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方法文章

以胸腺为例的胚胎组织分离及鹌鹑-鸡嵌合器官的构建

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DOI：

10.3791/58965

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2019年2月16日

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

本文内容

摘要

本文提供了一种从鹌鹑和鸡胚胎中分离纯胚胎组织的方法，这些组织可被组合以形成体外嵌合器官。

摘要

分离胚胎组织的能力是建立鹌鹑-鸡嵌合体系统的关键步骤，该系统进而为揭示发育生物学中的关键过程做出了无可争议的贡献。

本文介绍了一种通过显微手术和酶消化法分离鹌鹑和鸡胚胎组织的优化方法，该方法在保持组织生物学特性的同时实现高效分离。分离后，将两种物种的组织在体外进行器官型共培养，持续48小时。由于鹌鹑与鸡的组织具有不同的核特征和分子标记，因此可被明确区分，从而能够研究异种组织间发生的细胞交互作用。因此，该方法是研究发育过程中复杂组织相互作用的有力工具，尤其适用于涉及高度动态空间变化的过程，例如咽部形态发生以及前肠内胚层来源器官的形成。该实验方法最初被建立用于研究胸腺早期发育阶段的上皮-间充质相互作用，其中分别从鹌鹑和鸡胚胎中分离出内胚层来源的胸腺原基和中胚层来源的间充质组织。

可通过将相关组织移植到鸡胚的尿囊绒毛膜（CAM）上，进一步检测其生成器官的能力。CAM能够提供营养并允许气体交换，从而支持外植组织的生长。经过10天的胚内发育后，可通过常规形态学方法分析收获的外植体中的嵌合器官。该方法还能够研究从器官发生的初始阶段（体外发育）到器官形成最终阶段（胚内发育）过程中不同组织的特异性贡献。

最后，这种改进的分离方法还能提供三维（3D）结构完整保存的胚胎组织，可用于组织特异性基因表达模式的高分辨率拓扑分析。

引言

20世纪70年代初，Le Douarin开发了一种优雅的鹌鹑-鸡嵌合体系统，为研究发育过程中细胞迁移和细胞间相互作用的作用开辟了新的途径1,2。该模型基于一个前提，即两种物种之间的细胞交换不会显著干扰胚胎发生，这一前提在后续用于研究包括神经系统和造血系统形成在内的多种发育过程时得到了证实1。以造血系统为例，最初正是利用鹌鹑-鸡嵌合体系统观察到了定植于胸腺上皮原基的造血前体细胞的周期性波动3。在此实验中，胸腺的预定区域——第三和第四咽囊（3/4PP）的内胚层——在鹌鹑（q）胚胎发育至15至30体节期［胚胎日龄（E）1.5–E2.5］时，通过机械和酶解方法分离获得。这些发育阶段对应于鸡Hamburger和Hamilton4（HH）分期的12–17期。分离操作首先使用胰蛋白酶进行酶解，使内胚层与附着的间充质解离。分离得到的内胚层被移植到宿主鸡（c）胚胎E3–E3.5（HH分期20–21期）的体壁中胚层区域。 该异源性间充质被认为对胸腺上皮发育具有"容许性"，并参与器官的形成3。随后，来自鸡宿主的连续多波血液来源的前体细胞侵入鹌鹑供体的胸腺上皮组织，参与宿主胚胎中胸腺的形成3。

最近，该方法的一种改良版本也被证明在研究胸腺早期形成过程中上皮-间充质相互作用方面具有重要意义5。在此方面，来自嵌合胚胎中异位胸腺形成所涉及的组织3，分别从供体和宿主胚胎中分离，并在体外进行共培养。改进后的方案用于分离鹌鹑第3/4咽囊内胚层（E2.5–E3）和鸡体壁中胚层（E2.5–E3）。简言之，通过显微手术分离胚胎组织，并进行体外胰蛋白酶消化。此外，根据组织类型和发育阶段，对酶消化条件、孵育温度和时间进行了优化（表1）。

接下来，将分离的组织置于器官型体外系统中共同培养48小时，方法如先前报道5,6。体外组织共培养可模拟胚胎中的局部细胞相互作用，克服了体内操作的一些限制。该系统特别适用于研究 复杂形态发生事件中的细胞相互作用，例如咽部器官的发育过程。

通过之前详细描述的CAM方法5,7,8，可进一步探究胸腺组织发生过程中各组织的贡献，以及异种组合形成胸腺的能力。简而言之，将体外培养的组织移植到cE8期鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）上，并在蛋内继续发育10天。随后，通过形态学分析评估所收获的组织外植体中胸腺的形成情况。与经典的鹌鹑-鸡嵌合体研究3类似，来源于鸡胚的造血祖细胞（HPCs）会定植于鹌鹑胸腺上皮组织，并被证实后续参与了器官的发育过程9,10。这些HPCs通过高度血管化的CAM从鸡胚迁移至异位形成的嵌合胸腺中5,7,8。利用物种特异性抗体（如QCPN单克隆抗体，靶向鹌鹑核周抗原）进行免疫组织化学染色，可特异性识别来源于鹌鹑的胸腺上皮组织，从而避免对组织特异性分子标记物的依赖。

该实验方法采用此前文献报道的两步法8，通过在体外和胚内发育过程中定期给予药理学试剂，实现对信号通路的调控。此外，外植组织可在实验过程中的任意时间点采集8。

最后，此处详述的分离方案能够保持胚胎组织的天然特性和三维结构，这对于揭示传统方法难以触及的胚胎区域原位基因表达模式尤为有用。此外，转录组分析方法（包括RNA-seq或微阵列）也可应用于分离的组织，无需依赖遗传标记，即可实现组织特异性的高通量"组学"分析。

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方案

所有这些实验均遵循里斯本医学院动物护理与伦理指南。

1. 受精鹌鹑蛋和鸡蛋的孵化

  1. 将受精的日本鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）卵置于38 °C的湿润培养箱中孵化3天。将卵（钝端朝上）垂直放置于气室中进行孵化。
    注意：通过在培养箱底部放置一个盛水容器以维持湿润环境。
  2. 将受精的鸡（Gallus gallus）卵置于38 °C的湿润培养箱中孵化2.5天。将卵水平放置，并用炭笔标记上侧，以确定胚胎位置。
    注意：进行本实验时，建议起始使用40枚鹌鹑卵和60枚鸡卵。

2. 分离含有胸腺原基预定区域的鹌鹑内胚层

注意：在无菌条件下进行卵操作时，应使用水平层流罩以及灭菌的器械和材料。

  1. 移除包含胸腺原基预定区域的胚胎部分，以及包含第3对咽弓的咽弓区域rd 和 4th 拱形（3/4PAR），如所述7,8.
    1. 用一个大型硼硅酸盐玻璃培养皿（100 mm × 50 mm；100 cm³）装满3用60 mL冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
    2. 使用弯头剪刀轻敲并切割孵化3天的鹌鹑蛋蛋壳，形成一个圆形小孔。在蛋的钝端一侧开孔，将蛋黄（含胚胎）转移至盛有冷PBS的容器中。
    3. 使用弯剪在卵黄膜外侧、卵黄囊血管之外剪开卵黄膜，将胚胎从卵黄中取出。
    4. 借助细镊子，将胚胎转移至一个小培养皿（60 mm × 30 mm；15 cm）中3) 加入10 mL冷的PBS。
    5. 使用移液管将胚胎转移至带有黑色底面的100 mm培养皿中（参见 材料表) 加入10 mL冷PBS，置于体视显微镜下。
    6. 按照先前所述方法解剖3/4PAR8.
    7. 用2 mL无菌巴斯德吸管吸取3/4PAR，转移至一个盛有冷PBS且已装至四分之三满的玻璃培养皿中。
  2. 通过胰蛋白酶消化法分离含有胸腺原基预定区域的内胚层（3/4PP 内胚层）。
    1. 使用刮勺和细镊子将3/4PAR转移至盛有冷胰蛋白酶溶液（8 mg/mL；用冷PBS将25 mg/mL溶液按1:3比例稀释）的玻璃培养皿中，液体体积约为培养皿容量的四分之三。
    2. 在冰上孵育1小时以进行酶消化。
      注意：酶消化的时间取决于发育阶段（表1).
    3. 将玻璃培养皿置于体视显微镜下（40x–60x放大倍数），以从3/4PAR中分离内胚层。
      注意：操作过程中所有表面和溶液均需保持低温。若组织解离耗时较长，应更换为新的冷胰蛋白酶溶液。>15 分钟）。作为照明光源，可使用体视显微镜或光纤中集成的LED灯，因其产热较少。
    4. 使用安装在持针器上的两把不锈钢显微手术刀，将内胚层与周围组织分离。
      注意：使用直径在 0.1 mm 至 0.2 mm 之间的微型手术刀，以及钳口开口直径为 0 mm 至 1 mm 的镍针持针器。
      1. 首先去除附着在咽部内胚层背侧表面的神经管和中胚层。
      2. 将胚胎背侧朝上，小心剥离并去除咽弓之间的间充质，暴露咽囊。在3/4PAR的两侧均执行此操作。
      3. 移除心管及前部咽囊周围间充质。
      4. 腹面朝上，切开2的外胚层nd 和 3rd 咽弓，并小心去除附着在咽囊上的间充质。在3/4PAR的另一侧重复此操作。此时应可见甲状腺原基。
      5. 用两把显微解剖刀去除附着在咽部内胚层上的任何残留间充质细胞。
      6. 在两者之间做一个横向切口nd 和 3rd PP，分离含有第3咽囊的咽部内胚层rd 和 4th 来自内胚层前部、含有甲状腺原基的囊泡以及2nd 咽囊
      7. 使用刮勺和细镊子，将分离出的3/4PP内胚层转移至一个装有四分之三体积的100%冷胎牛血清（FBS）的玻璃培养皿中。
  3. 将分离的组织置于冰上的玻璃培养皿中，直至体外检测开始。或者，可对分离的组织进行三维保存，并原位分析基因表达。

3. 鸡体壁中胚层的分离

注意：使用水平层流罩以及无菌器械和材料，在无菌条件下进行卵的操作处理。

  1. 移除包含体节19-24（ss19-24）水平体壁中胚层的胚胎区域。
    1. 在孵化2.5天后，从孵化器中取出鸡卵。
    2. 使用弯头剪刀在蛋壳上开一个小孔。插入针头，用10 mL注射器抽吸2 mL蛋白液，以降低蛋内蛋白体积，防止损伤位于蛋壳标记区域下方的胚胎。将抽吸出的蛋白液弃去。
    3. 使用弯头剪刀在蛋壳的标记区域切出一个圆形孔洞（直径约为蛋壳顶部表面积的三分之二）。
    4. 用细镊子固定胚胎，同时在胚外血管外侧剪开卵黄膜。
    5. 在体视显微镜下，将胚胎转移至一个底部为黑色的100 mm培养皿中，内含10 mL冷PBS。
      注：从此时起，使用体视显微镜进行后续显微外科操作的逐步放大观察。
    6. 使用四枚细昆虫针将胚胎固定在培养皿底部，针尖插入胚外区域，呈方形排列。
    7. 使用韦克尔眼科剪刀，在体节19至24之间沿垂直于胚胎轴的方向进行两条横切，贯穿整个胚胎区域。
    8. 通过剪除胚胎边缘部分，释放体节19-24（ss19-24）的胚胎组织片段。
    9. 用2 mL无菌巴斯德移液管抽吸ss19-24组织，并转移至一个装有四分之三体积冷PBS的玻璃培养皿中。
  2. 通过胰蛋白酶（8 mg/mL；用冷PBS将25 mg/mL原液稀释至1:3）消化法，从体壁中胚层区域（ss19-24）分离侧中胚层。
    1. 借助解剖铲和细镊子，将ss19-24组织转移至一个装有四分之三体积冷胰蛋白酶溶液的玻璃培养皿中。
    2. 将样品置于冰上孵育30分钟，以进行酶消化。
    3. 在体视显微镜下，使用持针器夹持两把显微解剖刀，从周围组织中分离中胚层。
      注：整个操作过程中须保持所有器皿和溶液处于低温状态。若组织解剖耗时较长（>10分钟），应更换为新的冷胰蛋白酶溶液。照明光源建议使用体视显微镜或光纤中集成的LED灯，以减少热负荷。
    4. 在分离中胚层过程中，首先去除表面的外胚层，随后小心分离腹侧的脏壁中胚层组织。
    5. 沿神经管平行方向进行切割，释放体壁中胚层的右侧侧中胚层。
    6. 重复上述操作，分离胚胎左侧的中胚层。
      注：此步骤中应缓慢移动显微解剖刀。暴露的细胞外基质蛋白易黏附于组织和器械表面，阻碍流畅操作。
    7. 借助解剖铲和细镊子，将分离出的中胚层转移至一个装有四分之三体积冷胎牛血清（FBS）的玻璃培养皿中。
  3. 在体外实验准备期间，将盛有分离组织的玻璃培养皿置于冰上保存。

4. 体外 器官型实验：鹌鹑3/4前肠内胚层与鸡体壁中胚层的异源性结合

  1. 使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep）的RPMI-1640培养基配制培养液3,5。
  2. 在35 mm的培养皿中放入金属网格，并加入5 mL培养基。
    注意：去除多余的液体，使培养基液面与网格顶部齐平。
  3. 借助细镊子将膜滤器浸入培养基中，然后将其放置在网格上方，使膜的一侧暴露于空气中。
    注意：直径为13 mm的膜面积的四分之一足以满足组织贴附需求。
  4. 在体视显微镜下，将分离的组织贴附于膜滤器表面。首先用移植匙（或刮刀）和细镊子轻轻滑动，将3/4PP内胚层（步骤2）从玻璃培养皿中转移至膜上。对分离的中胚层（步骤3）重复此操作。
    注意：借助显微手术刀轻轻搅动，使组织充分混合并紧密贴合。
  5. 将已贴附的组织小心置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养48小时。培养后的组织可移植至尿囊绒毛膜（CAM）上。
    注意：CAM中异位器官形成的实验方法已有详细描述8。

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结果

本方案详细描述了一种分离禽类胚胎组织的方法，可用于多种细胞和发育生物学技术。该方法此前已被用于研究胸腺早期形成过程中的上皮-间充质相互作用5。本文在图1和图2中展示了采用类似方法获得的新结果。

咽部器官示意图及鸡胚第3.5天BMP7与音猬因子（Sonic Hedgehog）表达图像。
图1。三维保存的咽部内胚层（包含胸腺原基预定区域）基因表达研究的代表性结果

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讨论

本文所述的胚胎组织分离方法在先前技术的基础上进行了改进，可在不同的生物学背景下制备鹌鹑-鸡嵌合胚胎3,5,6。

该方法适用于分离纯的胚胎组织，无需进行基因操作或使用组织特异性标记物，而这些标记物通常尚未明确，限制了转基因动物模型的应用。该方法可用于研究发育过程中的上皮-间充质相互作用，其中分离纯组织的能力是限制因素。例如，随着发育的进行，组织会变得更厚、更致密，并与邻近的其他组织发生粘连，导致分离更加困难。因此，该分离方法不适用于发育的后期阶段，即器官发生晚期。

该方法可用于研究三维保存的胚胎组织中的基因表达，具有独特性。为确保分离组织的三维完整性，整个操作过程中仪器、材料和溶液均应保持低温。

组织显微解剖步骤同样至关重要，不仅依赖于实验条件的仔细设定（例如酶消化的温度和时间，如

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢伊莎贝尔·阿尔科比亚对稿件的审阅，感谢马里奥·亨里克斯对视频的解说，以及里斯本大学里斯本医学院发育组织学与生物学研究所组织学服务中心的维托·普罗亚提供的技术支持。我们特别感谢里斯本大学里斯本医学院视听单元的保罗·卡埃罗和雨果·席尔瓦，他们在本视频制作过程中表现出卓越的投入与奉献。我们感谢徕卡显微系统公司慷慨提供配备视频系统的体视显微镜，感谢Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. 提供鹌鹑受精卵。本研究由里斯本大学里斯本医学院（FMUL）资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鸡受精卵（Gallus gallus）Pintobar，葡萄牙家禽养殖场 
鹌鹑受精卵（Coturnix coturnix）Interaves，葡萄牙鸟类养殖场 
15 mL PP离心管Corning430052
50 mL PP离心管Corning430290
60 × 20 mm Pyrex培养皿Duran集团21 755 41
100 × 20 mm Pyrex培养皿Duran集团21 755 48
金属网架Goodfellows细网目 不锈钢网架
膜过滤器MilliporeDTTP013000.6 mm Isopore膜过滤器
培养皿，35 × 10 mmSigma-AldrichP5112 
60 × 30 mm Pyrex小碗（小号）超市购买 
100 × 50 mm Pyrex大碗（大号）超市购买 
移液管Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL塑料移液管
玻璃巴斯德移液管Normax5426015
透明塑料胶带超市购买 
细胞角蛋白（泛酸性和碱性，I型和II型细胞角蛋白），克隆Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
胎牛血清Invitrogen, Thermo Fisher Scientific标准FBS
胰酶Sigma-AldrichP-3292根据制造商说明配制25 mg/mL溶液；离心并过滤后分装，于-20ºC保存。分装样品可冷冻保存数年。
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
青霉素-链霉素Invitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPN抗体发育研究杂交瘤库QCPN
RPMI 1640培养基，含GlutaMAX补充剂 GIBCO, Thermo Fisher Scientific61870010
Bluesil RTV141A/B硅胶弹性体1.1 kg套装ELKEM/SilmidRH141001KG用于制备培养皿的底座
Dumont #5镊子Fine Science Tools11251-30 细镊子
超细弯头博纳剪刀Fine Science Tools14085-08弯头剪刀
昆虫针 Fine Science Tools26001-300.3 mm不锈钢针
微型刮勺 Fine Science Tools10087-12移植勺
Minutien针（0.2 mm）Fine Science Tools26002-200.2 mm不锈钢微型手术刀
Minutien针（0.1 mm）Fine Science Tools26002-100.1 mm不锈钢微型手术刀
Moria镀镍针夹Fine Science Tools26016-12镀镍针夹
Moria带孔勺Fine Science Tools10370-17捞取勺
Wecker眼科剪刀Fine Science Tools15010-11
相机Leica Microsystems MC170 HD
显微镜Leica Microsystems DM2500
NanoZoomer S360 数字 切片扫描仪 滨松光子学C13220-01
体视显微镜Leica Microsystems Leica M80

参考文献

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