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方法文章

抗生素敏感性的定量检测 淋病奈瑟菌 使用ATP利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色检测聚集体

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DOI：

10.3791/58978

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2019年2月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Marine Biotechnology and Resources, National Sun Yat-Sen University, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

本文内容

摘要

采用简单的ATP检测法和活/死染色法，对经头孢曲松处理后的Neisseria gonorrhoeae存活情况进行定量和可视化分析。该方案可扩展用于研究任何抗生素的抗菌效果，并可用于确定抗生素在细菌生物膜中的最低抑菌浓度。

摘要

耐药性Neisseria gonorrhoeae（淋球菌，GC）的出现已成为全球性的健康威胁，凸显了识别治疗失败个体的迫切需求。这种革兰氏阴性细菌仅在人类中引起淋病。在感染过程中，该菌能够形成聚集体和/或生物膜。最低抑菌浓度（MIC）试验常用于测定细菌对抗生素的敏感性，并据此确定适当的治疗方案。然而，体内清除机制及其与实验室结果之间的关系尚不清楚。本研究建立了一种方法，用于考察GC聚集体如何影响其对抗生素的敏感性，并揭示聚集体大小与抗生素敏感性之间的关系。当GC形成聚集体时，其对抗生素杀灭作用的抵抗力增强，聚集体中心的细菌比边缘区域的细菌更能耐受头孢曲松治疗。研究数据表明，N. gonorrhoeae的聚集行为可降低其对头孢曲松的敏感性，而传统的基于琼脂平板的MIC方法无法反映这一现象。本研究所采用的方法将使研究人员能够在更接近临床实际的条件下检测细菌的药物敏感性。

引言

淋病是一种常见的性传播感染（STI）1。Neisseria gonorrhoeae（GC）是一种革兰氏阴性双球菌细菌，是该疾病的致病因子。生殖器感染的症状可能包括排尿时疼痛、生殖器普遍疼痛以及尿道分泌物。感染常无症状2,3,4,5，这使得病原体能够长期定植。未经治疗的感染是一个重大的健康问题，因其可能促进病原体传播，并导致盆腔炎性疾病（PID）和播散性淋球菌感染（DGI）等并发症6。耐抗生素的淋病已成为重大的公共卫生危机，并带来日益加重的社会经济负担7。淋球菌对头孢菌素类药物的敏感性降低，已导致治疗方案从单一抗生素改为联合疗法，即阿奇霉素或多西环素与头孢曲松联用8。头孢曲松和阿奇霉素联合治疗失败的病例日益增多9,10，加之无症状感染的存在，凸显了深入理解淋病治疗失败机制的迫切需求。

最低抑菌浓度（MIC）试验，包括琼脂稀释法和纸片扩散法，已被用作鉴定细菌对抗生素耐药性的标准医学检测方法。然而，目前尚不清楚MIC试验是否能够反映细菌在体内的抗生素耐药性。细菌生物膜的形成有助于细菌在杀菌浓度的抗生素环境中存活：而MIC试验无法检测到这一效应11。由于淋病奈瑟菌（GC）可在黏膜表面形成生物膜12，我们推测在菌体聚集体内部的抗生素敏感性可能与单个GC菌体不同。此外，已有研究表明，三种相变异的表面分子——菌毛、孔蛋白（opacity-associated protein, Opa）和脂寡糖（lipooligosaccharides, LOS）——可调节细菌间的相互作用，并导致形成不同大小的菌体聚集体13,14,15。由于缺乏适当的研究方法，这些组分在抗生素耐药性中的作用尚未得到系统研究。

目前，已有多种方法可用于检测生物膜的清除效果。其中应用最广泛的定量方法是通过结晶紫染色来测定生物量的变化16。然而，该方法需要进行大量的实验操作，可能在重复实验中引入误差17。本文所采用的活/死染色法能够直观显示活菌与死菌及其在生物膜内的分布情况。但生物膜的结构可能形成物理屏障，限制染料的渗透。因此，为了对群体内的活/死细菌进行定量分析，该染色方法通常仅适用于较小的生物膜或其前体——微菌落或细菌聚集体。其他方法，如琼脂稀释法和纸片扩散法，均无法有效评估细菌聚集状态的影响。为了在抗生素处理后检测聚集状态下淋球菌（GC）的药物敏感性，理想的方法应同时具备定量检测活菌数量以及可视化其空间分布的能力。

本方案结合ATP利用量测定与活/死细胞染色实验，通过定量和可视化方法，在抗生素存在条件下检测聚集物内GC的易感性。

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方案

1. GC 菌株的一般保藏

  1. 从冻存菌种中将N. gonorrhoeae菌株划线接种至含1% Kellogg补充剂的GCK琼脂培养基（表1，表2）18，于37 °C、5% CO2条件下培养16–18小时。可选用表达相可变Opa蛋白的MS11菌株（MS11Opa+）、不表达Opa蛋白的菌株（MS11ΔOpa），或表达截短型脂寡糖（LOS）的菌株（MS11ΔLgtE）。
  2. 在解剖显微镜下根据菌落形态19，仔细挑取菌落边缘无深色（菌毛阴性）或有深色边缘（菌毛阳性）的单个菌落，分别划线接种至新的GCK平板。
  3. 使用前于37 °C、5% CO2条件下培养16–18小时。

2. GC 聚集体的活力定量

  1. 使用无菌拭子收集GC。从平板上刮取GC，并将其重悬于预热的培养基（GCP）中， 表3) 加入 4.2% NaHCO₃3 和1%凯洛格溶液18. 在650 nm波长下使用分光光度法（OD650 约1 × 10⁹ CFU/mL）以确定悬浮细菌的浓度。
  2. 调节GC浓度至约1 × 108 CFU/mL
  3. 向96孔板的各孔中加入99 µL调节后的GC悬液。
  4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育平板6小时2 以促进细菌聚集。
  5. 向每个孔中加入1 µL系列稀释的头孢曲松（1000、100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8、0.4、0.2 µg/mL）。留出部分孔不加药物作为对照。
  6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板24小时2.
  7. 在每个孔中以144 W和20 kHz超声处理3次，每次5秒。
  8. 向每个孔中加入100 µL市售ATP利用发光试剂，用移液器吹打3次，于37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟2.
  9. 从每个孔中小心转移150 µL混合液至96孔黑色微孔板的新孔中，避免产生气泡。
  10. 使用酶标仪在560 nm处测定每个孔的吸光度。
  11. 通过连续头孢曲松处理后的读数与未处理孔的读数之比，计算存活率。

3. GC 聚集体活/死荧光显微镜分析

  1. 使用无菌拭子采集淋球菌（GC）。从平板上刮取淋球菌，并将其重悬于预热的含1% Kellogg补充剂的GCP培养基中。
  2. 在650 nm波长下通过分光光度法测定细菌数量，并将淋球菌浓度调整至约1 × 107 CFU/mL。
  3. 将198 µL淋球菌悬液加入8孔盖玻片底共聚焦培养皿中。
  4. 将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下孵育6小时，以诱导菌落聚集形成。
  5. 在每种聚集条件下，向每个孔中加入2 µL头孢曲松（100 µg/mL或不同稀释度），并在37 °C、5% CO2条件下孵育所需时间。
  6. 向每个孔中加入0.6 µL活/死染色溶液混合物，在37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。
  7. 使用共聚焦显微镜获取Z轴层扫图像（可使用性能相当的显微镜）。
  8. 使用ImageJ软件分析图像，测量淋球菌聚集物的大小以及每个聚集物中活/死染色的荧光强度比（FIR）。

4. 图像分析

  1. 细菌聚集体大小的估算。
    1. 打开 ImageJ，通过将原始图像文件拖拽到 ImageJ 菜单栏来打开图像。
    2. 在 ImageJ 菜单栏中点击 Freehand Lines，并用自由手绘线条圈出图像中每个聚集体的区域。
    3. 在 ImageJ 菜单栏中点击 Analyze | Measure。
    4. 在新窗口的 Area 列下获取数值。
  2. 聚集体活菌与死菌比例的定量分析
    1. 打开 ImageJ，通过将原始图像文件拖拽到 ImageJ 菜单栏来打开图像。
    2. 在 ImageJ 菜单栏中点击 Analyze | Set Measurements。
    3. 在弹出窗口中勾选“Integrated Density”，然后点击 OK。
    4. 在菜单栏中点击 Image | Color | Channels Tool，并选择 Color 模式。
    5. 将 Channel 1 设为标记活菌的荧光通道。
    6. 在 ImageJ 菜单栏中点击 Freehand Lines，并用自由手绘线条圈出每个聚集体的区域。
    7. 在 ImageJ 菜单栏中点击 Analyze | Measure。
    8. 在 IntDen 列下获取数值。
    9. 将 Channel 2 设为标记死菌的荧光通道，重复步骤 4.2.6–4.2.8。
    10. 将步骤 4.2.8 得到的数值除以步骤 4.2.9 得到的数值，计算出活菌与死菌的比例。
  3. 统计分析
    1. 打开 GraphPad Prism，将从 ImageJ 获得的数值输入到目标列中。
    2. 点击 Analyze，在 Column analyses 下选择 t tests。
    3. 选择需要比较的目标列，然后点击 OK。
    4. 在 Analysis 窗口中获取 P 值。
    5. 在步骤 4.3.3 中，从 XY analyses 下选择 Linear Regression。
    6. 在 Analysis 窗口中获取 R-square 值和 P-Value。

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结果

采用了两种方法：ATP利用测定法和活/死染色测定法。这些结果可合并使用，也可单独用于检测抗生素处理后聚集物内细菌的存活情况。已有研究表明，ATP利用测定法可准确测量S. aureus生物膜中的活菌数量20,21。本研究使用MS11Opa+Pil+菌株来考察淋病奈瑟菌（GC）聚集在抗生素敏感性中的作用。将非聚集的MS11Opa+Pil+、聚集的MS11Opa+Pil+，以及经超声处理破坏聚集后的MS11Opa+Pil+菌株分别用不同浓度梯度的头孢曲松处理，并测定ATP水平（图1A）。在比较有无抗生素处理下的存活率时，与非聚集或经超声破坏聚集的GC相比，预先聚集的GC在头孢曲松浓度等于或高于0.015 µg/mL时（MIC来自琼脂稀释法测定（表4））表现出显著更高的存活率。此外，还检测了MS11Opa+Pil-、MS...

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讨论

细菌在感染人体过程中可形成生物膜。传统的最小抑菌浓度（MIC）检测可能无法反映根除生物膜中细菌所需的药物浓度。为了检测抗菌剂对生物膜的作用，基于生物膜生物量或菌落形成单位（CFU）涂布计数的方法可能因生物膜结构的影响而产生误差。例如，涂布法仅在生物膜能够被有效破坏时才适用，因此所获得的CFU可能低于实际存活细菌的数量。目前已建立通过可视化生物膜内死菌与活菌的方法来评估细菌在生物膜中的存活情况，然而，该方法受生物膜结构和密度的影响，染色剂可能无法充分渗透进入生物膜内部，导致存活率的检测结果不准确且被低估。

本方法结合定量检测与可视化分析，用于测定细菌聚集体经处理后的存活情况。该方法的优势在于，能够在更接近真实感染环境的条件下测量细菌存活率。通过比较非聚集态与聚集态细菌的存活率差异，可判断体外最小抑菌浓度（MIC）是否与体内最小抑菌浓度相关。

ATP利用测定法通过检测ATP的生成量，可定量测量聚集体的存活情况。与其他类似测定方法相比，该方法更为灵敏，能够区分抗生素浓度微小差异下的存活率变化。然而，由于该测定法灵敏度较高，确保细菌细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院向 D.C.S. 和 W.S. 提供的资助（项目编号：AI123340）。L.-C.W.、J.W.、A.C. 和 E.N. 部分受资助/参与了 "第一年创新 & 研究经历" 由马里兰大学资助的项目。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥作用。我们感谢马里兰大学细胞生物学与分子遗传学系成像中心（UMD CBMG Imaging Core）完成所有显微镜实验。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100x Kellogg's 补充剂
琼脂United States BiologicalA0930
BacTiter Assay PromegaG8232
头孢曲松TCIC2226
Difco GC 培养基基础 BD228950
硝酸铁九水合物 Sigma-Aldrich254223-10G
葡萄糖Thermo Fisher ScientificBP350-1
L-谷氨酰胺结晶粉末Fisher ScientificBP379-100
BacLight 活/死染色试剂InvitrogenL7012
MS11 淋病奈瑟菌菌株由 Walter Reed 陆军研究所 Herman Schneider 博士惠赠
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Fisher ScientificP290-500
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Fisher ScientificBP329-1
蛋白胨 BD Biosciences211693
氯化钠 (NaCl)Fisher ScientificS671-10
可溶性淀粉Sigma-AldrichS9765
硫胺素焦磷酸Sigma-AldrichC8754-5G
设备
培养皿VWR25384-302
8孔盖玻片底共聚焦培养皿 Thermo Fisher Scientific155411
96孔组织培养板 Corning, Falcon3370
生物安全柜（NU-425-600 II 级 A2 型层流生物危害罩）Nuaire32776
CO2 培养箱Fisher Scientific Model 3530
配备活细胞成像室的共聚焦显微镜LeicaSP5X
Corning  96 孔黑色聚苯乙烯微孔板 Corning3904
Glomax 发光检测仪 PromegaE6521
移液器吸头 (0.1–10 µL)Thermo Fisher Scientific02-717-133
移液器吸头 (1000 µL)VWR83007-382
移液器吸头 (200 µL)VWR53509-007
Ultrospec 2000 UV 分光光度计Pharmacia Biotech80-2106-00
无菌 15 ml 锥形管VWR21008-216
无菌微量离心管 (1.7 mL)Sorenson BioScience16070
无菌聚酯头采样拭子Fisher Scientific23-400-122
超声波破碎仪KontesEquivelent to 9110001

参考文献

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