一种碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接细胞间通讯检测方法

摘要

本文介绍了一种新型的缝隙连接细胞间通讯检测方法，专为药物发现和毒理学评估中高通量筛选调节缝隙连接的化学物质而设计。

摘要

间隙连接（GJs）是细胞膜通道，允许相邻细胞间扩散分子量小于1 kDa的分子。由于间隙连接具有生理和病理作用，因此在药物发现和毒理学研究中需要高通量筛选（HTS）检测方法来鉴定GJ调节剂。一种新型的碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接-细胞间通讯（I-YFP-GJIC）检测法满足了这一需求。该方法是一种基于细胞的检测体系，包含受体细胞和供体细胞，分别被改造为稳定表达一种黄色荧光蛋白（YFP）变体或SLC26A4（一种碘离子转运体）。其中YFP的荧光可被碘离子高度敏感地淬灭。当向两种细胞的混合培养物中加入碘离子后，碘离子通过供体细胞中的SLC26A4转运体进入细胞，并经由间隙连接扩散至相邻的受体细胞，在受体细胞中淬灭YFP的荧光。YFP荧光信号可在微孔板中以动力学模式逐孔测定。YFP荧光的淬灭速率反映了间隙连接的活性。该检测方法可靠且快速，适用于高通量筛选。本文描述了在人胶质瘤细胞LN215中应用I-YFP-GJIC检测法的实验方案。

引言

间隙连接（GJs）作为细胞间通道，允许相邻细胞之间扩散分子量小于<1 kDa的小分子，如营养物质、代谢物和信号分子。连接结构包括每个细胞中的一个半通道（亦称连接子），每个连接子由六个连接蛋白（Cxs）组成¹。间隙连接及其连接蛋白已应用于多环芳烃（PAH）等致癌物的毒理学检测，因为多环芳烃是间隙连接的抑制剂^2,3,4。间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能障碍与非基因毒性致癌作用相关^5,6。作为潜在的治疗靶点，间隙连接已被报道参与特定类型的癫痫发作^7,8、心脑缺血/再灌注损伤的保护⁹、伴有先兆的偏头痛¹⁰、药物性肝损伤^6,11以及伤口愈合¹²。为了药物发现、毒理学检测以及鉴定调控间隙连接活性的新型细胞因子，需要高通量筛选（HTS）检测方法。高通量筛选检测还可用于研究间隙连接调节剂的构效关系^2,13,14,15。

一些间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）检测方法包括染料转移法和双膜片钳技术。在染料转移实验中，已使用 Lucifer yellow CH（LY）和钙黄绿素乙酰甲酯（calcein-AM）。细胞膜对 LY 不通透，需通过显微注射、刮擦加样或电穿孔将其导入细胞内。一旦进入细胞，LY 即可扩散至邻近细胞。 通过 通过 Lucifer Yellow（LY）迁移的程度来检测间隙连接（GJs）及间隙连接活性¹⁶钙黄绿素-AM检测通常涉及光漂白后荧光间隙恢复^17,18钙黄绿素-AM（Calcein-AM）是一种可穿透细胞膜的染料，进入细胞后被细胞内固有的酯酶水解转化为不可透过膜的钙黄绿素。该实验需使用共聚焦显微镜，通过激光漂白目标细胞后，观察周围细胞中的钙黄绿素-AM向漂白细胞内的转移情况。若存在功能性的间隙连接（GJs），相邻细胞中的钙黄绿素-AM会进入被漂白的细胞，从而恢复荧光信号。间隙连接活性通过漂白细胞荧光恢复的程度进行评估。染料传递实验操作繁琐、耗时较长，或灵敏度较低。双膜片钳技术是一种电生理学方法，用于测量连接电导，其灵敏度相对较高，且电导值直接依赖于开放的间隙连接数量。¹⁹；然而，该技术操作难度高、耗时且成本昂贵²⁰I-YFP-GJIC 分析法已开发用于高通量筛选（HTS）。

图1展示了I-YFP GJIC检测法的组成部分和实验步骤，该方法利用表达碘离子敏感型YFP突变体（H148Q和I152L，即YFP^QL）的受体细胞，以及表达碘离子转运蛋白（SLC26A4）的供体细胞²¹。YFP^QL所携带的这两个突变使得其荧光可被碘离子淬灭²²。将碘离子加入共培养的受体细胞和供体细胞中；碘离子无法直接进入受体细胞，但可被供体细胞表面的SLC26A4转运蛋白摄取。供体细胞内的碘离子通过功能正常的间隙连接（GJ）扩散至相邻的受体细胞，在其中淬灭YFP^QL的荧光信号。若间隙连接处于关闭状态或被抑制剂阻断，则碘离子无法进入受体细胞，因而不能引起荧光淬灭。YFP^QL的荧光淬灭速率反映了间隙连接的活性。I-YFP GJIC检测法操作简便且耗时较短，适用于高通量筛选（HTS），可在相对较短时间内评估大量化合物对间隙连接活性的影响。该方法仅需受体细胞和供体细胞，以及两种平衡盐溶液。下述实验方案基于主要表达Cx43的LN215细胞系²¹。LN215-YFP^QL受体细胞和LN215-I⁻供体细胞系通过慢病毒转导分别表达YFP^QL或SLC26A4而构建获得^21,23。

方案

1. 表达 YFP^QL 和 SLC26A4 的慢病毒的制备

1. 在100 mm培养皿中将HEK293T人胚肾细胞培养至80%汇合度。本方案中用于维持HEK293T及其他下述细胞的培养基为添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
2. 向6孔板的每孔中加入2 mL无菌的0.005%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液，孵育10分钟以包被培养板。吸除PLL溶液，并用2 mL无菌水冲洗表面两次。
3. 用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤HEK293T细胞，然后在每个100 mm培养皿中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C处理3分钟。加入5 mL培养基重悬细胞。
4. 用血细胞计数板计数细胞，并将细胞悬液密度调整为250,000个细胞/mL，取2 mL接种至已包被赖氨酸的6孔板每孔中，即每孔接种500,000个细胞。将细胞置于37 °C、含5% CO₂/95%空气的湿润环境中培养24小时，随后更换为不含青霉素和链霉素的DMEM培养基。
5. 在1.5 mL离心管中，将20 µL转染试剂用500 µL不含血清和抗生素的DMEM稀释。轻轻吹打混匀，室温静置5分钟。
6. 同时，在两个1.5 mL离心管中各加入250 µL DMEM，然后分别加入1500 ng pLVX-EIP-YFP^QL 或 pLenti6P-SLC26A4、1225 ng psPAX2 和 375 ng pMD2.G。这两种慢病毒质粒此前已有描述²¹。向每个含质粒的离心管中加入250 µL稀释后的转染试剂，轻轻混匀，室温孵育20分钟。
7. 20分钟后，将1.5 mL离心管中的转染试剂与质粒复合物500 µL逐滴加入第1.4步中的每个培养孔中，并通过前后轻轻摇动培养板混匀。将细胞置于37 °C CO₂培养箱中继续孵育12小时。
8. 更换为2.5 mL新鲜培养基，继续培养48小时。随后将培养板置于冰上5分钟，使含有慢病毒的条件培养基保持低温，以维持其感染活性。
9. 收集含有慢病毒的培养上清液，转移至15 mL锥形离心管中。在4 °C下以3,000 × g 离心3分钟，随后通过0.4 µm滤膜过滤去除上清液中的漂浮HEK293T细胞。
10. 含慢病毒的培养基可于4 °C保存并在2天内使用。如需长期保存，可将200 µL分装后于−80 °C冻存。

2. 通过慢病毒转导生成 LN215-YFP^QL 和 LN215-I⁻ 细胞

1. 按照上述方法，在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中，将LN215细胞接种于100 mm培养皿中，培养至80%融合度。
   注意：若使用其他细胞系进行I-YFP-GJIC实验，请使用相应的培养基。LN215-YFP^QL和LN215-I^-细胞可由延世大学产业-大学基金会提供。请联系通讯作者获取。
2. 转导前一天，用10 mL PBS洗涤细胞两次，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C处理3 min。用10 mL移液管将细胞重悬于5 mL培养基中，并调整细胞密度至50,000个细胞/mL。向24孔板的每孔中加入含20,000个细胞的400 µL培养基，分别用于无病毒对照组、YFP^QL组和SLC26A4组的处理。
3. 在37 °C孵育24 h后，将两孔中的培养基更换为400 µL pLVX-EIP-YFP^QL或pLenti6P-SLC26A4慢病毒与新鲜培养基按1:1比例混合的溶液，并补充polybrene至终浓度为4 µg/mL。对于无病毒对照组，则仅更换为普通培养基。
4. 将细胞在37 °C继续孵育15 h，吸除含慢病毒的培养基，加入新鲜培养基，并继续孵育72 h。
   注意：为防止慢病毒在不同孔之间污染，每次吸除含慢病毒的培养基或添加新鲜生长培养基时，均应使用新的枪头或移液器。
5. 每孔用0.5 mL PBS洗涤两次，加入300 µL胰蛋白酶-EDTA处理3 min。将细胞重悬于2 mL培养基中，接种至六孔板，并加入2 µg/mL嘌呤霉素。
6. 在含2 µg/mL嘌呤霉素的培养基中继续培养细胞，直至对照孔中所有细胞死亡（显微镜下观察呈圆形或漂浮状态），通常需要一周时间。在筛选期间每隔一天更换一次含嘌呤霉素的培养基。若在筛选完成前LN215-YFP^QL或LN215-I^-细胞已达到融合状态，则将细胞转移至100 mm培养皿，并按步骤2.5继续筛选。

3. 准备检测所需的溶液

1. 配制500 mL C溶液（10 mM HEPES、140 mM NaCl、10 mM葡萄糖、5 mM KCl、1 mM MgCl₂ 和 1 mM CaCl₂）和500 mL I溶液（10 mM HEPES、140 mM NaI、10 mM葡萄糖、5 mM KCl 和 1 mM CaCl₂）。
2. 用1 N NaOH将两种溶液的pH值调节至7.4，通过0.4 µm滤膜过滤除菌后储存。4 °C保存，最长可保存1个月。使用前检查pH值。

4. 铺板 LN215-YFP^QL 和 LN215-I⁻ 细胞

1. 分别在100 mm培养皿中培养LN215-YFP^QL和LN215-I⁻细胞，使用培养基使其达到检测所需的细胞数量。进行96孔板检测时，LN215-YFP^QL细胞在100 mm培养皿中汇合度达40%，LN215-I⁻细胞汇合度达80%即可。
2. 进行I-YFP GJIC检测前一天，用10 mL PBS洗涤每个100 mm培养皿。每皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育5分钟。将每皿中的细胞用4 mL培养基重悬，转移至15 mL锥形管中。
3. 以1,000 × g离心3分钟使细胞沉淀。弃去上清液，将每份细胞沉淀用5 mL培养基重悬。使用10 mL血清移液管反复吹打约20次，将任何细胞团块分散为单细胞。
4. 用血细胞计数板计数细胞，并用培养基将细胞悬液稀释至LN215-YFP^QL细胞浓度为80,000 个/mL，LN215-I⁻细胞浓度为160,000 个/mL。
5. 在储液槽中混合7 mL LN215-YFP^QL细胞悬液与7 mL LN215-I⁻细胞悬液。使用多通道移液器向96孔细胞培养板的每孔加入100 µL混合液。
   注意：为向96孔板每孔加入100 µL混合液，共需约10 mL混合细胞悬液。建议制备的细胞悬液量略多于实际所需量。
6. 将细胞置于37 °C、含5% CO₂/95%空气的加湿培养箱中孵育24小时。进行检测时，LN215-YFP^QL和LN215-I⁻细胞的培养应达到100%汇合度。

5. 进行 I-YFP GJIC 检测

注意：使用20倍放大倍数的荧光显微镜和GFP滤光片检查96孔板，确保LN215-YFP^QL或LN215-SLC26A4细胞无团块，且在进行检测前细胞培养已完全汇合且分布均匀。

1. 在进行检测前至少30分钟，打开酶标仪并预热至37 °C。
2. 以300 µL/s的流速，用3 mL 70%乙醇、3 mL蒸馏水和3 mL I-溶液依次冲洗自动进样器的管路。
3. 将C溶液和I溶液在水浴中加热至37 °C。
   注意：由于每孔96孔板需要每种溶液100 µL，每次检测每种溶液约需10 mL。每块板还需额外10 mL I-溶液用于预冲洗（共计20 mL），以及额外25 mL C-溶液用于洗涤（共计35 mL）。
4. 吸除培养基，或倒置培养板以排空，轻敲去除残留液体。
   注意：生长培养基中残留的胎牛血清会导致背景荧光增强和检测质量下降。
5. 使用多通道移液器从储液槽中向每孔加入 200 µL C 溶液。吸取 C 溶液或将平板倒置以排空，并轻拍去除残留液体。
6. 加入50 µL C溶液和1 µL 2.5 mM化学物质储备液（参见 表1）或二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，然后用多通道移液器向每孔加入50 µL C溶液。
   注意：化学文库中的大多数试剂均溶解于DMSO中，在大多数基于细胞的检测中，DMSO浓度可达1%（v/v）是可接受的。²⁴由于DMSO的密度高于水，当溶于DMSO的试剂被加入培养板孔中时，容易沉降至孔底，从而干扰检测溶液的浓度。可通过依次加入50 µL C-溶液、溶于DMSO的试剂以及50 µL C-溶液来避免此问题。最后加入的50 µL C-溶液用于混匀。
7. 在37 °C、空气环境中孵育细胞，不要在5% CO₂中孵育₂孵育时间可以调整，但通常10分钟足以使离子通道调节剂发挥作用。
8. 孵育期间，设置酶标仪程序，在1秒时向每孔注入100 µL I-溶液，随后以0.4秒间隔测量荧光信号，持续10秒。设置酶标仪从底部读取荧光信号。推荐的注射速度为135 µL/s。激发波长设为485 nm，发射波长设为520 nm。
   注意：酶标仪程序的详细设置如下。
   1. 点击 管理实验方案 按钮。
   2. 点击 新方法 按钮。选择 荧光强度 在测量方法部分，以及 井模式 在读取模式部分。接下来，单击 好的 按钮。将出现新标签页。
   3. 在 基本参数 菜单中，将激发波长设为 485 nm，发射波长设为 520 nm。选择 底部光学 从底部读取荧光。将测量开始时间设为“0 s”，间隔次数设为“25”，每孔闪光次数设为“20”，间隔时间设为“0.4 s”。
   4. 在 布局 菜单，绘制待读取区域的平板范围。
   5. 在 浓度/体积/振荡 在菜单中，将微孔板读数仪设置为向每个孔注入 100 µL I 溶液，注射速度为 135 µL/s。
      注意：避免过快的注射速度，因为这可能导致细胞脱落。
   6. 在 注射时间 菜单中，将注射开始时间设置为 1 s。然后，单击 开始测量 按钮。
9. 孵育结束后，将96孔板放入酶标仪中，通过点击开始测量 开始测量 再次按下按钮。

6. 缝隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）活性的计算

1. 计算YFP^QL淬灭百分比和GJIC活性，公式如下²³：
   YFP^QL淬灭 (%) =
   GJIC活性 (%) =
   注：原则上，GJIC活性应根据含受体细胞和供体细胞孔中YFP荧光百分比与仅含受体细胞孔的相应百分比之差来计算。然而，由于LN215-YFP^QL细胞在碘离子作用10秒后YFP淬灭可忽略不计，因此在使用LN215-YFP^QL和LN215-I^-细胞进行高通量筛选（HTS）时，我们未将背景YFP淬灭计入。

结果

使用29块96孔培养板对2,320种化学品进行筛选，以通过I-YFP间隙连接细胞间通讯（GJIC）检测法结合LN215-YFP^QL和LN215-I⁻细胞鉴定新型GJIC调节剂。代表性培养板的实验结果如图2所示。图2A以折线图形式显示了每孔中的YFP荧光百分比，图2B以柱状图形式显示了每孔中的GJIC活性百分比。阴性对照、阳性对照以及被筛选的80种化学品列于表1中。每个孔使用25 µM的化合物处理10分钟。特比萘芬完全抑制了GJIC，而胡莫柳酯抑制了约50%的GJIC。特比萘芬被确认为一种GJ抑制剂，其剂量-反应关系、可逆性及其他实验结果已在其他文献中发表²³。

讨论

I-YFP-GJIC 检测可用于高通量筛选（HTS），因其具有稳健性、快速性和低成本的特点。一种 HTS 检测若其 Z' 因子高于 0.5，则被认为具有稳健性²⁵。有关用于评估 HTS 检测适用性的统计分析方法的描述，请参见 Zhang 等人的研究²⁵。当使用 LN215 细胞时，无需任何检测优化，Z' 因子即可达到 >0.5。如果在检测中使用其他细胞类型且其 Z' 因子 <0.5，则可通过延长检测时间来提高稳健性²¹。LN215 和 HOS（人骨肉瘤细胞）仅需 10 秒即可获得 Z' 因子 >0.5²¹。该检测仅需受体细胞和供体细胞、I 溶液和 C 溶液，无需其他试剂（如 LY 和钙黄绿素-AM）。该 GJIC 检测的另一优势在于，它可测量单个孔中细胞的总体 GJIC 活性，从而导致孔间变异性较低。在显微注射、光漂白后间隙荧光恢复（FRAP）以及双膜片钳检测中，检测区域内的单个细胞可能显著影响测量结果。尽管划痕加样检测可在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	SPL	30096
氯化钙（CaCl2）	Sigma	C5670	I-溶液
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021	C-溶液，I-溶液
二甲基亚砜（DMSO）	sigma	276855
HEPES	Sigma	RES6003H-B7	C-溶液，I-溶液
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027	转染试剂
六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）	Sigma	M2393	C-溶液
酶标仪	BMG LabTech	POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G	Addgene	#12259
Polybrene	sigma	H9268
聚-L-赖氨酸溶液	sigma	P4707
氯化钾（KCl）	Sigma	P5405	C-溶液，I-溶液
psPAX2	Addgene	#12260
嘌呤霉素二盐酸盐	sigma	P8833
氯化钠（NaCl）	Sigma	S5886	C-溶液，I-溶液
氢氧化钠（NaOH）	Sigma	S2770
碘化钠（NaI）	Sigma	383112	I-溶液