本文提供了一种从鹌鹑和鸡胚胎中分离纯胚胎组织的方法，这些组织可被组合以形成体外嵌合器官。
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本文内容
摘要
摘要
分离胚胎组织的能力是建立鹌鹑-鸡嵌合体系统的关键步骤，该系统进而为揭示发育生物学中的关键过程做出了无可争议的贡献。
本文介绍了一种通过显微手术和酶消化法分离鹌鹑和鸡胚胎组织的优化方法，该方法在保持组织生物学特性的同时实现高效分离。分离后，将两种物种的组织在体外进行器官型共培养，持续48小时。由于鹌鹑与鸡的组织具有不同的核特征和分子标记，因此可被明确区分，从而能够研究异种组织间发生的细胞交互作用。因此，该方法是研究发育过程中复杂组织相互作用的有力工具，尤其适用于涉及高度动态空间变化的过程，例如咽部形态发生以及前肠内胚层来源器官的形成。该实验方法最初被建立用于研究胸腺早期发育阶段的上皮-间充质相互作用，其中分别从鹌鹑和鸡胚胎中分离出内胚层来源的胸腺原基和中胚层来源的间充质组织。
可通过将相关组织移植到鸡胚的尿囊绒毛膜（CAM）上，进一步检测其生成器官的能力。CAM能够提供营养并允许气体交换，从而支持外植组织的生长。经过10天的胚内发育后，可通过常规形态学方法分析收获的外植体中的嵌合器官。该方法还能够研究从器官发生的初始阶段（体外发育）到器官形成最终阶段（胚内发育）过程中不同组织的特异性贡献。
最后，这种改进的分离方法还能提供三维（3D）结构完整保存的胚胎组织，可用于组织特异性基因表达模式的高分辨率拓扑分析。
引言
20世纪70年代初，Le Douarin开发了一种优雅的鹌鹑-鸡嵌合体系统，为研究发育过程中细胞迁移和细胞间相互作用的作用开辟了新的途径1,2。该模型基于一个前提，即两种物种之间的细胞交换不会显著干扰胚胎发生，这一前提在后续用于研究包括神经系统和造血系统形成在内的多种发育过程时得到了证实1。以造血系统为例，最初正是利用鹌鹑-鸡嵌合体系统观察到了定植于胸腺上皮原基的造血前体细胞的周期性波动3。在此实验中，胸腺的预定区域——第三和第四咽囊（3/4PP）的内胚层——在鹌鹑（q）胚胎发育至15至30体节期［胚胎日龄（E）1.5–E2.5］时，通过机械和酶解方法分离获得。这些发育阶段对应于鸡Hamburger和Hamilton4（HH）分期的12–17期。分离操作首先使用胰蛋白酶进行酶解，使内胚层与附着的间充质解离。分离得到的内胚层被移植到宿主鸡（c）胚胎E3–E3.5（HH分期20–21期）的体壁中胚层区域。 该异源性间充质被认为对胸腺上皮发育具有"容许性"，并参与器官的形成3。随后，来自鸡宿主的连续多波血液来源的前体细胞侵入鹌鹑供体的胸腺上皮组织，参与宿主胚胎中胸腺的形成....
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方案
所有这些实验均遵循里斯本医学院动物护理与伦理指南。
1. 受精鹌鹑蛋和鸡蛋的孵化
- 将受精的日本鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）卵置于38 °C的湿润培养箱中孵化3天。将卵（钝端朝上）垂直放置于气室中进行孵化。
注意：通过在培养箱底部放置一个盛水容器以维持湿润环境。 - 将受精的鸡（Gallus gallus）卵置于38 °C的湿润培养箱中孵化2.5天。将卵水平放置，并用炭笔标记上侧，以确定胚胎位置。
注意：进行本实验时，建议起始使用40枚鹌鹑卵和60枚鸡卵。
2. 分离含有胸腺原基预定区域的鹌鹑内胚层
注意：在无菌条件下进行卵操作时，应使用水平层流罩以及灭菌的器械和材料。
- 移除包含胸腺原基预定区域的胚胎部分，以及包含第3对咽弓的咽弓区域rd 和 4th 拱形（3/4PAR），如所述7,8.
- 用一个大型硼硅酸盐玻璃培养皿（100 mm × 50 mm；100 cm³）装满3用60 mL冷的磷酸盐缓....
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结果
本方案详细描述了一种分离禽类胚胎组织的方法，可用于多种细胞和发育生物学技术。该方法此前已被用于研究胸腺早期形成过程中的上皮-间充质相互作用5。本文在图1和图2中展示了采用类似方法获得的新结果。
图1。三维保存的咽部内胚层（包含胸腺原基预定区域）基因表达研究的代表性结果
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讨论
本文所述的胚胎组织分离方法在先前技术的基础上进行了改进，可在不同的生物学背景下制备鹌鹑-鸡嵌合胚胎3,5,6。
该方法适用于分离纯的胚胎组织，无需进行基因操作或使用组织特异性标记物，而这些标记物通常尚未明确，限制了转基因动物模型的应用。该方法可用于研究发育过程中的上皮-间充质相互作用，其中分离纯组织的能力是限制因素。例如，随着发育的进行，组织会变得更厚、更致密，并与邻近的其他组织发生粘连，导致分离更加困难。因此，该分离方法不适用于发育的后期阶段，即器官发生晚期。
该方法可用于研究三维保存的胚胎组织中的基因表达，具有独特性。为确保分离组织的三维完整性，整个操作过程中仪器、材料和溶液均应保持低温。
组织显微解剖步骤同样至关重要，不仅依赖于实验条件的仔细设定（例如酶消化的温度和时间，如
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢伊莎贝尔·阿尔科比亚对稿件的审阅，感谢马里奥·亨里克斯对视频的解说，以及里斯本大学里斯本医学院发育组织学与生物学研究所组织学服务中心的维托·普罗亚提供的技术支持。我们特别感谢里斯本大学里斯本医学院视听单元的保罗·卡埃罗和雨果·席尔瓦，他们在本视频制作过程中表现出卓越的投入与奉献。我们感谢徕卡显微系统公司慷慨提供配备视频系统的体视显微镜，感谢Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. 提供鹌鹑受精卵。本研究由里斯本大学里斯本医学院（FMUL）资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 鸡受精卵（Gallus gallus） | Pintobar，葡萄牙 | 家禽养殖场 | |
| 鹌鹑受精卵（Coturnix coturnix） | Interaves，葡萄牙 | 鸟类养殖场 | |
| 15 mL PP离心管 | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP离心管 | Corning | 430290 | |
| 60 × 20 mm Pyrex培养皿 | Duran集团 | 21 755 41 | |
| 100 × 20 mm Pyrex培养皿 | Duran集团 | 21 755 48 | |
| 金属网架 | Goodfellows | 细网目 不锈钢网架 | |
| 膜过滤器 | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore膜过滤器 |
| 培养皿，35 × 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 × 30 mm Pyrex小碗（小号） | 超市购买 | ||
| 100 × 50 mm Pyrex大碗（大号） | 超市购买 | ||
| 移液管 | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL塑料移液管 |
| 玻璃巴斯德移液管 | Normax | 5426015 | |
| 透明塑料胶带 | 超市购买 | ||
| 细胞角蛋白（泛酸性和碱性，I型和II型细胞角蛋白），克隆Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 标准FBS | |
| 胰酶 | Sigma-Aldrich | P-3292 | 根据制造商说明配制25 mg/mL溶液；离心并过滤后分装，于-20ºC保存。分装样品可冷冻保存数年。 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN抗体 | 发育研究杂交瘤库 | QCPN | |
| RPMI 1640培养基，含GlutaMAX补充剂 | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B硅胶弹性体1.1 kg套装 | ELKEM/Silmid | RH141001KG | 用于制备培养皿的底座 |
| Dumont #5镊子 | Fine Science Tools | 11251-30 | 细镊子 |
| 超细弯头博纳剪刀 | Fine Science Tools | 14085-08 | 弯头剪刀 |
| 昆虫针 | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm不锈钢针 |
| 微型刮勺 | Fine Science Tools | 10087-12 | 移植勺 |
| Minutien针（0.2 mm） | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm不锈钢微型手术刀 |
| Minutien针（0.1 mm） | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm不锈钢微型手术刀 |
| Moria镀镍针夹 | Fine Science Tools | 26016-12 | 镀镍针夹 |
| Moria带孔勺 | Fine Science Tools | 10370-17 | 捞取勺 |
| Wecker眼科剪刀 | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| 相机 | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| 显微镜 | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 数字 切片扫描仪 | 滨松光子学 | C13220-01 | |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | Leica M80 |
参考文献
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to t....
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