方法文章

评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

DOI：

10.3791/58971

⸱

2019年1月25日

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1Department of Biomedical Engineering, School of Engineering, School of Medicine, University of Alabama at Birmingham

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文详细描述了一种实验方案，用于在干细胞移植前对其DNA完整性进行评估的分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

干细胞及干细胞来源的细胞在治疗多种退行性疾病方面具有巨大的再生医学潜力。DNA 是所有细胞（包括干细胞）中遗传信息的储存库，其完整性是干细胞再生能力的基础。在实验室中，干细胞需快速增殖以获得移植所需的细胞数量。然而，加速的细胞生长会导致活性氧、羰基化合物和烷基化试剂等代谢产物的累积，从而造成 DNA 完整性丧失。移植此类细胞将导致移植效率低下以及受损器官的再生不良。此外，移植 DNA 受损的细胞可能引发突变、基因组不稳定、细胞衰老，甚至可能导致癌症等危及生命的疾病。因此，亟需一种质量控制方法来评估细胞是否适合移植。本文提供了在细胞移植前评估干细胞 DNA 完整性的分步操作方案。

引言

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实验和临床证据表明，细胞移植可适度改善衰竭心脏的左心室收缩功能1,2,3,4,5,6,7,8,9。近年来的进展为心血管再生开辟了更多有吸引力的前景，包括在体细胞中强制表达重编程因子以诱导多能性，并将这些诱导多能干细胞（iPSC）分化为不同的心脏谱系，尤其是心肌细胞（CM）10,11,12,13。每个细胞中的遗传物质，包括人工生成的iPSC和iPSC来源的心肌细胞（iPS-CM），均为DNA。储存在DNA中的遗传指令决定了细胞、组织、器官和生物体的生长、发育和功能。DNA并非惰性物质....

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方案

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1. 彗星实验

  1. 试剂准备
    1. 将500 mg低熔点琼脂糖加入100 mL无DNA/RNA水中。将瓶子放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。随后将瓶子置于37 °C水浴中，待用。
      注意： 欲了解更多信息，请参阅 Azqueta 等人的研究，该研究探讨了琼脂糖浓度对DNA解旋时间及多种电泳因素的影响23.
    2. 将SYBR Green DNA染料用Tris-EDTA（TE）缓冲液按1:10,000比例稀释，得到1x工作浓度的染料溶液。该染料对光敏感，需避光保存。
    3. 对于细胞裂解缓冲液，将100 mL裂解缓冲液（2.5 M NaCl，0.1 M EDTA，10 mM Tris，1% Triton X-100）溶于去离子水（DI H₂O）中2然后，加入 10 M NaOH 将 pH 调至 10.0。将缓冲液冷却至 4 °C。
    4. 对于碱性DNA解旋/电泳运行缓冲液，将1 L碱性溶液（0.3 M NaOH，1 mM EDTA）溶解于去离子水中2O. 将缓冲液冷却至 4 °C。确保 pH >13.
    5. 对于预包被的彗星电泳载玻片，在玻璃载玻片上滴加数滴0.5%琼脂糖。立即使用另一张载玻片的平整表面将琼脂糖均匀铺开，形成一层薄薄的琼脂糖包被层。

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结果

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培养人诱导性多能干细胞，并通过彗星实验分析用于评估DNA完整性的DNA损伤和尾矩。将iPS细胞包埋于低熔点琼脂糖中，置于载玻片上。随后用裂解缓冲液处理细胞，再用碱性溶液处理，以获得超螺旋DNA。对核酸复合物进行电泳，利用DNA染料观察彗星图像（图1A-D）。随后使用ImageJ软件及彗星实验插件对彗星图像进行分析（图2A-C）。

为诱导DNA损伤并作为阳性对照，人iPS细胞经Doxo处理。Doxo处理与未处理的iPS细胞的典型彗星图如图3A所示。iPS细胞中存在基础水平的DNA损伤，以DNA损伤比例和尾矩表示。然而，正如预期，Doxo处理显著增加了iPS细胞中的DNA损伤（

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讨论

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DNA完整性反映了细胞的完整性。DNA受损的细胞常处于应激状态，最终会丧失其完整性。对于用于移植目的而扩增的干细胞及其分化细胞而言，细胞的完整性是其发挥预期功能的关键。移植DNA受损的细胞将导致细胞植入率低下及功能不良8,20。因此，在细胞移植前检测DNA完整性是一项必要的质量控制步骤。本文介绍了两种经济有效的方法——彗星实验（comet assay）和γH2A.X免疫荧光标记，用于评估干细胞及其分化细胞的DNA损伤程度与质量。

细胞衰老的主要原因被认为是细胞内DNA损伤的累积。Al-Baker等人利用彗星实验分析了年轻和衰老的人类皮肤成纤维细胞中的DNA损伤22。此前，我们已证明，将从p53转基因小鼠中分离得到的无DNA损伤的心脏祖细胞移植后，可提高细胞在宿主器官中的植入率8。最近，我们揭示了p53转录激活域在人类诱导多能干细胞（iPS细胞）DNA损伤修复机制中的作用<.......

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披露

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作者无任何披露信息。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分由美国国家心肺血液研究所基金 RO1-HL-99507、HL-114120、HL-131017、HL138023 和 UO1-HL-134764（资助 J. Zhang）以及美国心脏协会科学开发基金 17SDG33670677（资助 R. Kannappan）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶Corning25200056
8孔腔室载玻片MillicellPEZGS0816
AccutaseStemcell Technologies7920细胞解离溶液
Alexa Fluor 488 AffiniPure
驴抗兔IgG		Jackson Immuno
Research Laboratories		711-545-152
(RRID: AB_2313584)
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA7906
Cy3 AffiniPure 驴抗兔IgGJackson Immuno
Research Laboratories		711-165-152
(RRID:AB_2307443)
DAPISigma-AldrichD9564
Gibco B-27 添加剂，无血清Gibco17504-044
Matrigel 生长因子减少型Corning354230
mTeSR1Stemcell Technologies85850
PhalloidinA488Life TechnologyA12379
磷酸化组蛋白 H2A.X (Ser139) 抗体Cell Signaling Technology2577 (RRID: AB_2118010)
RPMIGibco11875-093
SYBR Green I 核酸凝胶染料Sigma-AldrichS9430
Triton X-100Fisher scientificBP151-100
UltraPure 低熔点琼脂糖Invitrogen16520050
VectashieldVector LaboratoriesH-1000抗荧光淬灭剂

参考文献

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  1. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  2. Makkar, R. R., et al.

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标签

H2AX DNA CellProfiler

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