评估从肝脏和脾脏分离的细胞的NK细胞功能⁹。因此，该方法可应用于多个研究领域，而不仅限于我们所选择的子痫前期研究。

细胞毒性评估的金标准是铬释放试验

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Fisher	5408129
100 µL 滤膜	Fisher	22363549	尼龙网膜
15 mL 圆底离心管	Fisher	0553859A
3 mL 注射器	Fisher	14823436
50 mL 圆底离心管	Fisher	7203510
6 孔细胞培养板	Corning	720083
96 孔组织培养板	CELLTREAT	229190	无菌，圆底
AOPI	Nexcelom	CS201065ML
细胞刮刀	Fisher	8100241
Cellometer 一次性计数板	Nexcelom	CHT4-SD100
Cellometer Vision 图像细胞计数仪	Nexcelom	N/A
Cytotox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒	Promega	G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi 试剂盒	Invitrogen	11061D
DynaMag-2 磁力架	Invitrogen	12321D
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-100G
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11150H
流式细胞术管	Corning	352008
Lymphoprep	Fisher	NC0460539	密度梯度介质；4 × 250 mL
PBS	Fisher	SH3025801	10 × 500 mL
青霉素/链霉素	Gibco	15140122
培养皿	Fisher	9720500	无垫片
纯化小鼠抗大鼠 CD161a 抗体	BD Biosciences	555006
纯化小鼠抗大鼠 CD3 抗体	BD Biosciences	554829
重组大鼠 IL-2	R&D Systems	502-RL
RPMI	Gibco	11875135	1640 培养基
T25 培养瓶	Corning	430639
胰蛋白酶	ThermoFisher	15090046
YAC-1 细胞	ATCC	TIB-160