利用开源软件流程测量琼脂固定化活性污泥颗粒的形态与大小

摘要

活性污泥中颗粒的大小和形状是重要的参数，通常采用不同的方法进行测量。由于采样不具代表性、图像质量不佳以及分析参数的主观性，可能导致测量结果不准确。为了最大限度地减少这些误差并简化测量过程，我们提供了一项详细规定每个步骤的实验方案，包括一个开源软件分析流程。

摘要

实验用生物反应器（例如用于处理废水的反应器）中含有颗粒物，其大小和形状是重要的参数。例如，活性污泥絮体的大小和形状可以反映微观尺度下的运行状况，同时也直接影响污泥在沉淀池中的沉降性能。

颗粒的尺寸和形状看似是“简单”的测量参数，实则容易产生误导。在采样、成像和分析颗粒的过程中，常会遇到许多细微问题，而这些细节在非正式的实验方案中往往被忽视。采样方法可能存在偏差，或缺乏足够的统计效力；样品本身可能保存不佳，或在固定过程中发生改变；图像质量可能不足，颗粒重叠、景深、放大倍数以及各种噪声均可能导致结果不准确；若分析方法描述不清，则可能引入偏差，例如手动设定图像阈值和分割过程所导致的误差。

在保证可重复性的同时，经济性和通量也是理想的要求。一种经济、高通量的方法能够实现更频繁的颗粒测量，生成包含数千个颗粒的大量图像。该方法使用低成本试剂、常见的体视显微镜以及免费开源的分析软件，可获得可重复、易获取、可复现且部分自动化的实验结果。此外，该方法所产生的数据输出格式规范、定义清晰，易于被数据分析软件识别，从而简化实验室内部的分析工作，并促进不同实验室之间的数据共享。

本文介绍了一种详细的实验方案，涵盖了制备此类产品所需的各个步骤，包括：取样、样品制备及在琼脂中的固定、数字图像采集、数字图像分析，以及基于分析结果生成特定实验图表的示例。我们还提供了一个开源的数据分析流程，以支持本实验方案的实施。

引言

本方法旨在提供一种定义明确、可重复且部分自动化的技术，用于测定生物反应器中颗粒物的尺寸和形状分布，特别是含有活性污泥絮体和好氧颗粒的样品^1,2。该方法的设计初衷是提升我们现有内部实验方案的经济性、简便性、通量和可重复性^3,4，简化他人的颗粒测量工作，并促进数据的共享与比较。

颗粒测量分析主要分为两大类：直接成像法和基于光散射等特性的间接推断法⁵。尽管间接推断法可实现自动化且通量较大，但其设备成本较高。此外，虽然间接推断法能够准确测定颗粒的等效尺寸⁶，却无法提供详细的形态信息⁷。

由于需要形态数据，我们的方法基于直接成像。尽管已有一些高通量成像方法，但传统上它们要么需要昂贵的商用硬件，要么依赖定制化解决方案^8,9。我们的方法旨在使用常见且价格合理的硬件和软件，虽然通量有所降低，但所获得的颗粒图像数量仍远超过许多分析所需的最低数量

方案

1. 收集样品用于颗粒分析

1. 确定特定反应器的取样体积，以产生足够用于统计分析¹⁰（>500个）且避免颗粒重叠的颗粒数量。
   1. 假设对于混合液悬浮固体（MLSS）浓度在250至5,000 mg/L之间的活性污泥样品，每份样品取0.5至2 mL的混合液已足够。
   2. 否则，使用0.5 mL、2 mL和5 mL样品分别制备三个测试琼脂平板（执行步骤1.2至2.7）。
   3. 通过肉眼观察，评估哪一个（如有）样品体积最符合步骤1.1中列出的标准。
   4. 如果0.5 mL样品仍存在颗粒重叠现象，则按照步骤1.1.2和1.1.3重复操作，取三份0.5 mL样品，分别加入0.5 mL、1 mL和2 mL磷酸盐缓冲液进行稀释，以确定在执行步骤2.1之前0.5 mL样品所需的稀释程度。
      注：步骤1.1至1.1.4仅需在每次实验开始时执行一次，或在反应器内容物发生变化导致后续测量不再满足步骤1.1所列标准时重新执行。
2. 从反应器充分混合的部分取代表性样品：用烧杯或50 mL离心管取约40 mL样品，轻轻混匀后，立即将已确定体积的均匀混合样品倒入15 mL离心管中。根据步骤1.1.4的结果，必要时对样品进行稀释。
   注：本方案可在此处暂停，样品可在冷藏条件下（4 °C）保存最多48小时。切勿冷冻样品。
   注意....

结果

生成的文件
如图1所示，每分析一幅图像将生成两个文件。第一个文件为逗号分隔值（CSV）文本文件，其中每一行对应一个独立的颗粒，各列则描述颗粒的不同参数，如面积、圆度和实心度，这些参数在ImageJ手册中有明确定义¹⁷。示例CSV文件作为补充信息提供，并包含在examples/data目录中。

图1： 描述本实验方案四个主要步骤的图示化工作流程。

讨论

尽管图像分析系统具有较强的稳健性，并已采取质量控制步骤以剔除质量较差的图像，但若在取样、培养板制备和图像采集过程中对特定问题给予充分关注，可进一步提高数据的准确性以及通过质量控制的图像比例。

采样浓度
假设已采集具有代表性的样品，则最重要的步骤是确保样品中含有足够数量的颗粒，以实现具有代表性⁹且高效的分析，同时避免浓度过高导致颗粒重叠。

在总悬浮固体浓度较宽的范围内，这相当于约 0.5 至 2 mL 的混合液，但可能需要根据具体实验进行确定。过度浓缩、过度稀释以及合适颗粒浓度的示例见图5，可供参考。颗粒浓度也会影响染色效果。过度稀释可能导致染色过深、颗粒模糊，而稀释不足则可能导致颗粒对比度不够，难以实现最佳阈值分割。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 次氯酸钠溶液	Chlorox	31009	用于工作区消毒。
带盖 15 mL 离心管	Corning	430790	每个样品使用一个。
50 mL 锥形瓶	Corning	4980-50	其他容器也可使用，只要其容量可容纳 > 40 mL 样品并允许混合即可。
500 mL Kimax 瓶	Kimble-Chase	14395-50	或其他足以用于琼脂操作的容器
琼脂	BD	214010	固体，用于配制 7.5% 凝胶。每个样品使用 7 mL。
数据分析软件	N/A	N/A	建议使用 R 或 Python
去离子水	N/A	N/A	足量用于配制染色液和琼脂。若无法获得，自来水亦可。
台式计算机	N/A	N/A	图像分析对 CPU 要求不高，2017 年左右的普通台式机即可满足需求。
外置硬盘	Seagate	STEB5000100	非完全必需，但由于图像数量多且体积大，极为实用。建议存储容量为 2 TB 或以上。
FIJI	NIH	version 1.51d	版本基于 ImageJ 核心。插件在撰写时已更新。可从以下网址获取：https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	开源软件	version 2.19.1 或更高版本	可从以下网址获取：https://git-scm.com/
图像采集软件	ToupView	version 3.7.5177	任何与相机兼容的软件均可，可能随相机附带。应支持保存带有空间校准数据的 TIFF 图像。
机械式（X/Y）载物台	OMAX	A512	非完全必需，但可极大提高图像采集效率。
亚甲蓝	Fisher	M291-100	固体，用于配制 1% w/v 溶液。每个样品使用 5 µL 溶液。
显微镜相机	OMAX	A35140U	任何与显微镜兼容的数码相机。建议在 10 倍放大倍数下，分辨率至少达到每像素 5 µm，且每个颜色通道每像素动态范围至少为 8 位。
光学载物台测微尺	OMAX	A36CALM1	或其他足以进行空间校准的设备。
培养皿，100 mm	Fisher	FB0875712	每个样品使用一个。
个人防护装备（PPE）	N/A	N/A	标准实验服、手套和护目镜。
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	可在 GitHub 仓库获取：https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
体视/解剖显微镜	Nikon	SMZ-2T	应提供 10 至 20 倍放大倍数，并支持通过内置相机拍摄数字照片，或提供 CCD 相机安装接口。