本文提供了一种通过比色板法分离并评估胎盘来源的自然杀伤细胞毒功能的详细方法。选用子宫灌注压降低的大鼠胎盘缺血模型，以展示通过抗体介导的方法分离并评估自然杀伤细胞毒功能的过程。
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本文内容
摘要
摘要
众所周知，蜕膜自然杀伤（NK）细胞在正常妊娠的建立与维持过程中发挥着关键作用。近期研究表明，在患有复发性流产和子痫前期等不良妊娠并发症的女性中，其循环系统及蜕膜中的NK细胞群体存在异常。本课题组的研究显示，妊娠期高血压与胎盘中活化NK细胞数量增加相关，该结论基于细胞表面活化标志物的表达情况。本文提供了一套详细的实验方案，用于评估在手术诱导胎盘缺血的子痫前期样动物模型中，从胎盘分离的NK细胞的细胞毒功能。文中详细描述了以下步骤：单细胞悬液的制备、NK细胞的分离、离体刺激、效应细胞与靶细胞的共培养，以及细胞毒性检测。
引言
子痫前期是一种妊娠期高血压疾病，其特征为胎儿生长受限、终末器官损伤以及慢性免疫系统激活。患有子痫前期的女性体内存在持续的免疫激活状态，导致循环系统和胎盘中炎症性细胞因子水平升高，CD4+ T细胞亚群失衡，以及活化的自然杀伤（NK）细胞数量增加1。本实验室近期发表的研究表明，在子痫前期的子宫灌注压降低（RUPP）大鼠模型中，NK细胞参与了部分病理生理过程。通过流式细胞术检测NK细胞表面活化标志物的表达水平，发现与正常妊娠（NP）大鼠相比，RUPP大鼠的循环系统和胎盘中活化的NK细胞比例显著升高2。
为了验证流式细胞术的观察结果，对从正常妊娠（NP）和复发性不明原因流产模型（RUPP）大鼠胎盘中分离出的自然杀伤（NK）细胞进行了功能研究，以评估其细胞毒活性。目前有多种方法可用于评估细胞毒性CD8+ T细胞和NK细胞的细胞毒功能。功能性的细胞毒分析金标准是铬释放实验3。其他已开发并应用的方法包括流式细胞术4、成像细胞术5、钙黄绿素释放法6，以及最近发展的生物发光法7。本视频将详细介绍如何使用成熟的乳酸脱氢酶（LDH）释放实验，结合市售的LDH细胞毒性检测试剂盒，来测定NK细胞的细胞毒功能。
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方案
所有实验方案均经密西西比大学医学中心机构动物照护与使用委员会批准。动物的饲养与处理均遵循美国国立卫生研究院关于伦理动物治疗的指南。
1. 从胎盘中分离淋巴细胞
- 取出一只大鼠子宫中的胎盘（妊娠第19天），置于10 mL冰冻的PBS8中。
- 将一个胎盘放置在100 µm滤膜上，并放入含有13.5 mL RPMI和1.5 mL FBS（总体积为15 mL）的培养皿中。使用注射器活塞的平端将胎盘压过滤膜，使其进入培养皿中。
- 为每份组织准备三个15 mL锥形管。向每根管中加入3 mL密度梯度介质（见材料表），然后小心地将5 mL匀浆后的胎盘组织覆盖在每根管的介质上方。
- 在室温（RT）下以300 x g离心25分钟，禁止使用刹车。使用移液管收集薄层白色絮状层。
注意：离心后可见三层：顶部为红色的RPMI层，中间为白色的絮状层，底部为透明的密度梯度介质层。使用移液管吸取管中的白色絮状层。将同一胎盘所有管中的絮状层合并至一根管中。 - 向合并的絮状层中加入10 mL RPMI。在4 °C下以300 x g离心10分钟，弃去上清液。
2. 自然杀伤细胞的分离
- 重悬细胞沉淀于 50 μL 冰冷的PBS
- 根据制造商说明书，将生物素标记的 CD3 抗体加入细胞沉淀中，并用移液器充分混匀。将离心管置于旋转仪上，20 分钟 4 °C.
- 加入 1 mL RPMI，400 x g 离心 10 分钟 g 和 4 °C，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并与 150 μL 1.5 mL 微量离心管中的磁珠。将微量离心管置于管式旋转仪中，于30分钟孵育期间持续旋转 4 °C.
注意： 此时取出释放缓冲液，并在生物安全柜中放置至室温。 - 将试管置于磁铁上1分钟。收集上清液，并将CD3-细胞群体保存在冰上的15 mL离心管中。
注意： 这是CD3- 细胞群体 - 将离心管从磁铁上取下，加入1 mL RPMI培养基。用移液器将细胞和磁珠吹打混匀5次。
- 重复步骤 2.5。
- 离心 CD3- 细胞群在400 × g条件下离心10分钟 g 和 4 °C 弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 50 μL 冰冷的PBS
- 加入生物素标记的CD161a抗体至CD3- 按照制造商说明书处理细胞并充分混匀。将离心管置于旋转混合仪上，于20分钟内孵育 4 °C.
- 加入1 mL RPMI，400 x g离心10分钟 g 和 4 °C，弃去上清液。将沉淀重悬于1 mL RPMI中，并与 150 μL 1.5 mL 微量离心管中的磁珠
- 将微量离心管放入管式旋转仪中，于30分钟内持续旋转孵育 4 °C.
- 将试管置于磁架上1分钟。收集上清液，并弃去CD3-/CD161a- 细胞
- 从磁铁上取下离心管，加入1 mL RPMI。用移液器将细胞和磁珠吹打混匀5次。
- 重复步骤 2.12。
- 从磁力架上取下微量离心管，加入1 mL室温释放缓冲液。将离心管置于旋转仪上，室温孵育15分钟，同时旋转。
- 将离心管置于磁力架上1分钟。将上清液收集到新的15 mL圆底离心管中，置于冰上。
注意： 这是NK细胞群体。 - 从磁铁上取下离心管，加入1 mL室温RPMI。用移液器将细胞和磁珠吹打混匀5次。
- 重复步骤 2.16，将上清液置于同一管中。充分混匀并取样 20 μL 用于细胞计数的样品
注意： 将离心管置于冰上。 - 离心 CD3-/CD161a+ 细胞，10 分钟，400 x g 在 4 °C，然后移除上清液。将细胞重悬于RPMI（10% FBS，1% 青霉素/链霉素，2 ng/mL IL-2）中，并以3 × 10⁶细胞/mL的浓度接种5 6孔板中每孔加入2.5 mL NK细胞活化培养基，接种细胞至每孔细胞数为指定数量。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育48小时。 37 °C，5% CO₂2 在湿润的培养箱中。
3. 细胞毒性实验：从培养物中回收自然杀伤细胞或YAC1细胞，或传代细胞
注意：所有步骤必须在通风橱内进行。所有细胞管必须始终置于冰上。
- 使用玻璃刻度吸管从培养瓶中收集YAC1细胞及培养基，置于冰上的50 mL离心管中，充分混匀。取 20 µL 计数细胞。
- 将 YAC1 细胞以 300 x 旋转 10 分钟 g 和 4 °C细胞离心时进行计数。
- 向NK细胞6孔板的每个孔中加入胰蛋白酶/EDTA。轻敲孔板，放入培养箱中。
- 细胞在含胰蛋白酶/EDTA的溶液中于约5分钟孵育后 37 °C用无菌培养皿刮刀刮取培养板/培养瓶，每孔加入1 mL NK细胞培养基。
- 用移液管收集细胞和培养基，并转移至15 mL离心管中。取 20 µL 计数细胞。
- 将NK细胞以400 x g离心10分钟， g 在 4 °C在离心过程中，对步骤3.5中的细胞样品进行计数。
注意： 在丢弃培养板之前，先在显微镜下观察，确保孔底无残留贴壁细胞。由于本实验使用NK细胞和YAC1细胞，务必分别对两者进行计数 分别地. - 计数细胞，并根据优化试验确定的浓度重新悬浮，以测试合适的效应细胞与靶细胞比例。通过将细胞沉淀重悬于相应的培养基中，制备以下细胞浓度：YAC1 细胞浓度为 4 × 105 细胞/mL，且NK细胞为2 × 107 cells/mL
4. 细胞毒性检测：检测方案
- 使用圆底、经培养处理的 96 孔板，按照表 1建议设置实验板。该表显示了实验对照组和 3 组 NK 实验列。此设置可扩展至 96 孔板中的总共 10 组 NK 实验列。
- 将检测板在 250 ×g 条件下离心 4 分钟，以确保效应细胞与靶细胞充分接触。将 96 孔板置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育 5 小时，以实现靶细胞与效应细胞的充分接触及效应细胞对靶细胞的裂解。
注意：本方案可在此处暂停。 - 在收集上清液前 45 分钟，向靶细胞最大 LDH 释放孔（1E、1F、1G 和 1H 孔）各加入 10 µL 10× 裂解液，并将板放回加湿培养箱中。
- 孵育结束后，将板在 250 ×g 条件下离心 4 分钟。使用多通道移液器，从所有孔中转移 50 µL 等分试样至新的 96 孔平底检测板。
注意：移液时勿触碰孔底，以免将细胞转移至新的检测板。新的检测板不得使用经培养处理的板。 - 配制检测试剂。
- 待检测缓冲液升至室温后，将 12 mL 检测缓冲液加入一瓶底物混合物中，轻轻翻转并摇动至完全溶解。每瓶可满足两块 96 孔板的用量。
注意：检测缓冲液在解冻过程中应避光保存。使用前立即混匀。
- 待检测缓冲液升至室温后，将 12 mL 检测缓冲液加入一瓶底物混合物中，轻轻翻转并摇动至完全溶解。每瓶可满足两块 96 孔板的用量。
- 向步骤 4.6 所得检测板的所有孔中各加入 50 µL 检测试剂。用铝箔覆盖板以避光，并在室温下孵育 30 分钟。
注意：新配制的检测试剂应储存于冷冻室。试剂可稳定保存约 8 周。 - 向每孔加入 50 µL 终止液。加入终止液后 1 小时内读取吸光度值，并记录 490 nm 处的吸光度。代表性数据见表 2。
5. 结果计算
- 计算培养基背景孔的平均吸光度值，并从实验孔、靶细胞自发乳酸脱氢酶（LDH）释放孔和效应细胞自发LDH释放孔的所有吸光度值中减去该值。
- 计算体积校正对照孔的平均吸光度值，并从靶细胞最大LDH释放对照孔测得的吸光度值中减去该值。
- 使用步骤5.1和5.2中校正后的数值，代入以下公式计算每个效应细胞:靶细胞孔的细胞毒作用百分率。
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结果
将从正常妊娠（NP）和RUPP大鼠获得的胎盘NK细胞与其各自培养基中的靶细胞以50:1（NK:靶细胞）的比例共同孵育5小时。在490 nm处记录吸光度，原始数据见表2。计算培养基背景孔和体积校正对照孔的平均吸光度。根据制造商提供的操作说明，从相应孔位的吸光度值中减去上述平均值，结果如表3所示。随后，利用校正后的数值并根据制造商提供的方案计算细胞毒性的百分比（%）（表4）。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| TCS | VCC | ECSR-1 | ECSR-2 | ECSR-3 |
| TCS | VCC |
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讨论
为获得最佳结果，需考虑若干关键要点。所用细胞的无菌性至关重要。在获取胎盘后，必须在生物安全柜内的无菌条件下进行自然杀伤细胞（NK细胞）的制备与分离。此外，由于所有细胞在受到损伤时均会释放乳酸脱氢酶（LDH），因此在分离后及共培养过程中应特别注意保持NK细胞的高存活率。NK细胞自发性释放过多LDH常会导致结果呈阴性，数据无法使用
本方案中某些方面将取决于使用者及其具体需求。例如，除本文所述方法外，还有多种从胎盘分离单个核细胞的方法，如机械法和酶消化法解离。此外，使用者需自行确定适合其实验的靶细胞最佳数量以及效应细胞与靶细胞的比例。在我们的实验中，10,000个靶细胞及50:1的效应细胞与靶细胞比例被确定为最优条件。这些数值可能因所选靶细胞类型及自然杀伤（NK）细胞来源组织的不同而有所变化。其他研究者已采用该方法评估从肝脏和脾脏分离的细胞的NK细胞功能9。因此，该方法可应用于多个研究领域，而不仅限于我们所选择的子痫前期研究。
细胞毒性评估的金标准是铬释放试验
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披露
作者声明不存在任何利益冲突，无论是财务方面还是其他方面。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助项目R00HL130456、美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助项目P20GM104357，以及由美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所通过机构发展奖（IDeA）资助的密西西比州INBRE项目（资助号P20GM103476）支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL 滤膜 | Fisher | 22363549 | 尼龙网膜 |
| 15 mL 圆底离心管 | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL 注射器 | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL 圆底离心管 | Fisher | 7203510 | |
| 6 孔细胞培养板 | Corning | 720083 | |
| 96 孔组织培养板 | CELLTREAT | 229190 | 无菌，圆底 |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| 细胞刮刀 | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer 一次性计数板 | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision 图像细胞计数仪 | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi 试剂盒 | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 磁力架 | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 流式细胞术管 | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | 密度梯度介质；4 × 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 × 500 mL |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 培养皿 | Fisher | 9720500 | 无垫片 |
| 纯化小鼠抗大鼠 CD161a 抗体 | BD Biosciences | 555006 | |
| 纯化小鼠抗大鼠 CD3 抗体 | BD Biosciences | 554829 | |
| 重组大鼠 IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 培养基 |
| T25 培养瓶 | Corning | 430639 | |
| 胰蛋白酶 | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 细胞 | ATCC | TIB-160 |
参考文献
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