时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca2+ 信号传导中的应用

摘要

基因编码的 Ca²⁺ 指示剂（GECIs）彻底改变了原位Ca²⁺ 进行成像。为了从此类记录中最大限度地回收数据，需对Ca²⁺ 信号是必需的。本文中的方案有助于Ca的定量分析²⁺ 使用时空映射和基于粒子的分析在原位记录的信号。

摘要

对完整组织中分离的细胞或特定类型细胞进行 Ca²⁺ 成像，常可揭示复杂的 Ca²⁺ 信号模式。为了尽可能获取有关基础生物学事件的全部信息，此类活动需要进行细致而深入的分析与定量。Ca²⁺ 信号固有的空间、时间和强度参数，如频率、持续时间、传播、速度和振幅，可能提供细胞内信号传导所需的某些生物学信息。高分辨率 Ca²⁺ 成像通常会产生大量数据文件，将成像信息转化为可量化数据的过程耗时较长，且容易受到人为误差和偏倚的影响。对原位细胞 Ca²⁺ 信号的分析通常依赖于在视野（FOV）内任意选择的兴趣区域（ROI）进行简单的强度测量，这种方法忽略了 FOV 中包含的大量重要信号信息。因此，为了最大限度地从使用 Ca²⁺ 染料或光遗传学 Ca²⁺ 成像所获得的高分辨率记录中提取信息，必须对 Ca²⁺ 信号进行适当的空间和时间分析。本文所述方案将介绍如何通过基于时空图（STM）的分析与基于粒子的分析相结合的方法，从 Ca²⁺ 成像记录中获取大量数据，以促进对细胞记录的 Ca²⁺ 信号进行更全面的分析与定量。这些方案还描述了如何适当地分析不同细胞群体中原位观察到的不同模式的 Ca²⁺ 信号。为说明该方法，将以小肠中一种特化的细胞群体—— Cajal 间质细胞（ICC）为例，使用 GECI 探针研究其 Ca²⁺ 信号活动。

引言

Ca²⁺ 是一种普遍存在的细胞内信使，可调控多种细胞过程，如肌肉收缩^1,2、代谢³、细胞增殖^3,4,5、神经末梢神经递质释放的刺激^6,7，以及细胞核内转录因子的激活⁷。细胞内 Ca²⁺ 信号通常表现为胞质溶胶中 Ca²⁺ 浓度的瞬时升高，其可为自发产生，也可由不同细胞类型的激动剂刺激引发⁸。Ca²⁺ 信号固有的空间、时间和强度参数，如频率、持续时间、传播性、速度和振幅，可提供细胞内信号传导所需的生物学信息^5,7,9。胞质 Ca²⁺ 信号可源于细胞外空间的 Ca²⁺

方案

本研究中使用的所有动物及实验方案均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。所有实验程序均经内华达大学里诺分校机构动物使用与护理委员会批准。

1. KitGCaMP6f 小鼠的制备

1. 将 Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D（GCaMP6f 小鼠）与 c-Kit^+/Cre-ERT2（Kit-Cre 小鼠）杂交，以获得特异性在 ICC 中表达 GCaMP6f 的动物（Kit-Cre-GCaMP6f 小鼠）。
   注意：选用 GCaMP6f 是因其在原位和活体中报告局部、短暂的细胞内 Ca²⁺ 信号具有较高效率⁵⁴。
2. 在 6–8 周龄时向 Kit-Cre-GCaMP6f 小鼠注射他莫昔芬，以诱导 Cre 重组酶活化，继而在 ICC 中表达 GCaMP6f（图 1）。
   1. 配制他莫昔芬溶液：将 80 mg 他莫昔芬（见材料表）溶解于 800 μL 乙醇（见材料表）中，置于比色皿内涡旋振荡 20 分钟。
   2. 加入 3.2 mL 红花油（通用型），配制成 20 mg/mL 的溶液，注射前超声处理 30 ....

结果

利用 Kit-Cre-GCaMP6F 小鼠（图 1），可在原位成像胃肠道中 ICC 的动态 Ca²⁺ 信号行为。通过共聚焦显微镜，可获得特定 ICC 群体的高分辨率图像，且不会受到同一组织中其他解剖学层面不同的 ICC 群体信号的干扰（图 2A）^37,39,40,41。该方法能够记录持续时间短暂（<100 ms）、局灶性的 Ca²⁺ 事件，而此类事件使用膜通透性 Ca²⁺ 指示剂无法实现。通过 Volumetry 或 ImageJ 软件进行时空映射，可在原位生成细胞内所有 Ca²⁺ 事件的时空图谱（STM）。.......

讨论

对完整组织内或细胞网络中特定类型细胞的 Ca²⁺ 成像通常会揭示复杂的 Ca²⁺ 瞬变模式。此类活动需要进行细致而深入的分析与量化，以尽可能获取有关这些事件及其动力学特征的更多信息。STM 和 PTCL 分析方法能够最大限度地从此类记录中提取定量数据。

ICC-DMP 细胞呈细长的纺锤形形态，这种形态非常适合采用上述 STM 方法进行分析。然而，这种分析方法并不适用于呈星状且相互连接成网络结构的 ICC-MY 细胞（图 3A）。此外，ICC-MY 中的 Ca²⁺ 信号模式更为复杂，表现为从 ICC-MY 网络中多个起始位点传播的钙瞬变波（CTC）。因此，为了量化在某一视野（FOV）内整个 ICC-MY 网络中的活动情况，我们采用了一套自行开发的软件（Volumetry，版本 G8d，GWH，适用于 Mac OS 系统）进行颗粒（PTCL）分析（如需获取 Volumetry 的使用权限或相关咨询，请联系 Grant Hennig，邮箱：grant.hennig@med.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ImageJ 软件	NIH	1.5a	ImageJ 软件
体积测量	GWH	体积测量 8Gd	定制分析软件
异氟烷	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
他莫昔芬	Sigma	T5648
GCaMP6F 小鼠	杰克逊实验室	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre 小鼠	由 Dieter Saur 博士惠赠	c-Kit+/Cre-ERT2
乙醇	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6