评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

摘要

本文详细描述了一种实验方案，用于在干细胞移植前对其DNA完整性进行评估的分析。

摘要

干细胞及干细胞来源的细胞在治疗多种退行性疾病方面具有巨大的再生医学潜力。DNA 是所有细胞（包括干细胞）中遗传信息的储存库，其完整性是干细胞再生能力的基础。在实验室中，干细胞需快速增殖以获得移植所需的细胞数量。然而，加速的细胞生长会导致活性氧、羰基化合物和烷基化试剂等代谢产物的累积，从而造成 DNA 完整性丧失。移植此类细胞将导致移植效率低下以及受损器官的再生不良。此外，移植 DNA 受损的细胞可能引发突变、基因组不稳定、细胞衰老，甚至可能导致癌症等危及生命的疾病。因此，亟需一种质量控制方法来评估细胞是否适合移植。本文提供了在细胞移植前评估干细胞 DNA 完整性的分步操作方案。

引言

实验和临床证据表明，细胞移植可适度改善衰竭心脏的左心室收缩功能^{1,2,3,4,5,6,7,8,9}。近年来的进展为心血管再生开辟了更多有吸引力的前景，包括在体细胞中强制表达重编程因子以诱导多能性，并将这些诱导多能干细胞（iPSC）分化为不同的心脏谱系，尤其是心肌细胞（CM）^10,11,12,13。每个细胞中的遗传物质，包括人工生成的iPSC和iPSC来源的心肌细胞（iPS-CM），均为DNA。储存在DNA中的遗传指令决定了细胞、组织、器官和生物体的生长、发育和功能。DNA并非惰性物质；细胞代谢产物（如活性氧、羰基和氮类物质）以及烷化剂可在体外和体内引起DNA损伤^14,15,16,17。重要的是，DNA损伤直观地发生在每个细胞中，且频率显著。如果这些损伤未被修复，将导致DNA突变、细胞衰老、DNA和细胞完整性的丧失，并可能引发包括危及生命的癌症在内的多种疾病。因此，维持DNA完整性对任何细胞都至关重要，尤其是对在临床中具有巨大潜力的iPSC而言更为关键。

为了评估分离基因组DNA的数量和完整性，市场上已有昂贵的仪器设备可供使用。然而，目前尚无简单且经济有效的方法可在不分离细胞的情况下评估细胞内的DNA完整性。此外，在DNA提取过程中由操作者引起的DNA降解是这些方法的主要缺陷之一。单细胞凝胶电泳（即彗星试验）^18,19 和 γH2A.X 免疫标记⁸ 技术是研究实验室中评估DNA损伤的基本方法。这两种方法在分析DNA完整性时均无需使用昂贵设备或分离的基因组DNA^8,20,21。由于这些技术可在完整细胞上进行，因此样品制备过程中由操作者引起的DNA/RNA/蛋白质降解不会影响这些实验方案的结果。本文中，为评估干细胞及干细胞衍生细胞中的DNA损伤及其损伤应答，我们提供了彗星试验和γH2A.X免疫标记的分步实验方案。此外，通过结合这两种方法，我们提出了一种初步评估策略，可用于评价细胞是否适合移植应用。

彗星试验（comet assay），即单细胞凝胶电泳，用于检测细胞中的DNA断裂。将细胞包埋在低熔点琼脂糖中，经裂解后形成含有超螺旋DNA的核样结构（nucleoids）。在电泳过程中，断裂的DNA小片段和断裂的DNA链可穿过琼脂糖孔隙发生迁移，而完整的DNA由于分子量巨大且与基质蛋白结合，迁移受到限制。在荧光显微镜下观察到的染色DNA迁移模式形似彗星。彗星头部包含完整的DNA，尾部则由DNA片段和断裂的DNA链组成。DNA损伤比例可通过受损DNA（彗星尾部）的荧光强度与完整DNA（彗星头部）荧光强度的相对值来测定。尾矩（tail moment）参数的计算方法如图1所示。

DNA损伤会诱导ATM、ATR和DNA-PK激酶介导的组蛋白H2A.X在Ser139位点的磷酸化（γH2A.X）。H2A.X在DNA链断裂处的磷酸化及其募集过程被称为DNA损伤应答（DDR），该过程在DNA受损后迅速发生。随后，将启动检查点介导的细胞周期阻滞和DNA修复过程。在DNA修复成功完成后，磷酸酶会将γH2A.X去磷酸化并使其失活。持续存在或大量的DNA链断裂会导致DNA中γH2A.X焦点的累积，表明细胞无法修复DNA损伤且DNA完整性丧失。这些DNA中的γH2A.X焦点可通过第二节中的方案进行识别，并用于计数DDR焦点的数量。

方案

1. 彗星实验

1. 试剂准备
   1. 将500 mg低熔点琼脂糖加入100 mL无DNA/RNA水中。将瓶子放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。随后将瓶子置于37 °C水浴中，待用。
      注意： 欲了解更多信息，请参阅 Azqueta 等人的研究，该研究探讨了琼脂糖浓度对DNA解旋时间及多种电泳因素的影响²³.
   2. 将SYBR Green DNA染料用Tris-EDTA（TE）缓冲液按1:10,000比例稀释，得到1x工作浓度的染料溶液。该染料对光敏感，需避光保存。
   3. 对于细胞裂解缓冲液，将100 mL裂解缓冲液（2.5 M NaCl，0.1 M EDTA，10 mM Tris，1% Triton X-100）溶于去离子水（DI H₂O）中₂然后，加入 10 M NaOH 将 pH 调至 10.0。将缓冲液冷却至 4 °C。
   4. 对于碱性DNA解旋/电泳运行缓冲液，将1 L碱性溶液（0.3 M NaOH，1 mM EDTA）溶解于去离子水中₂O. 将缓冲液冷却至 4 °C。确保 pH >13.
   5. 对于预包被的彗星电泳载玻片，在玻璃载玻片上滴加数滴0.5%琼脂糖。立即使用另一张载玻片的平整表面将琼脂糖均匀铺开，形成一层薄薄的琼脂糖包被层。
      注意： 使用前将载玻片干燥。
   6. 对于iPS细胞培养，将iPS细胞短暂培养于基底膜基质包被的培养皿中（参见 材料表在 mTESR1 培养基中培养至细胞融合。
      注意： 本方案中使用了人源心肌成纤维细胞诱导生成的iPS细胞。iPS细胞的重编程、诱导及培养条件详见本研究团队近期发表的文章。^12,13,21.
2. 样品制备
   1. 弃去培养基，洗涤细胞。使用解离液解离细胞（参见 材料表). 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀，并将细胞重悬于 PBS 中，浓度为 1 × 10⁵ cells/mL
3. 样品载玻片制备
   注意： 在低光照条件下执行以下步骤，以避免紫外线引起的细胞损伤。
   1. 将10 μL细胞悬液与90 μL琼脂糖溶液（1:10比例）在离心管中混合。将离心管置于37 °C水浴中，以防止琼脂糖凝固。
   2. 将溶液混合均匀，避免产生气泡，然后用移液器将70 μL/点滴加到预包被的彗星电泳载玻片上。用移液器枪头将细胞与琼脂糖混合物铺展成一层薄层。将载玻片置于4 °C环境中15分钟。
   3. 将载玻片完全浸入装有冷裂解缓冲液的容器中。将容器置于4 °C避光孵育1小时。
   4. 用冰冷的碱性溶液替换裂解缓冲液，确保载玻片完全浸没。将容器置于4 °C避光环境中孵育30分钟。
4. 电泳
   1. 将载玻片放入水平电泳槽中，加入冷的碱性电泳缓冲液至完全浸没载玻片。以1 V/cm的电压电泳15至30分钟。
      注意： 总电压 = 电极间距 × 1 V
   2. 在容器中，将载玻片完全浸入冷的去离子水中₂O. 2分钟后，移除去离子水₂O 并加入新鲜的去离子水₂O. 重复此步骤。
   3. 更换去离子水₂用预冷的70%乙醇浸泡。静置5分钟。轻轻取出玻片，不要倾斜，使其自然晾干。
   4. 干燥后，向每个点加入100 μL稀释的DNA染料，室温避光孵育15分钟。使用落射荧光显微镜配备FITC滤光片，每份样品共采集50至100个彗星图像。
5. 图像分析与结果计算
   1. 为分析彗星图像，使用美国国立卫生研究院（NIH）的 ImageJ 软件并加载彗星检测插件（ImageJ 下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/download.html；插件下载地址：https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/）。
      注意： 该插件附带一份PDF说明书，其中包含执行分析所需的全部细节。此外，还展示了彗星分析的截图 图2A-C对照组和阿霉素（Doxo）处理的iPS细胞的代表性彗星图像及彗星定量分析结果如图所示 图3A-C.

2. DNA损伤应答

1. 样品与试剂准备
   1. 对于iPS-CM细胞培养，将iPS-CM细胞接种于基底膜基质包被的（参见材料表）培养板中，使用添加了B-27的RPMI培养基（CMM）进行培养，直至细胞达到汇合状态。
      注意：本方案中使用了人iPS细胞来源的心肌细胞。iPS细胞向心肌细胞分化的具体方案可参考本研究团队近期发表的文章^12,13,21。
   2. 将iPS-CM细胞接种至腔室载玻片中。
      1. 弃去iPS-CM孔中的培养基，用PBS洗涤细胞三次。
      2. 每孔加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察细胞是否脱落，随后加入1 mL CMM以终止胰酶消化。
      3. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，于4 °C、200 × g离心5分钟。弃去上清液，加入1 mL CMM重悬细胞。计数细胞，并调整细胞浓度，使1.6 mL CMM中含有20 × 10⁵个细胞。
      4. 每孔8孔腔室载玻片中加入200 µL细胞悬液（参见材料表）。轻轻敲击载玻片使细胞均匀分布，随后于37 °C孵育。
   3. 进行iPS-CM阿霉素处理时，弃去iPS-CM孔中的培养基，用PBS洗涤细胞。加入含1 μM阿霉素的CMM处理4小时。吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。
   4. 配制封闭缓冲液：配制10 mL含3%牛血清白蛋白（BSA）和0.05% Triton X-100的BSA溶液。取9 mL上述BSA溶液，加入1 mL正常驴血清，混匀即得10 mL封闭缓冲液。
   5. 配制一抗溶液：将1 μL抗兔磷酸化组蛋白H2A.X（Ser139）抗体加入200 μL封闭缓冲液中。
   6. 配制二抗混合液：将各1 μL荧光标记的抗兔二抗、DAPI和荧光标记的鬼笔环肽加入200 μL封闭缓冲液中。
2. 免疫标记
   1. 用PBS洗涤细胞三次，每孔加入200 μL新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA），于室温避光固定20分钟。固定后用PBS洗涤细胞。
   2. 弃去PBS，每孔加入200 μL封闭缓冲液，在室温湿润环境中封闭30分钟。弃去封闭液，每孔加入200 μL一抗溶液，在室温避光湿润环境中孵育45分钟。随后用PBS洗涤三次。
   3. 弃去PBS，每孔加入200 μL二抗混合液，在室温避光湿润环境中孵育45分钟。孵育结束后用PBS洗涤三次，再用去离子H₂O洗涤，然后使用抗荧光淬灭封片剂封片。加盖盖玻片，将载玻片置于4 °C避光保存。
   4. 使用落射荧光显微镜，对每个样本随机选取3至5个视野进行成像（如图4A所示），随后进行图像分析。
3. DDR焦点计数
   1. 下载并安装CellProfiler²⁴（http://cellprofiler.org）。
   2. 注意：本研究中图像处理使用的是CellProfiler 2.1.1版本。所使用的CellProfiler教程可参见其他资源（https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk&list=PL7CC87670239B4D10）。若使用更新版本的CellProfiler，分析流程可能需要进行轻微调整。
   3. 下载分析流程文件punctae_gH2AX.cpipe。在软件中选择文件 > 导入 > 流程，然后选择punctae_gH2AX.cpipe。
   4. 将包含γH2A.X焦点图像的文件夹拖拽至输入模块/图像部分的文件列表窗口中以进行分析（参见图5A）。随后按照图5A-L所示步骤操作。
   5. 为图像设置以下参数：
      1. 将待分析的图像拖至文件列表中。在输入模块中选择图像（模块设置参见图5A）。在输入模块中选择元数据（模块设置参见图5B）。在输入模块中选择名称与类型（模块设置参见图5C）。
      2. 在分组中选择无。在分析模块中选择ColorToGray（模块设置参见图5D）。
   6. 在分析模块中选择Smooth（模块设置参见图5E）。
      注意：该参数值可能需要根据图像分辨率进行优化。
   7. 在分析模块中选择IdentifyPrimaryObjects（模块设置参见图5F）。
      注意：需优化参数以确保整个细胞核被正确识别。此步骤后计算机可能出现短暂卡顿。
   8. 在分析模块中选择Smooth（模块设置参见图5G）。
      注意：该参数值可能需要根据图像分辨率进行优化。
   9. 在分析模块中选择EnhanceOrSuppressFeatures（模块设置参见图5H）。
   10. 在分析模块中选择IdentifyPrimaryObjects（模块设置参见图5I）。
       注意：需优化参数以确保焦点被正确识别。此步骤后计算机可能再次出现卡顿。
       1. 在分析模块中选择RelateObjects（模块设置参见图5J）。在分析模块中选择ClassifyObjects（模块设置参见图5K）。在分析模块中选择ExportToSpreadsheet（模块设置参见图5L）。
       2. 点击左下方面板的分析图像以执行图像分析。分析成功完成后，将生成若干图像（参见图6A-F）。
          注意：建议用户保存这些图像以供后续参考。
       3. 注意生成的.csv文件，其中包含定量数据，已保存至计算机的指定位置。在名为MyExpt_Image的电子表格中，B列和D列分别表示含有不超过五个焦点和超过五个焦点的细胞核数量。将B列与D列相加，可得细胞核总数。
   11. 对所有图像重复步骤2.3.3至2.3.8（每次分析前需更改MyExpt_文件名）。可据此绘制DNA完整性的评估图表，如图4C所示。

结果

培养人诱导性多能干细胞，并通过彗星试验分析用于评估DNA完整性的DNA损伤和尾矩。将iPS细胞包埋于低熔点琼脂糖中并置于载玻片上。随后，细胞经裂解缓冲液处理，再用碱性溶液处理，以获得超螺旋DNA。将核伸展物进行电泳，再通过DNA染料显影形成彗星图像（图1A-D）。随后使用ImageJ软件及彗星试验插件对彗星图像进行分析（图2A-C）。

人iPS细胞经Doxo处理以诱导DNA损伤，并作为阳性对照。图中显示了经Doxo处理与未处理iPS细胞的代表性彗星电泳显微图像。 图 3A在iPS细胞中检测到基础水平的DNA损伤，以DNA损伤比例和尾矩表示。然而，正如预期，Doxo处理增加了iPS细胞中的DNA损伤

讨论

DNA完整性反映了细胞的完整性。DNA受损的细胞常处于应激状态，最终会丧失其完整性。对于用于移植目的而扩增的干细胞及其分化细胞而言，细胞的完整性是其发挥预期功能的关键。移植DNA受损的细胞将导致细胞植入率低下及功能不良^8,20。因此，在细胞移植前检测DNA完整性是一项必要的质量控制步骤。本文介绍了两种经济有效的方法——彗星实验（comet assay）和γH2A.X免疫荧光标记，用于评估干细胞及其分化细胞的DNA损伤程度与质量。

细胞衰老的主要原因被认为是细胞内DNA损伤的累积。Al-Baker等人利用彗星实验分析了年轻和衰老的人类皮肤成纤维细胞中的DNA损伤²²。此前，我们已证明，将从p53转基因小鼠中分离得到的无DNA损伤的心脏祖细胞移植后，可提高细胞在宿主器官中的植入率⁸。最近，我们揭示了p53转录激活域在人类诱导多能干细胞（iPS细胞）DNA损伤修复机制中的作用<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	Corning	25200056
8孔腔室载玻片	Millicell	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	细胞解离溶液
Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID: AB_2313584)
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
Cy3 AffiniPure 驴抗兔IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-165-152 (RRID:AB_2307443)
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
Gibco B-27 添加剂，无血清	Gibco	17504-044
Matrigel 生长因子减少型	Corning	354230
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850
PhalloidinA488	Life Technology	A12379
磷酸化组蛋白 H2A.X (Ser139) 抗体	Cell Signaling Technology	2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR Green I 核酸凝胶染料	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher scientific	BP151-100
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	抗荧光淬灭剂