经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的实验室操作：技术、靶向定位与注意事项

摘要

本文描述了经皮耳迷走神经刺激（taVNS）技术的方法学概述、潜在作用靶点以及在人耳上的正确实施方法。

摘要

无创性迷走神经刺激（VNS）可通过一种新兴的神经调节技术——经皮耳迷走神经刺激（transcutaneous auricular vagus nerve stimulation, taVNS）实施。与颈部植入式VNS不同，taVNS是一种经济、非手术的方法，用于调节迷走神经系统。taVNS具有吸引力，因其有助于基础VNS研究的快速转化，并可作为未来治疗中枢与外周疾病的安全、经济且便携的神经刺激系统。本文阐述了taVNS的背景与理论依据，以及电刺激参数设置、耳部靶点准确定位与刺激电极的正确安放、个体化剂量设定等方面的考虑。 通过 感知阈值（PT）的测定及taVNS的安全给药。

引言

颅神经X，更广为人知的名称是迷走神经，是一条起源于中枢神经系统脑干并延伸至外周的大神经束，支配胸腔和腹腔内的所有主要器官（图1）¹。迷走神经刺激术（VNS）涉及将双极电极外科植入迷走神经的左侧颈部分支周围，并通过植入胸部的脉冲发生器（IPG）向迷走神经输送电脉冲²。尽管目前美国食品药品监督管理局（FDA）已批准VNS用于治疗癫痫、难治性抑郁症和慢性肥胖症，但该操作成本较高，且需要住院并接受手术。VNS的长期安全性已得到充分证实，在过去25年的临床应用中，大多数安全性问题仅涉及与电流强度相关的副作用（如声音嘶哑、咽喉疼痛），未发现严重的刺激相关不良反应³。

近年来，一种称为经皮耳迷走神经刺激（transcutaneous auricular vagus nerve stimulation, taVNS）的无创迷走神经刺激形式逐渐兴起⁴。taVNS 对迷走神经的耳支（auricular branch of the vagus nerve, ABVN）施加电刺激，该神经分支易于接触，支配人类耳部区域⁵。在过去十年中，多个研究团队已证实该方法的安全性和耐受性^6,7,8，包括其对中枢和周围神经系统的影响^9,10，以及在神经精神疾病人群中的行为效应^7,11,12,13。taVNS 还正在被探索作为增强认知功能^14,15和社会功能^16,17,18的潜在有效手段。随着 taVNS 逐渐确立，研究人员和临床医生得以快速转化已报道的迷走神经刺激研究成果，这些研究涵盖多种疾病，包括神经与心理创伤^19,20,21、成瘾²²、炎症²³以及耳鸣^24,25。

原则上，经皮耳迷走神经刺激（taVNS）在方法学上与常规用于治疗肌肉骨骼疼痛疾病的经皮电神经刺激（TENS）相似。²⁶区别在于，经皮耳迷走神经刺激（taVNS）作用于耳部特定的解剖靶点，这些靶点被认为由耳迷走神经分支（ABVN）支配。⁵该领域仍在确定最佳刺激靶点²⁷，尽管最常见的两个刺激位点是外耳道的前壁（耳屏）和耳甲艇。假刺激可通过刺激耳垂进行，该区域被认为几乎无ABVN支配（图2）。或者，假刺激可通过被动对照方法实施，即将电极贴附于活性位点但不施加任何刺激。不同研究组之间的刺激参数可能有所不同，但根据文献报道，刺激通常以脉冲方式给予（脉宽：250–500 μs，频率：10–25 Hz），并以个体化的恒定电流输出<5 mA）。刺激电流因个体和实验方案而异，许多研究团队根据个体的感知阈值（PT）探索不同的刺激强度。感知阈值定义为在目标部位引发可感知感觉所需的最小电流强度，通常通过测定确定 通过 通过本报告所述的定制化序贯测试（PEST）软件进行参数估计。

经皮耳迷走神经刺激（taVNS）是一种安全的技术，可在实验室或临床环境中实施。taVNS的副作用极小，最常见的副作用为皮肤刺激或发红。大多数taVNS研究集中于左侧耳部刺激，因为人们认为这种方法更安全；然而，一项大规模试验的数据（Badran等，2018）显示，右侧刺激并不会增加不良事件的风险。由于关于单侧左侧刺激的文献较为丰富，本文将介绍在实验室研究中用于探究左侧taVNS作为干预手段的典型设置方案。

方案

本实验方案介绍了一种典型的经皮耳迷走神经刺激（taVNS）设置，适用于实验室或临床环境。我们采用直径为8 mm的圆形金属电极，在受试者仰卧位时刺激耳道前壁（耳甲艇）。若需针对其他有效治疗部位，仅需将电极位置调整至耳甲腔即可实现类似方法。所有方法和操作程序均已获得纽约城市学院人类研究保护项目（HRPP）的机构审查委员会（IRB）批准。

1. 材料

1. 确保准备好进行经皮迷走神经刺激（taVNS）所需的所有材料（图3）。taVNS刺激器可以是符合当地安全法规的电池驱动设备，也可以是从常规电源插座供电、并具备内置安全机制以防止意外电涌的设备。必须使用最大输出为5 mA的恒流（电流控制）刺激器。
2. 进行taVNS时，使用由圆形导电金属（如锡、Ag/AgCl、金）制成并结合导电介质（如电解质凝胶或导电膏）的刺激电极（见材料表）。或者，也可使用由柔性导电碳电极与导电凝胶组成的电极，此类电极可能带有粘性，也可能不带。切勿在没有导电介质的情况下直接将电极贴于皮肤，否则可能对受试者造成不必要的风险，并引起不适或疼痛。
3. 使用运行脚本软件的计算机（参见材料表），该软件经过编程，用于控制刺激器并以特定参数启动刺激。这些参数包括电流强度（mA）、脉冲宽度（μs）、频率（Hz）、占空比（开启/关闭时间，s）以及刺激持续时间（min）。
4. 在将电极贴附于耳部之前，使用酒精棉片（70%异丙醇）清洁皮肤表面。此举可去除皮肤表面的油脂，降低皮肤电阻，确保刺激在安全的功率水平下进行。

2. 耳部定位与皮肤准备

1. 在研究环境中进行经皮耳迷走神经刺激（taVNS）时，采用以下一般纳入标准：年龄18–70岁，无面部或耳部疼痛，无近期耳部外伤，无金属植入物（包括起搏器），非妊娠状态。
2. 在实验室环境中针对健康受试者开展实验时，采用以下排除标准：个人或家族有癫痫、情绪障碍或心血管疾病史，酒精依赖或近期使用非法药物，正在使用任何已知会增加癫痫风险的药理学制剂。
3. 让受试者平躺或采取其他放松体位，坐在舒适的床或椅子上，双腿抬高，头部有支撑。
4. 检查受试者的左耳，确保未佩戴任何首饰，并清除所有化妆品和润肤霜。确认刺激部位无皮肤相关的禁忌证，包括晒伤、 cuts（皮肤破损）、病变或开放性溃疡。
5. 确定刺激靶点，该靶点位于外耳道前壁，体表标志为耳屏。刺激将作用于耳屏正后方的耳道区域（图4）。
6. 使用酒精棉片轻轻擦拭刺激靶点区域，包括耳道内外，以降低皮肤电阻，提高导电性。

3. 电极制备与放置

1. 若使用非一次性电极，请目视检查电极，确保其表面清洁且无腐蚀。应确保电极已消毒，以防止受试者之间细菌传播。可使用酒精或消毒湿巾擦拭电极完成消毒。若使用一次性电极，则跳至步骤3.2。
2. 将导电膏均匀地涂抹在电极表面一层薄层，以将电流均匀传递至刺激部位。对于直径为8 mm的圆形电极，豌豆大小的导电膏用量已足够。使用细小的木质涂药棒将导电膏涂抹成一层厚度小于<1 mm的薄层，两个电极均需如此处理。
3. 在刺激设备关闭状态下，将电极导线连接至设备，并确认电极的极性（红色/正极：阳极；黑色/负极：阴极）。此步骤至关重要，因为靶向刺激具有极性特异性——阳极（红色/正极端子）应置于外耳道内，接触外耳道前壁；阴极（黑色/负极端子）则置于耳廓外部，附着于耳珠部位。若进行假刺激（sham stimulation），则将阳极置于耳廓前侧。
4. 将弹簧电极夹固定在耳珠上，使阳极与外耳道前壁接触，阴极与耳珠前部接触。
   注意：若进行假刺激，可将电极夹固定在耳垂（主动对照）。或者，也可通过将刺激夹连接至激活部位但不施加电流的方式进行假刺激（被动对照）。
5. 由于受试者会感受到电极夹在耳部产生的压力，需确保该压力不会引起不适，或影响局部血流（如夹持部位皮肤发白或受试者感到疼痛）。此后，进入感知阈值（PT）的测定，具体方法将在下一步骤中描述。

4. 感知阈值（PT）的测定

注意：感知阈值是用于确定经皮耳迷走神经刺激（taVNS）刺激强度的关键数值。该值定义为在皮肤上感知到电刺激所需的最小电流，这种感觉通常被描述为刺痛或麻刺感。

1. 使用简单的升步和降步二分法参数搜索来确定感觉阈值（PT）。首先打开刺激器，并将输出设置为 3 mA。以目标脉宽（通常为 250–500 μs）和频率（25 Hz，可根据应用调整）输送持续 1 秒的经皮耳迷走神经刺激（taVNS）脉冲序列。
2. 询问受试者是否感觉到刺激。通常报告的感觉为一种 "搔痒" 或 "刺破" 感觉
   1. 如果为“是”，将刺激强度降低50%并重复步骤4.2；如果为“否”，将刺激强度增加50%并重复步骤4.2。
3. 重复步骤 4.2 中所述过程，直至记录至少 4 次 "是" 4 的响应^th “是”的应答必须出现在“否”的应答之后。PT 的强度（单位：mA）为受试者第四个“是”应答所对应的数值。
4. 示例 PT 阈值的确定方法如下所列 表1 以协助进行凝血酶原时间（PT）测定。

5. 传递刺激

1. 当受试者处于舒适状态，刺激电极已正确连接至目标部位，并在设定的脉冲宽度和频率下确定了感知阈值后，开始进行刺激。
2. 使用一台运行脉冲生成图形用户界面软件（例如 stimDesigner，本稿件附带的免费软件）的计算机，连接数据采集单元（DAQ），以驱动刺激系统。该软件应输出可编程设置的 TTL 脉冲（图5）。TTL 脉冲将通过 BNC 电缆发送至刺激器的 "触发输入"端口。该软件与刺激器的接口可调节频率、占空比（开启/关闭时间）以及会话持续时间（图6）。本研究使用的图形界面软件作为免费开源资源随本稿件提供。
   1. 确保以高于阈值的强度进行刺激，例如感知阈值（PT）的 200%^8,9。例如，若感知阈值确定为 0.8 mA，则刺激强度应设为 1.6 mA。
   2. 在进行长时间刺激时，应遵循占空比的相关指导原则。典型的占空比设置为 30–60 秒的 "开启"时段和 60–120 秒的 "关闭"时段，即占空比为 20–50%。
   3. 可调整刺激会话的持续时间（总时长）。研究表明，在 25% 占空比下进行 30–60 分钟的刺激是安全的，且无任何急性副作用或不良事件。此类会话可重复进行，两次会话之间间隔 12–24 小时是安全的。
      注意：对于更长的刺激时间、更高的占空比（>40%）、加速刺激范式以及更高电流剂量的刺激，经皮迷走神经刺激（taVNS）的安全性尚不明确。

6. 经皮耳迷走神经刺激后

1. 刺激完成后，记录有关刺激不适感和副作用的客观数据。尽管经皮耳迷走神经刺激（taVNS）与可植入式迷走神经刺激（VNS）类似，安全性顾虑有限^8,28，但仍需监测并记录受试者的感知程度、不适感以及任何不良事件，评分范围为0–10²⁹。
2. 从耳部取下刺激电极，并使用酒精棉片清除受试者耳部残留的导电膏。
3. 电极从受试者耳部取下后，立即用酒精清洁并消毒刺激电极。
4. 检查刺激部位耳部是否有发红或刺激现象，并记录任何观察结果。

结果

当进行适当的皮肤准备后，感知阈值与刺激脉冲宽度呈负相关。随着脉冲宽度的增加，感知阈值降低（图7）。本研究团队早期在符合上述纳入/排除标准的健康个体中开展的研究表明，综合总体感知阈值（n=15，女性7人，平均年龄26.5 ± 4.99岁）在100 μs时为3.92 ± 1.1 mA；200 μs时为2.24 ± 0.74 mA；500 μs时为1.24 ± 0.41 mA。这些阈值提示，对于500 μs脉冲宽度参数的刺激，需要使用最大输出电流可达5 mA的恒流刺激器；而对于更窄的脉冲宽度，则至少需要10 mA的刺激器（表2）。此外，必须对电流进行精细调节，调节步长需达到0.1 mA，以实现精确刺激。

以最大耐受强度（PT）的200%进行刺激是可耐受的，且相对无痛，这一点已通过疼痛数字评分量表（NRS）得到证实^9,30。NRS量表是一种0到10分的疼痛评估系统，用于个体报告疼痛或不适程度²⁹。主动刺激组与假刺激组报告的疼痛水平均较低（所有刺激脉宽下的NRS评分均<3）。更具体而言，以25 Hz频率、500 μs生物学有效脉宽进行刺激时，平均疼痛评分为：主动刺激组 = 1.98 ± 0.83，假刺激组 = 2.17 ± 1.27（n=25，女性9人，平均年龄25.16 ± 4.16岁）（表3）。其他参数的疼痛评分不高于25 Hz条件下的评分，详细数据可参见该研究团队此前的工作³⁰。

已有大量文献报道，每次持续30分钟至1小时、占空比为20%–50%的治疗方案具有良好的安全性和耐受性，部分研究在同一天内进行了多次治疗，各次治疗间隔12–15小时^12,31。在多项实验系列中，60名受试者参与了研究，每人接受1至8次重复访视，每次访视间隔至少24小时，期间未报告任何严重不良事件。

根据本文所述方法给予的经皮迷走神经刺激（taVNS），已被证明能够调节自主神经系统，诱导功能性脑活动变化（通过fMRI BOLD信号测量），并已开展初步研究用于治疗神经精神疾病及辅助康复治疗。

图1迷走神经传出投射与横切面 (A) 迷走神经的传出投射支配全身各个主要器官，对机体功能产生广泛影响B) 迷走神经横切面，显示神经内部解剖结构呈一系列 所有神经束均包含于一条主要通路中。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的耳部靶点。 刺激外耳道前壁可靶向耳前支迷走神经（ABVN），其解剖标志主要包括耳屏（A1）或耳甲艇（A2）。假刺激则施加于耳垂（S）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：关键组件。 正确实施经皮耳迷走神经刺激（taVNS）所需的最低限度组件如下：（A）耳部刺激电极，（B）导电凝胶和酒精清洁垫，（C）能够发送和接收TTL脉冲的计算机，以及用于触发刺激的（D）恒流刺激器。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：示例装置。该照片显示一名受试者在接受左侧耳部经皮迷走神经刺激（taVNS）的同时，处于准备执行实验范式的体位。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：用于刺激的图形用户界面（GUI）截图。请点击此处查看此图的放大版本。

图6：电刺激波形的调控。可按照不同参数施加直接的方波电流传导。该图展示了可调节的波形关键特性，以实现期望的生物学效应。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：脉宽增加时的感知阈值。随着脉宽增加，感知阈值（PT）降低。大多数健康个体的感知阈值将位于这些均值的2个标准差（SD）范围内。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：如何确定感知阈值（PT）的示例。 该表格展示了一个用于参数化确定PT的是/否回答序列示例。

表 2：刺激电流强度。 各脉冲宽度下刺激电流的数值（单位：mA，200% PT，n=15）。

表3：推荐刺激参数下的感觉阈值、刺激电流及疼痛值。 各脉宽下刺激电流值（mA，为感觉阈值的200%，n=25）。

补充文件：本实验方案中使用的免费软件图形用户界面。 请点击此处下载该文件。

讨论

与所有新型干预方法一样，上述所有步骤对于经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的安全实施至关重要。最核心的关注点是受试者的安全，这不仅包括在taVNS实施前通过适当的筛查来降低风险，还包括在刺激过程中持续监测受试者是否出现不适、疼痛或不良事件。以下是实施taVNS时需考虑的三个最重要方面。taVNS禁忌症的筛查——禁忌症包括：任何当前或既往的心血管系统疾病史、面部或耳部疼痛、近期耳部外伤、颈部以上部位有金属植入物。为正确进行受试者皮肤准备，使用酒精清除皮肤表面的油脂、污垢或化妆品，有助于提高电极的导电性，降低刺激器工作所需的刺激电压，最终使刺激过程更可耐受且更安全。建议使用符合低输出经颅电刺激（LOTES）指南³²的刺激器和电极。LOTES为用于头颈部刺激的电刺激设备设定了指南和行业标准，建议各研究团队在自行构建系统前阅读该文件。推荐使用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的即插式刺激器（见材料表），或使用低电压（<50 V）、电池供电、具备内置适当安全措施的恒流刺激器，以避免向刺激部位意外过量输送电流。应确保所用电极是专为taVNS应用而制造和组装的。若使用实验室自制的定制化系统，应确保遵循当前的制造与工程规范作为参考依据。

对于经皮耳迷走神经刺激（taVNS），需考虑的一个因素是确保恒流刺激器的电压输出能够克服皮肤电阻，从而输送刺激所需的电流。欧姆定律（V=IR）描述了电流（I）与皮肤电阻（R）之间的关系。建议使用输出电压至少为20 V的台式刺激器，以避免系统功率不足。头皮或环境产生的热量可能导致导电膏性能下降。若发生这种情况，建议停止刺激，并使用新的导电膏重新准备皮肤和电极。

经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的一个局限性在于其庞大的参数空间。目前尚不清楚脉宽和频率哪一个更为重要。近期的taVNS试验中缺乏能够回答此类问题的数据。各种行为效应来源于不同的脉宽、频率和刺激电流^{13,33,34,35,36,37,38,39}。

目前认为，500 µs 的脉宽具有最强的生物学活性⁹。在频率方面，已有研究表明 25 Hz 是一种有效的刺激频率，但当前仍在探索更优参数，例如更高频率（>25 Hz）、双侧刺激（左右耳）以及试验性的脉冲模式。未来需要开展研究，进一步探索刺激参数、替代刺激部位以及占空比优化等问题，以推动和优化经皮耳迷走神经刺激（taVNS）方法。

经皮耳迷走神经刺激（taVNS）是一种有前景的非侵入性替代传统迷走神经刺激（VNS）的方法。taVNS 提供了一种经济实惠（在所展示的实验装置中低于<5,000 美元，具体成本高度依赖所用刺激器的类型）且操作简便的方法，可用于将动物模型中探索 VNS 治疗多种疾病所获得的积极成果进行转化，非侵入性地调节自主神经系统，并有望实现小型化和优化，用于家庭环境下的神经调节，以治疗神经精神类及其他疾病。

经皮耳迷走神经刺激（taVNS）的未来潜力和可能应用十分广泛。taVNS可作为治疗抑郁症和癫痫等神经精神疾病的一种有前景的辅助或独立疗法，可用于与康复训练相结合以恢复或加速行为学习⁴⁰，减轻炎症反应^41,42，还可能用于增强个体表现力和自主神经功能^8,10。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 异丙醇擦拭片	任意品牌	不适用	任何适用于皮肤的酒精消毒垫均可使用
恒流刺激器（可触发）	Soterix Medical	不适用	由 Soterix Medical 生产的定制用途刺激器
一次性导电电极	定制制作	不适用	刺激电极由城市学院神经工程实验室（Badran/Bikson）自行定制制作
带刺激GUI的Matlab软件	MathWorks	不适用	使用MATLAB编程生成脉冲模式
Ten20 导电膏	Weaver and Company	不适用	用于施加刺激的导电膏