利用开源软件流程测量琼脂固定化活性污泥颗粒的形态与大小

摘要

活性污泥中颗粒的大小和形状是重要的参数，通常采用不同的方法进行测量。由于采样不具代表性、图像质量不佳以及分析参数的主观性，可能导致测量结果不准确。为了最大限度地减少这些误差并简化测量过程，我们提供了一项详细规定每个步骤的实验方案，包括一个开源软件分析流程。

摘要

实验用生物反应器（例如用于处理废水的反应器）中含有颗粒物，其大小和形状是重要的参数。例如，活性污泥絮体的大小和形状可以反映微观尺度下的运行状况，同时也直接影响污泥在沉淀池中的沉降性能。

颗粒的尺寸和形状看似是“简单”的测量参数，实则容易产生误导。在采样、成像和分析颗粒的过程中，常会遇到许多细微问题，而这些细节在非正式的实验方案中往往被忽视。采样方法可能存在偏差，或缺乏足够的统计效力；样品本身可能保存不佳，或在固定过程中发生改变；图像质量可能不足，颗粒重叠、景深、放大倍数以及各种噪声均可能导致结果不准确；若分析方法描述不清，则可能引入偏差，例如手动设定图像阈值和分割过程所导致的误差。

在保证可重复性的同时，经济性和通量也是理想的要求。一种经济、高通量的方法能够实现更频繁的颗粒测量，生成包含数千个颗粒的大量图像。该方法使用低成本试剂、常见的体视显微镜以及免费开源的分析软件，可获得可重复、易获取、可复现且部分自动化的实验结果。此外，该方法所产生的数据输出格式规范、定义清晰，易于被数据分析软件识别，从而简化实验室内部的分析工作，并促进不同实验室之间的数据共享。

本文介绍了一种详细的实验方案，涵盖了制备此类产品所需的各个步骤，包括：取样、样品制备及在琼脂中的固定、数字图像采集、数字图像分析，以及基于分析结果生成特定实验图表的示例。我们还提供了一个开源的数据分析流程，以支持本实验方案的实施。

引言

本方法旨在提供一种定义明确、可重复且部分自动化的技术，用于测定生物反应器中颗粒物的尺寸和形状分布，特别是含有活性污泥絮体和好氧颗粒的样品^1,2。该方法的设计初衷是提升我们现有内部实验方案的经济性、简便性、通量和可重复性^3,4，简化他人的颗粒测量工作，并促进数据的共享与比较。

颗粒测量分析主要分为两大类：直接成像法和基于光散射等特性的间接推断法⁵。尽管间接推断法可实现自动化且通量较大，但其设备成本较高。此外，虽然间接推断法能够准确测定颗粒的等效尺寸⁶，却无法提供详细的形态信息⁷。

由于需要形态数据，我们的方法基于直接成像。尽管已有一些高通量成像方法，但传统上它们要么需要昂贵的商用硬件，要么依赖定制化解决方案^8,9。我们的方法旨在使用常见且价格合理的硬件和软件，虽然通量有所降低，但所获得的颗粒图像数量仍远超过许多分析所需的最低数量¹⁰。

现有的实验方案可能未明确说明重要的取样和图像采集步骤。其他方案可能规定了会引入主观偏差的手动操作（例如临时设定阈值¹¹）。一种明确定义的、涵盖取样、固定和图像采集步骤，并结合免费分析软件的方法，将有助于提升实验室内部的图像分析质量以及不同实验室之间的结果可比性。本实验方案的主要目标是提供一套工作流程和工具，以实现不同实验室对同一样本获得可重复的结果。

除了标准化图像分析流程外，该流程生成的数据还记录在格式规范、定义明确的文件中¹²，适用于主流数据分析软件包^13,14，便于开展针对实验的特定分析（如自定义图表生成），并促进实验室之间的数据共享。

本方案特别适用于需要颗粒形状数据、无法使用推断方法、不希望自行开发图像分析流程，并希望方便地与他人共享数据的研究人员

方案

1. 收集样品用于颗粒分析

1. 确定特定反应器的取样体积，以产生足够用于统计分析¹⁰（>500个）且避免颗粒重叠的颗粒数量。
   1. 假设对于混合液悬浮固体（MLSS）浓度在250至5,000 mg/L之间的活性污泥样品，每份样品取0.5至2 mL的混合液已足够。
   2. 否则，使用0.5 mL、2 mL和5 mL样品分别制备三个测试琼脂平板（执行步骤1.2至2.7）。
   3. 通过肉眼观察，评估哪一个（如有）样品体积最符合步骤1.1中列出的标准。
   4. 如果0.5 mL样品仍存在颗粒重叠现象，则按照步骤1.1.2和1.1.3重复操作，取三份0.5 mL样品，分别加入0.5 mL、1 mL和2 mL磷酸盐缓冲液进行稀释，以确定在执行步骤2.1之前0.5 mL样品所需的稀释程度。
      注：步骤1.1至1.1.4仅需在每次实验开始时执行一次，或在反应器内容物发生变化导致后续测量不再满足步骤1.1所列标准时重新执行。
2. 从反应器充分混合的部分取代表性样品：用烧杯或50 mL离心管取约40 mL样品，轻轻混匀后，立即将已确定体积的均匀混合样品倒入15 mL离心管中。根据步骤1.1.4的结果，必要时对样品进行稀释。
   注：本方案可在此处暂停，样品可在冷藏条件下（4 °C）保存最多48小时。切勿冷冻样品。
   注意：常用的保存介质（如甲醛/甲酰胺）不适用。由于载片表面积较大，结合开放容器、光源产生的热量以及可能通风不良的显微镜系统，会带来不必要的安全隐患，而图像质量的提升却十分有限。

2. 准备染色且固定的琼脂平板颗粒

1. 向每个样品中加入 5 µL 的 1% (w/v) 亚甲蓝溶液，盖上盖子后轻轻倒置至少 3 次以混匀。室温下避光染色至少 5 分钟，但不得超过 30 分钟。
2. 每份样品准备约 10 mL 的 7.5% (w/v) 琼脂水溶液（使用去离子水配制）。
   注意：琼脂可预先制备，若经过灭菌可长期保存。可用琼脂糖替代，但对成像质量无明显改善。
3. 使用微波炉或水浴加热使琼脂融化，使用前稍作冷却。确保琼脂完全融化且易于倾倒；未完全融化的琼脂团块会导致染色不均，影响成像质量。
4. 将足量融化的 7.5% (w/v) 琼脂转移至离心管中，使管内总体积达到 6.5 至 9 mL。
5. 重新盖紧离心管盖子，轻轻倒置至少 3 次以充分混匀。
6. 操作时将管盖朝向无人方向或在通风橱内打开管盖。将管内混合物倒入 100 mm 塑料培养皿中，同时轻轻晃动培养皿，使液体均匀铺展，形成完整、平滑的涂层，并确保颗粒分布均匀。
   警告：琼脂余热可能导致管内产生轻微正压，常伴有可听见的嘶嘶声，并可能喷出少量高温琼脂液滴。
7. 将培养皿在室温下静置冷却至少 5 分钟，直至琼脂完全凝固。
   注意：本步骤可作为暂停点。将培养皿倒置并密封（例如使用密封塑料袋或封口膜），于 4 °C 冷藏保存，最长可存放 48 小时。

3. 使用体视显微镜和数码相机获取颗粒图像

1. 将未加盖的培养皿正面朝上放置在体视显微镜的载物台上，显微镜放大倍数应可调节至10倍至20倍。使用LED照明支架或光源板等设备，从下方以均匀的漫射光照射样品。
2. 打开图像采集软件，确保显微镜光路已设置为 照片，然后从相机列表中单击选择相应的相机。
3. 调整显微镜，使多个颗粒在软件的焦平面上呈现清晰、轮廓分明的大边缘。使用10-20倍的放大倍数测量颗粒，同时保持相对较深的焦平面。
   1. 暂时取下琼脂平板，将显微测微尺置于载物台上。调节细准焦螺旋，直至在图像采集软件中清晰聚焦显微测微尺的刻度。
   2. 若尚未进行校准，请记录当前放大倍数下的像素与微米比例。
      1. 将缩放比例设置为100%，方法是单击 缩放 > 实际大小 并选择 选项 > 校准 然后在主视图中将红色校准条沿微米尺的长轴对齐，使垂直条纹居中对准0和200 µm刻度。在 校准 在对话框中输入当前放大倍数和200 µm的实际长度。
   3. 如果已校准，请选择 放大倍数 从菜单栏中选择当前放大倍数，并确认校准。
      1. 选择 测量 > 线 > 任意 线. 单击显微测微尺0刻度与长轴的交点，再次单击200刻度与长轴的交点。正确的校准应显示约为200 µm。通过单击该线段，按删除键并按下确认以删除该线段 是 在确认框中。
         注意：选择相机和校准的说明是针对本硬件所使用的软件而设定的。其他成像软件中也应具备类似功能。其目的是确定图像的像素与微米比例，以实现对颗粒尺寸的准确测量。
4. 更换琼脂平板，并调节细准焦螺旋，以在成像软件中获得最清晰的细节。
5. 调整成像软件，以获得最佳图像质量。
   1. 将位深度增加至允许的最大值，方法是选中对应的单选按钮 位深度 面板的 相机 侧边栏。通过选择相应的单选按钮，将软件设置为采集灰度图像 颜色/灰度 面板的 相机 侧边栏
   2. 收起曝光度与直方图之间的任何已展开的侧边栏面板。将增益降至1.0，然后增加曝光时间，直至视口中出现清晰的图像，且直方图呈现为未在直方图框两端被截断的分布形态。
   3. 调整直方图以避免曝光过度或不足。在相机侧边栏的直方图面板中，将直方图的左边界滑动至最低值稍外侧，右边界滑动至最高值稍外侧。
6. 将图像另存为 未压缩的TIFF，包括在图像元数据中注明放大倍数信息，使用 文件 > 保存为 对话框中选择 TIFF 格式，并确保 保存并附带校准信息 选中该框。
   注意：保存图像元数据（包括空间校准）可能因采集程序的不同而有所差异。FIJI¹⁵，管道所使用的底层软件能够识别大多数常见变体。需要记录的重要信息包括像素高度、宽度及相关单位。
7. 使用移动载物台或手动移动培养板本身，选择下一个不与先前图像重叠的区域，沿培养板下行时交替采用从左到右和从右到左的路径，即所谓的“割草机式搜索模式”。重复步骤 3.6，直至获得足够图像，以涵盖至少 500 个肉眼估测的颗粒，数量更多则更佳。
   注意：其他模式（例如., 圆形、随机等）均可接受，但需予以说明。通过数字拼接将多张重叠图像组合成全景图像虽可实现，但所得文件体积显著增加，会严重阻碍后续处理，且可能引入拼接伪影，因此目前不推荐使用。
8. 成像分析完成后，保留培养板以备可能的后续成像。最终成像结束后，应按照生物废弃物处理规定妥善丢弃。

4. 测量并分析颗粒轮廓

1. 安装所需的图像分析软件包
   1. 按照以下网址的说明安装FIJI（美国国立卫生研究院ImageJ v1.52e的增强版本）：https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. 如果尚未安装，请按照以下网址的说明安装git：https://git-scm.com/downloads
   3. 通过克隆git代码仓库获取粒子分析代码¹⁶。
      1. 在命令行中输入以下命令以获取代码的最新版本：
         git clone https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. 根据克隆仓库顶层目录中的README.md文本文件中的说明安装分析代码。
            注意：推荐使用git，因为它会自动获取代码的最新版本。如果无法使用git，也可以在发布页面以zip文件形式下载代码：https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. 编辑一个文本文件，列出要处理的目录以及可选参数。参见examples/analysis子目录以获取参数列表和示例。
2. 在命令行中运行分析，输入以下命令：
   <FIJI-PATH>\ImageJ-win64.exe --console -macro SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis <paramsfile>
   其中 <FIJI-path> 是ImageJ-win64.exe所在目录，<paramsfile> 是描述分析设置的文本文件的位置
   注意：可执行文件的名称可能因FIJI安装的操作系统而异。根据图像的数量和大小，分析可能需要几分钟到几小时，并将自动运行。
3. 执行质量控制检查
   1. 检查指定输出目录中overlay子目录下的质量控制文件。注意存在虚假、遗漏或成像不佳的颗粒的图像，这些颗粒表现为与背景不匹配的阴影轮廓。参见图3中的示例。此时，颗粒数据已准备好用于实验特异性分析图表的生成。
4. 通过在分析代码中指定需忽略的文件和/或颗粒ID，来剔除整块平板或单个颗粒。参见代码仓库中的examples/censoring目录，获取相关的R和Python代码示例。
5. 使用图像分析结果生成实验特异性图表，每个图像的分析结果均以TIDY¹²格式存储在指定输出目录的results子目录中的逗号分隔文本文件中。参见examples/figures/R和examples/figures/Python子目录，了解如何读取结果文件的示例。

结果

生成的文件
如图1所示，每分析一幅图像将生成两个文件。第一个文件为逗号分隔值（CSV）文本文件，其中每一行对应一个独立的颗粒，各列描述颗粒的不同参数，如面积、圆形度和实心度，这些参数在ImageJ手册中有明确定义¹⁷。示例CSV文件作为补充信息提供，并包含在examples/data目录中。

图1： 图示化工作流程，描述本实验方案的四个主要步骤。

讨论

尽管图像分析系统具有较强的稳健性，并已采取质量控制步骤以确保剔除质量不佳的图像，但若在取样、培养皿制备和图像采集过程中对特定问题给予充分关注，可进一步提高数据的准确性以及通过质量控制的图像比例。

采样浓度
假设已采集具有代表性的样品，则最重要的步骤是确保样品中含有足够数量的颗粒，以实现具有代表性⁹且高效的分析，同时避免浓度过高导致颗粒重叠。

在总悬浮固体浓度较宽的范围内，这相当于约 0.5 至 2 mL 的混合液，但可能需要根据具体实验进行确定。过度浓缩、过度稀释以及合适颗粒浓度的示例见图5，可供参考。颗粒浓度也会影响染色效果。过度稀释可能导致染色过深、颗粒模糊，而稀释不足则可能导致颗粒对比度不够，难以实现最佳阈值分割。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 次氯酸钠溶液	Chlorox	31009	用于工作区消毒。
带盖 15 mL 离心管	Corning	430790	每个样品使用一个。
50 mL 锥形瓶	Corning	4980-50	其他容器也可使用，只要其容量可容纳 > 40 mL 样品并允许混合即可。
500 mL Kimax 瓶	Kimble-Chase	14395-50	或其他足以用于琼脂操作的容器
琼脂	BD	214010	固体，用于配制 7.5% 凝胶。每个样品使用 7 mL。
数据分析软件	N/A	N/A	建议使用 R 或 Python
去离子水	N/A	N/A	足量用于配制染色液和琼脂。若无法获得，自来水亦可。
台式计算机	N/A	N/A	图像分析对 CPU 要求不高，2017 年左右的普通台式机即可满足需求。
外置硬盘	Seagate	STEB5000100	非完全必需，但由于图像数量多且体积大，极为实用。建议存储容量为 2 TB 或以上。
FIJI	NIH	version 1.51d	版本基于 ImageJ 核心。插件在撰写时已更新。可从以下网址获取：https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	开源软件	version 2.19.1 或更高版本	可从以下网址获取：https://git-scm.com/
图像采集软件	ToupView	version 3.7.5177	任何与相机兼容的软件均可，可能随相机附带。应支持保存带有空间校准数据的 TIFF 图像。
机械式（X/Y）载物台	OMAX	A512	非完全必需，但可极大提高图像采集效率。
亚甲蓝	Fisher	M291-100	固体，用于配制 1% w/v 溶液。每个样品使用 5 µL 溶液。
显微镜相机	OMAX	A35140U	任何与显微镜兼容的数码相机。建议在 10 倍放大倍数下，分辨率至少达到每像素 5 µm，且每个颜色通道每像素动态范围至少为 8 位。
光学载物台测微尺	OMAX	A36CALM1	或其他足以进行空间校准的设备。
培养皿，100 mm	Fisher	FB0875712	每个样品使用一个。
个人防护装备（PPE）	N/A	N/A	标准实验服、手套和护目镜。
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	可在 GitHub 仓库获取：https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
体视/解剖显微镜	Nikon	SMZ-2T	应提供 10 至 20 倍放大倍数，并支持通过内置相机拍摄数字照片，或提供 CCD 相机安装接口。