本文介绍了一种新型的缝隙连接细胞间通讯检测方法，专为药物发现和毒理学评估中高通量筛选调节缝隙连接的化学物质而设计。
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本文内容
摘要
摘要
间隙连接（GJs）是细胞膜通道，允许相邻细胞间扩散分子量小于1 kDa的分子。由于间隙连接具有生理和病理作用，因此在药物发现和毒理学研究中需要高通量筛选（HTS）检测方法来鉴定GJ调节剂。一种新型的碘化物-黄色荧光蛋白-间隙连接-细胞间通讯（I-YFP-GJIC）检测法满足了这一需求。该方法是一种基于细胞的检测体系，包含受体细胞和供体细胞，分别被改造为稳定表达一种黄色荧光蛋白（YFP）变体或SLC26A4（一种碘离子转运体）。其中YFP的荧光可被碘离子高度敏感地淬灭。当向两种细胞的混合培养物中加入碘离子后，碘离子通过供体细胞中的SLC26A4转运体进入细胞，并经由间隙连接扩散至相邻的受体细胞，在受体细胞中淬灭YFP的荧光。YFP荧光信号可在微孔板中以动力学模式逐孔测定。YFP荧光的淬灭速率反映了间隙连接的活性。该检测方法可靠且快速，适用于高通量筛选。本文描述了在人胶质瘤细胞LN215中应用I-YFP-GJIC检测法的实验方案。
引言
间隙连接（GJs）作为细胞间通道，允许相邻细胞之间扩散分子量小于<1 kDa的小分子，如营养物质、代谢物和信号分子。连接结构包括每个细胞中的一个半通道（亦称连接子），每个连接子由六个连接蛋白（Cxs）组成1。间隙连接及其连接蛋白已应用于多环芳烃（PAH）等致癌物的毒理学检测，因为多环芳烃是间隙连接的抑制剂2,3,4。间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能障碍与非基因毒性致癌作用相关5,6。作为潜在的治疗靶点，间隙连接已被报道参与特定类型的癫痫发作7,8、心脑缺血/再灌注损伤的保护9、伴有先兆的偏头痛10、药物性肝损伤6,11以及伤口愈合12。为了药物发现、毒理学检测以及鉴定调控间隙连接活性的新型细胞因....
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方案
1. 表达YFPQL和SLC26A4的慢病毒的制备
- 在100 mm培养皿中将HEK293T人胚肾细胞培养至80%融合度。本方案中用于维持HEK293T及其他下述细胞的培养基为添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
- 向6孔板的每孔中加入2 mL无菌的0.005%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液，孵育10分钟以包被培养板。吸除PLL溶液，并用2 mL无菌水冲洗表面两次。
- 用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤HEK293T细胞，并在每个100 mm培养皿中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C处理3分钟。加入5 mL培养基并重悬细胞。
- 用血细胞计数板计数细胞，将细胞悬液密度调整为250,000个细胞/mL，并在2 mL培养基中加入500,000个细胞至6孔板的每一孔（已包被赖氨酸）。将细胞在37 °C、含5% CO2/95%空气的湿润环境中孵育24小时，随后更换为不含青霉素和链霉素的DMEM培养基。
- 在1.5 mL离心管中，将20 µL转染试剂用500 µL不含血清和抗生素的DMEM稀释。轻轻吹打混匀，室温静置5分钟。
- 同时，在两个1.5 mL离心管中各加入250 µL DMEM，然后分别加入1500 ng pLVX-EIP-YFPQL 或 pLenti6P-SLC....
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结果
使用29块96孔培养板，通过LN215-YFP细胞的I-YFP间隙连接通讯（GJIC）检测法，对2,320种化合物进行筛选，以鉴定新型GJIC调节剂QL 和 LN215-I− 细胞。代表性孔板获得的结果如下所示 图2每个孔中YFP荧光的百分比以折线图形式显示于 图2A 每个孔中GJIC活性的百分比显示在柱状图中 图2B阴性对照、阳性对照以及筛选的80种化学物质如图所示 表1每个孔均用 25 µM 一种化合物作用10分钟。特比萘芬完全抑制了间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC），而胡莫柳酯抑制了约50%的GJIC。特比萘芬被确认为一种GJ抑制剂。其剂量-反应关系、可逆性及其他实验结果已在其他文献中发表。23........
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讨论
I-YFP-GJIC 检测可用于高通量筛选（HTS），因其具有稳健性、快速性和低成本的特点。一种 HTS 检测若其 Z' 因子高于 0.5，则被认为具有稳健性25。有关用于评估 HTS 检测适用性的统计分析方法的描述，请参见 Zhang 等人的研究25。当使用 LN215 细胞时，无需任何检测优化，Z' 因子即可达到 >0.5。如果在检测中使用其他细胞类型且其 Z' 因子 <0.5，则可通过延长检测时间来提高稳健性21。LN215 和 HOS（人骨肉瘤细胞）仅需 10 秒即可获得 Z' 因子 >0.521。该检测仅需受体细胞和供体细胞、I 溶液和 C 溶液，无需其他试剂（如 LY 和钙黄绿素-AM）。该 GJIC 检测的另一优势在于，它可测量单个孔中细胞的总体 GJIC 活性，从而导致孔间变异性较低。在显微注射、光漂白后间隙荧光恢复（FRAP）以及双膜片钳检测中，检测区域内的单个细胞可能显著影响测量结果。尽管划痕加样检测可在.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育部门资助的基础科学研究中心项目支持（项目编号：2011-0023701、2016R1D1A1A02937397 和 2018R1A6A1A03023718）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板 | SPL | 30096 | |
| 氯化钙（CaCl2） | Sigma | C5670 | I-溶液 |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G7021 | C-溶液，I-溶液 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-溶液，I-溶液 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 转染试剂 |
| 六水合氯化镁（MgCl2·6H2O） | Sigma | M2393 | C-溶液 |
| 酶标仪 | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | sigma | P4707 | |
| 氯化钾（KCl） | Sigma | P5405 | C-溶液，I-溶液 |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | sigma | P8833 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S5886 | C-溶液，I-溶液 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma | S2770 | |
| 碘化钠（NaI） | Sigma | 383112 | I-溶液 |
参考文献
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. M....
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重印与许可
