时空映射与颗粒分析技术在原位定量细胞内 Ca2+ 信号传导中的应用

摘要

基因编码的 Ca²⁺ 指示剂（GECIs）彻底改变了原位Ca²⁺ 进行成像。为了从此类记录中最大限度地回收数据，需对Ca²⁺ 信号是必需的。本文中的方案有助于Ca的定量分析²⁺ 使用时空映射和基于粒子的分析在原位记录的信号。

摘要

对完整组织中分离的细胞或特定类型细胞进行 Ca²⁺ 成像，常可揭示复杂的 Ca²⁺ 信号模式。为了尽可能获取有关基础生物学事件的全部信息，此类活动需要进行细致而深入的分析与定量。Ca²⁺ 信号固有的空间、时间和强度参数，如频率、持续时间、传播、速度和振幅，可能提供细胞内信号传导所需的某些生物学信息。高分辨率 Ca²⁺ 成像通常会产生大量数据文件，将成像信息转化为可量化数据的过程耗时较长，且容易受到人为误差和偏倚的影响。对原位细胞 Ca²⁺ 信号的分析通常依赖于在视野（FOV）内任意选择的兴趣区域（ROI）进行简单的强度测量，这种方法忽略了 FOV 中包含的大量重要信号信息。因此，为了最大限度地从使用 Ca²⁺ 染料或光遗传学 Ca²⁺ 成像所获得的高分辨率记录中提取信息，必须对 Ca²⁺ 信号进行适当的空间和时间分析。本文所述方案将介绍如何通过基于时空图（STM）的分析与基于粒子的分析相结合的方法，从 Ca²⁺ 成像记录中获取大量数据，以促进对细胞记录的 Ca²⁺ 信号进行更全面的分析与定量。这些方案还描述了如何适当地分析不同细胞群体中原位观察到的不同模式的 Ca²⁺ 信号。为说明该方法，将以小肠中一种特化的细胞群体—— Cajal 间质细胞（ICC）为例，使用 GECI 探针研究其 Ca²⁺ 信号活动。

引言

Ca²⁺ 是一种普遍存在的细胞内信使，可调控多种细胞过程，如肌肉收缩^1,2、代谢³、细胞增殖^3,4,5、神经末梢神经递质释放的刺激^6,7，以及细胞核内转录因子的激活⁷。细胞内 Ca²⁺ 信号通常表现为胞质溶胶中 Ca²⁺ 浓度的瞬时升高，其可为自发产生，也可由不同细胞类型的激动剂刺激引发⁸。Ca²⁺ 信号固有的空间、时间和强度参数，如频率、持续时间、传播性、速度和振幅，可提供细胞内信号传导所需的生物学信息^5,7,9。胞质 Ca²⁺ 信号可源于细胞外空间的 Ca²⁺ 内流，或通过内质网（ER）中的 Ca²⁺ 释放通道（如雷诺丁受体（RyRs）和三磷酸肌醇受体（IP₃Rs））释放 Ca²⁺ 所致¹⁰。RyRs 和 IP₃Rs 均可参与 Ca²⁺ 信号的生成，这些通道的协同开放，结合多种 Ca²⁺ 内流机制，可产生多种多样的 Ca²⁺ 信号模式，其形态受 Ca²⁺ 内流通道的数量和开放概率、Ca²⁺ 释放通道的表达谱、Ca²⁺ 内流与释放通道之间的空间邻近性，以及 Ca²⁺ 重摄取和外排蛋白的表达与分布所调控。Ca²⁺ 信号可表现为均匀、持久、高强度的全局性振荡，持续数秒甚至数分钟；也可表现为在细胞内和细胞间传播的 Ca²⁺ 波，其可跨越超过 100 µm 的细胞内距离^{10,11,12,13,14,15,16}；或表现为更短暂、空间上局限的事件，如 Ca²⁺ 闪烁（sparks）和 Ca²⁺ 爆发（puffs），其发生时间尺度为数十毫秒，扩散范围小于 5 µm^17,18,19,20。

荧光显微镜已广泛用于监测分离培养的细胞以及完整组织中的 Ca²⁺ 信号。传统上，这些实验使用荧光 Ca²⁺ 指示剂，包括比率型和非比率型染料，如 Fura2、Fluo3/4 或 Rhod2 等^21,22,23。这些指示剂被设计为可穿透细胞膜，随后通过内源性酯酶裂解酯基而被细胞截留。当细胞和组织被适当波长的光照射时，Ca²⁺ 与高亲和力指示剂结合会引起荧光变化。细胞可渗透 Ca²⁺ 指示剂的使用极大地增进了我们对活细胞中 Ca²⁺ 信号传导的理解，并实现了对这些信号的空间分辨与定量分析，而这是通过其他方法（如电生理学）检测 Ca²⁺ 信号所无法实现的。然而，传统的 Ca²⁺ 指示剂存在若干局限性，例如在长时间记录过程中会发生光漂白²⁴。尽管较新的 Ca²⁺ 指示剂染料（如 Cal520/590）显著提高了信噪比以及检测局部 Ca²⁺ 信号的能力²⁵，但光漂白问题对部分研究者而言仍是一个关注点^26,27,28。急剧的光漂白还限制了可用于记录的放大倍数、图像采集速率和分辨率，因为提高物镜功率和加快图像采集速率需要更强的激发光强度，从而加剧光漂白。

当在原位记录Ca²⁺信号时，传统Ca²⁺指示剂染料的这些局限性尤为突出，例如从完整组织中记录细胞内Ca²⁺信号时。由于上述问题，使用细胞通透性Ca²⁺指示剂在原位可视化Ca²⁺信号通常仅限于低倍放大和较低的图像采集速率，这限制了研究人员记录和量化时空上受限的亚细胞Ca²⁺信号的能力。因此，难以捕捉、分析并充分认识Ca²⁺信号在空间和时间上的复杂性，而这种复杂性在产生特定生物学反应过程中可能至关重要，如上所述。对原位细胞Ca²⁺信号的分析通常依赖于在视野（FOV）内选定的兴趣区域（ROI）进行简单的强度测量。ROI的数量、大小和位置的选择具有任意性，取决于研究者的主观判断，这可能严重偏倚所得结果。除了ROI分析本身固有的偏差外，该方法还忽略了视野中包含的大量重要信号信息，因为仅选择在任意划定的ROI内发生的动态Ca²⁺事件进行分析。此外，ROI分析无法提供有关所观察到的Ca²⁺信号空间特征的信息。例如，仅通过ROI内Ca²⁺信号的统计结果，可能无法区分由传播性Ca²⁺波引起的Ca²⁺升高与高度局限性的Ca²⁺释放事件。

基因编码的钙指示剂的出现²⁺ 指示剂（GECIs）彻底改变了Ca²⁺ 可以进行成像 原位^{29,30,31,32,33}使用GECI相较于染料具有多个优势。其中最重要的或许是GECI可实现细胞特异性表达，从而减少非目标细胞带来的背景干扰。GECI相较于传统Ca²⁺ 与染料标记的样本相比，一个指标是光漂白现象减少（因为只有在细胞处于活跃状态时才会发生荧光，进而产生光漂白），尤其是在高倍率和高成像速率下更为明显。³⁴因此，利用GECI（如光遗传学传感器GCaMP系列）进行成像，使研究人员能够记录短暂且局域化的亚细胞Ca²⁺ 信号 原位 并研究Ca²⁺ 在细胞的天然环境中实现此前无法完成的信号传导研究。为了从这些高分辨率记录中最大限度地获取信息，需对Ca进行适当的空间和时间分析²⁺ 信号是必需的。需要注意的是，尽管GECI可能具有一些明显优势，但最近的研究表明Ca²⁺ 利用常规Ca，可同时对大量不同神经化学类别神经元群体成功进行成像²⁺ 非遗传编码的指示剂³⁵该方法采用事后免疫组织化学技术，揭示了多种不同类型的神经元以高频同步簇状放电，避免了动物基因改造可能对研究者希望了解的生理行为造成的干扰^35,36.

本文所述方案有助于更全面地分析和定量检测Ca²⁺ 使用基于时空图（STM）分析与基于粒子的分析相结合的方法，记录来自原位细胞的信号。这些方案还描述了不同模式的Ca²⁺ 原位观察到的不同细胞群体中的信号传导可得到适当分析。为作说明，该方法将检测Ca²⁺ 小肠中一种特化细胞群体—— Cajal 间质细胞（ICC）的信号传导。ICC 是胃肠道（GI）中的一类特化细胞，具有动态的细胞内 Ca²⁺ 使用表达GCaMPs的小鼠可视化信号传导^{37,38,39,40,41,42}. 钙²⁺ ICC中的瞬变与Ca激活相关²⁺-激活的 Cl^- 通道（由编码） Ano1) 在调控肠道平滑肌细胞（SMCs）兴奋性方面具有重要作用^43,44,45因此，对Ca的研究²⁺ ICC 中的信号传导对于理解肠道运动功能至关重要。小鼠小肠是进行此类演示的极佳范例，因为其中存在两类在解剖上相互分离且可独立观察的 ICC：i）ICC 位于环形肌与纵行平滑肌层之间，环绕肌间神经丛（ICC-MY）。这些细胞作为起搏细胞，产生称为慢波的电活动。^46,47,48,49；ii) ICC 也位于富含运动神经元末梢的神经丛中（即深层肌间神经丛，因此称为 ICC-DMP）。这些细胞在肠源性运动神经传递反应中起中介作用^37,39,40,50ICC-MY 和 ICC-DMP 在形态上存在差异，且其 Ca²⁺ 信号行为因各自特定功能而存在显著差异。ICC-MY 呈星状，通过缝隙连接形成相互连通的细胞网络^51,52. Ca²⁺ ICC-MY中的信号表现为短暂且空间局限的Ca²⁺ 通过ICC-MY网络在多个位点异步发生的释放事件，如在视野内（使用60倍物镜成像）所观察到的³⁸这些异步信号在时间上被组织成1秒的簇，当它们被汇总在一起时，相当于细胞内Ca²⁺净上升持续1秒。²⁺这些信号在ICC网络内进行细胞间的传播，从而调控Ca²⁺ 信号，由亚细胞位点产生，传递至组织范围的Ca²⁺ 波。Ca²⁺的时间聚类与整合²⁺ ICC-MY中的信号被称为Ca²⁺ 循环肿瘤细胞簇（CTCs）³⁸CTC 在小鼠中以节律性方式出现（例如，每次 CTC 持续时间相近，且 CTC 之间的周期相似），每分钟约发生 30 次。相反，ICC-DMP 呈纺锤形细胞，部分具有二级突起，分布于 SMC 和曲张的神经突起之间，且不独立形成网络^51,52ICC-DMP 与 SMC 形成缝隙连接，并在这一更大的合胞体（即 SIP 合胞体）中发挥功能⁵³. Ca²⁺ 信号在细胞的多个位点沿其长度方向出现，但这些瞬时信号并未像在ICC-MY中观察到的那样发生同步化或在时间上成簇出现。³⁷. Ca²⁺ ICC-DMP 中的信号以随机方式发生，具有可变的强度、持续时间和空间特征。以下方案以 Ca²⁺ 在ICC-MY和ICC-DMP中研究信号传导，描述原位分析特定细胞类型复杂信号传导的技术。我们采用了可诱导的Cre-Lox p 系统在由ICC特异性启动子驱动的Cre重组酶（Cre）激活后，特异性地在ICC中表达GCaMP6f试剂盒).

方案

本研究中使用的所有动物及实验方案均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。所有实验程序均经内华达大学里诺分校机构动物使用与护理委员会批准。

1. KitGCaMP6f 小鼠的制备

1. 将 Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D（GCaMP6f 小鼠）与 c-Kit^+/Cre-ERT2（Kit-Cre 小鼠）杂交，以获得特异性在 ICC 中表达 GCaMP6f 的动物（Kit-Cre-GCaMP6f 小鼠）。
   注意：选用 GCaMP6f 是因其在原位和活体中报告局部、短暂的细胞内 Ca²⁺ 信号具有较高效率⁵⁴。
2. 在 6–8 周龄时向 Kit-Cre-GCaMP6f 小鼠注射他莫昔芬，以诱导 Cre 重组酶活化，继而在 ICC 中表达 GCaMP6f（图 1）。
   1. 配制他莫昔芬溶液：将 80 mg 他莫昔芬（见材料表）溶解于 800 μL 乙醇（见材料表）中，置于比色皿内涡旋振荡 20 分钟。
   2. 加入 3.2 mL 红花油（通用型），配制成 20 mg/mL 的溶液，注射前超声处理 30 分钟。
   3. 连续三天，每天通过腹腔注射（IP）给予小鼠 0.1 mL 他莫昔芬溶液（含 2 mg 他莫昔芬）。通过基因分型确认 GCaMP6f 的表达，并在首次注射后第 10 天使用小鼠。
      1. 通过剪取每只小鼠耳部小片组织进行基因分型。采用 HotSHOT 法⁵⁵提取基因组 DNA：将耳组织片段置于 75 mL NaOH 中，95 °C 孵育 60 分钟，随后加入 75 mL Tris 缓冲液中和。使用标准 PCR 方法鉴定每只小鼠的基因型，在 20 mL 反应体系中加入 2 mL DNA 及针对 GCaMP6f 的特异性引物⁵⁶。取 10 mL PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，区分野生型（297 bp）和突变型（约 450 bp）条带。

2. 组织样本的钙检测前处理²⁺ 成像

1. 在通风橱中通过吸入异氟烷（4%，参见材料表）对小鼠进行麻醉，随后通过颈椎脱位处死。
2. 使用锋利的剪刀切开小鼠腹部，取出小肠并置于Krebs-Ringer碳酸氢盐溶液（KRB）中。沿肠系膜缘剪开小肠，并用KRB溶液冲洗清除管腔内容物。使用精细解剖方法去除黏膜层和黏膜下层。
   注意：KRB溶液的成分为（单位：mM）：NaCl 118.5，KCl 4.7，CaCl₂ 2.5，MgCl₂ 1.2，NaHCO₃ 23.8，KH₂PO₄ 1.2，葡萄糖 11.0。当该溶液在95% O₂-5% CO₂混合气体中平衡后，在37 °C时pH值为7.4。
3. 使用小号图钉将小肠组织固定于5 mL体积、直径60 mm的Sylgard包被培养皿底部，使环行平滑肌层朝上。用预热至37 °C的KRB溶液持续灌流组织，实验前平衡孵育1小时。
4. 平衡孵育结束后，使用共聚焦显微镜对小肠中的ICC-MY和ICC-DMP进行原位Ca²⁺成像（本方案中的图像采用配备旋转盘的共聚焦显微镜获取）。由于上文所述GECIs的优势，应结合高倍物镜（60–100倍）采集高分辨率时间序列图像（>30帧/秒，FPS），以记录ICC中动态Ca²⁺信号的视频。
   注意：为减少组织运动，可在记录过程中加入尼卡地平（0.1–1 μM），方法如先前文献所述^{37,38,39,40,41}。
5. 通过解剖位置、形态特征及基础Ca²⁺活动模式的差异，在小肠中区分ICC-MY与ICC-DMP。
   1. ICC-MY位于小肠环行与纵行平滑肌层之间的肌间神经丛水平，呈星状，形成相互连接的网络结构（图3A）。如上所述的CTC（钙瞬变簇）以约每分钟30次的规律频率在ICC-MY网络中传播。
   2. 相反，ICC-DMP位于深肌层神经丛水平，处于环行平滑肌层与黏膜下神经丛之间的一个单层平面内。ICC-DMP不形成网络结构，呈纺锤形细胞（图2A），无规律性传播事件，而是表现出随机的、局灶性的胞内Ca²⁺瞬变。
6. 无论使用何种采集软件，均应将视频保存为TIFF图像序列堆栈格式。

3. 使用时空映射法（STM）分析 ICC-DMP 中的随机 Ca²⁺ 信号

1. 使用 ImageJ 软件（NIH，美国，可免费下载于 http://imagej.nih.jov/ij）和定制软件（Volumetry，版本 G8d，GWH，适用于 Mac OS；有关 Volumetry 的使用与访问咨询，请联系 Grant Hennig，邮箱：grant.hennig@med.uvm.edu）相结合的方法，对 ICC-DMP 进行时空图谱分析
   注意： 在后续部分（从步骤 3.9 开始）也提供了仅使用 ImageJ 完全分析这些时空图的另一种方法。
2. 打开 Volumetry，使用鼠标右键点击以打开包含电影文件的文件夹。左键点击待分析的电影文件，将其在 Volumetry 中打开（必须为未压缩的 TIFF 格式）。文件打开后，电影将显示在一个蓝色边框的窗口（电影窗口）中，占据屏幕右侧的大部分区域。屏幕左侧则包含绘图窗口（上部占 4/5）和轨迹窗口（下部占 1/5）^th).
3. 按住 SHIFT 键的同时，向上滚动鼠标中键（MMB，缩小尺寸）或向下滚动鼠标中键（MMB，放大尺寸），以调整视频尺寸。按下“A”键可开始或停止播放；通过按上下方向键可调节播放速度。
4. 使用体积测量法创建STM时，按住 SHIFT 键并用鼠标左键点击拖动，在整个细胞上绘制一个感兴趣区域（ROI）。通过使用鼠标中键（MMB）在ROI的角点处滚动，调整ROI的方向。当ROI已正确放置在待分析的细胞上时（图2A），在电影窗口中使用右键单击以访问“ROI STMs – STMyAvg”>xRow’，然后单击鼠标左键，在绘图窗口中创建细胞活动的STM图（也可选择‘STMxAvg’选项）>y行’，具体选择哪一个取决于细胞的朝向更接近x轴还是y轴，例如被高亮显示的细胞 图2A 更倾向于 y 轴方向。
5. 在图像窗口中左键单击STM图像，按“P”键以扣除平均背景噪声，按“H”键以增强STM图像对比度。通过右键单击STM图像，选择“STM Load Save - Save STM as .tif”，然后左键单击将其保存为TIFF格式文件。
6. ICC-DMP 的其余分析将在 ImageJ 中进行。ImageJ 包含两个主要组成部分：位于显示器顶部固定位置的工具栏和一个可移动的用户界面。使用 ImageJ 打开 ICC-DMP Ca 的 STM TIFF 文件²⁺ 活性（在 ImageJ 工具栏中选择文件-打开）。
7. 打开创建的体积测量STM图像，该图像的时间轴为垂直方向。ImageJ将自动以RGB或16位图像格式打开TIFF文件。为提高图像质量，在ImageJ工具栏中左键点击“Image”。将光标移至第一个选项“Type”，展开多种图像格式的下拉菜单，将光标移至“32-bit”选项，左键点击以完成格式转换。
8. 为使STM图像从左至右按时间顺序可读，可在ImageJ工具栏中依次左键点击以下路径：“图像-变换-向左旋转90度”。也可创建原位Ca的STM图像²⁺ 仅使用 ImageJ 通过线扫描分析活性，无需体积分析，具体步骤如下所述。
   注意： STM 创建完成后，无论使用何种软件生成，其分析方法均相同。若要跳过在 ImageJ 中创建 STM 的替代方法，请直接跳至步骤 3.19。
9. 使用 ImageJ 创建 STM 时，打开构成 ICC-DMP Ca 记录的 TIFF 文件序列²⁺ 活动（在 ImageJ 工具栏中选择“文件-打开”）。ImageJ 将自动以 RGB 或 16 位图像格式打开 TIFF 文件。为提高图像质量，在 ImageJ 工具栏中左键点击“图像”，将光标移至第一个选项“类型”，展开多种图像格式的下拉菜单，将光标移至“32 位”，左键点击以完成格式转换。
10. 应从视频中减去背景噪声（由自发荧光或相机噪声引起）。在 ImageJ 界面中左键单击“矩形选择”功能，并在视频的背景荧光区域上绘制一个感兴趣区域（ROI）（通过左键单击并拖动至所需大小和形状）。
11. 选择感兴趣区域（ROI）后，左键单击 ImageJ 工具栏中的“Analyze”，然后从下拉菜单中左键单击“Histogram”。随后将弹出一个对话框，询问用于计算的像素值范围；ImageJ 已预选了该 ROI 的数值范围，因此直接左键单击“OK”即可。
12. 单击“确定”后，将出现一个新的弹出窗口，其中包含一个直方图，显示感兴趣区域（ROI）内背景像素噪声值的分布情况。记录直方图下方列出的平均值，然后关闭该弹出窗口。
13. 返回32位图像，通过左键单击ImageJ工具栏中的“Edit”，向下滚动至“Selection”，然后从下拉菜单中左键单击“Select All”，以选中整个视野（FOV）。
14. 在 ImageJ 工具栏中左键单击“Process”，滚动至“Math”，然后从下拉菜单中左键单击“Subtract”。
15. 将弹出一个对话框，可在其中输入需从视场（FOV）减去的数值。输入上述步骤3.12中从直方图获得的平均值，然后点击“OK”。此时ImageJ会询问是否要处理TIFF图像栈中的所有帧（而不仅仅是当前视频所处的单帧），点击“Yes”。
16. 单击“是”后，视频将变为黑色。为纠正此问题，请在 ImageJ 工具栏中左键单击“Image”，然后将光标悬停在“Adjust”上。左键单击显示的第一个选项“Brightness/Contrast”（B&C）。此时将弹出一个对话框，可在此调整亮度和对比度的各个方面。单击“Auto”选项一次，即可在视频中看到画质提升的效果。保持此 B&C 弹出窗口打开以供将来使用。
17. 创建线扫描时，首先在 ImageJ 界面中右键单击线条选择工具以显示不同线条的选项；从列表中左键单击选择“分段线条（Segmented Line）”。选定“分段线条”工具后，通过单次左键单击沿单个 ICC-DMP 的中轴绘制线条。每次单次左键单击将固定线条的当前点，随后可自由调整线条至任意所需角度。完成绘制后，双击左键以固定线条位置。
18. 在 ImageJ 工具栏中左键单击“Image”，将光标移至“Stacks”选项，然后左键单击“Reslice”。此时将弹出一个对话框，左键单击选择“Rotate 90 Degrees”选项，这将使线扫描图像从左至右定向，以便在 x 轴上对应时间、y 轴上对应空间进行校准和读取。单击“OK”以生成 STM 图像。
19. STM 的强度将以灰度显示，高强度 Ca²⁺ 信号根据其强度显示为不同程度的白色、乳白色或浅灰色。通常需要改善生成的线扫描图像的对比度。可通过点击 B 上的“Auto”来实现&C 弹出框
20. 线扫描荧光强度在STM上以任意像素值显示。为了准确测量Ca的幅度，²⁺ 来自STM的信号，现在需要对STM的荧光值（F）进行归一化。在ImageJ界面中使用“矩形选择”功能，在STM上荧光最均匀且强度最低的区域绘制一个感兴趣区域（ROI）₀).
21. 重复步骤 3.11–3.12 的操作以获得平均值（F₀) 所选ROI内的强度值，然后通过左键单击ImageJ工具栏中的“编辑-选择-全选”来选择整个STM。
22. 左键单击 ImageJ 工具栏中的“Process”，然后滚动至“Math”；从显示的选项中左键单击“Divide”。在随后弹出的对话框中，输入平均值（F₀）来自步骤 3.21。将整个 STM 除以（F₀）STM 将变为黑色；通过点击 B 上的“Auto”进行校正&C 弹出窗口。线扫描现在已针对幅度进行校准，荧光强度以 F/F 表示₀.
23. STM 当前将在 x 轴上显示 TIFF 图像序列中的帧数，在 y 轴上显示代表细胞长度的像素数。为了从 Ca²⁺ 信号，对扫描隧道显微镜（STM）进行空间和时间校准。在 ImageJ 工具栏中左键点击“图像”，然后左键点击“属性”。此时将弹出一个对话框。在该窗口中输入适当的数值，以完成 STM 的完整校准。
24. 对于“像素宽度”，请输入以秒为单位的单帧图像采集时间。例如，5 FPS 时输入 0.2，50 FPS 时输入 0.02，33 FPS 时输入 0.033，依此类推。对于“像素高度”，请输入每个像素所代表的微米数（取决于成像时使用的物镜和相机）。点击“确定”前，“体素深度”保持为 1。该窗口中无需调整其他参数。
    注意： 单击“确定”后，STM 将完成对振幅、空间和时间的全面校准。STM 上的振幅将以 F/F 表示_0, 横轴的时间以秒为单位，纵轴的空间以微米（μm）为单位图2B钙²⁺ STM上的事件现已可进行测量，校准后的STM还可保存为单个TIFF图像，以供日后分析。
25. ImageJ 拥有多种内置的颜色编码查找表（LUTs），可用于对 STM 进行颜色编码。通过在 ImageJ 工具栏中依次左键点击“图像-查找表”，然后选择所需的 LUT，即可应用内置的查找表。自定义的 LUT 也可通过在 ImageJ 工具栏中依次左键点击“文件-导入-LUT”，然后选择要导入的 LUT 文件，从而导入至 STM。例如，下图所示的 STM 图 2C 应用了英国贝尔法斯特女王大学（Queens University Belfast, UK）定制的LUT“QUBPallete”，以暖色（红色、橙色）编码高强度Ca²⁺ 荧光和冷色调（黑色、蓝色）表示低钙区域²⁺ 荧光
26. 在图像J工具栏中左键单击“Analyze”，滚动至“Tools”，然后从下拉菜单中选择“Calibration Bar”，以插入幅度校准标尺，用以指示不同颜色所代表的幅度范围。可设置校准标尺的尺寸、缩放比例、范围及在STM图像上的位置；根据需要调整这些参数后，点击“OK”。请注意，插入校准标尺后，ImageJ会生成一个包含该标尺的新STM图像，原始未含校准标尺的图像则保持完整且独立存在。
    注意： 如果插入标定标尺时勾选了“覆盖”选项，则不会生成新的STM。
27. 开始分析单个Ca²⁺ 事件，左键单击 ImageJ 界面上的“Straight Line”选择器。通过首先左键单击 STM，在 Ca 的中心绘制一条水平直线²⁺ 与x轴平行的事件（随时间变化）。通过再次左键单击完成该线段（图 2D).
28. 单击 ImageJ 工具栏上的“Analyze”，然后左键单击“Plot Profile”。将出现一个新窗口，显示 Ca 的线剖面图²⁺ 事件（图2E).
    注意： 此框中的“列表”选项将生成所绘图表的 XY 值列表，如有需要，可将其复制到电子表格程序中以生成轨迹。
29. 测量 Ca 的振幅²⁺ 在曲线图谱中表示的事件，于 ImageJ 界面中左键点击“直线”选择工具，随后从曲线图谱的基线垂直画线至 Ca 峰值²⁺ 事件；线条的长度（在 ImageJ 界面中显示）将表示事件的幅度，以 ΔF/F 表示₀ (图2E).
30. 利用获取的振幅值，确定 Ca²⁺ 可通过在事件波形最大振幅50%处画一条横跨事件宽度的直线来测量事件持续时间（即半最大振幅全宽，FDHM）；如有需要，也可测量事件的整个持续时间。图2E).
    注意： 实验人员需要设计特定的标准来界定有效的 Ca 阈值²⁺ 这些记录中的事件。在我们的实验中，Ca²⁺ 如果事件的振幅满足以下条件，则被认定为可用于分析的有效事件：其振幅为 >对照记录区段中最大振幅事件的15%。然而，这些阈值取决于所研究的特定组织和细胞，仅为任意参考指南，需针对每种类型的组织和细胞进行具体优化。
31. 通过沿钙信号上升支或下降支画一条线²⁺ 事件图谱轮廓，可据此计算上升或下降速率。绘制线条后，可将鼠标光标移至线条起始点和终止点。当光标静止于这些位置时，图像左下角的 ImageJ 界面将显示该位置的 x、y 坐标。因此，通过获取线条起点（x₁，₁）和末端（x₂，y₂），上升或下降速率（ΔF/s）可计算为直线的斜率 y₂ - y₁ / x₂ - x₁ (图 2F).
32. 为了计算 Ca 的传播或空间扩散²⁺ 事件，左键单击 ImageJ 界面上的“直线”选择工具。然后，沿 Ca 的长度方向绘制一条垂直的直线²⁺ y轴上的事件。线条的长度（在ImageJ界面中显示）将表示该事件的空间扩散范围，单位为μm（图 2G).
33. 测定传播性Ca²⁺的流速²⁺ 通过沿事件传播前沿画一条线并计算该线的斜率来确定事件速度。此操作可参照步骤3.32中的方法手动完成，即确定该线起点的x、y坐标值（x₁，₁）和末端（x₂, y₂）；当鼠标光标位于STM上时，这些数值将显示在ImageJ界面的左下侧。
34. 在收集完所需的 Ca 参数后²⁺ 事件定量，将这些数值取平均值以获得每个细胞各参数的平均值；或者，将所有原始数值放入分布直方图中以显示其范围图 2H).

4. 使用基于颗粒的分析方法对ICC-MY中的CTC进行定量

1. 在使用Volumetry结合PTCLs分析影片之前，需将影片的空间和时间校准信息插入文件名中。编辑所有待在Volumetry中分析的文件，使其标题包含每帧对应的秒数以及每个像素对应的微米数，两个数值之间用单个短横线连接，并用方括号括起。例如，以33帧每秒（FPS）采集、使用60倍物镜（512 × 512）拍摄的影片，其文件名中应插入[0.22–0.033]。
2. 打开体积测量软件，使用鼠标右键单击以打开包含视频文件的文件夹。左键单击要分析的视频文件，即可在体积测量软件中打开该文件。图3A，必须为未压缩的TIFF格式。
3. 为了准确计算 Ca²⁺ 对整个视野（FOV）的信号进行处理时，首先需对视频进行微分和滤波以去除背景干扰（如相机噪声、自发荧光等），并提高信噪比。在视频窗口中，右键单击以调出菜单，通过右键选择“STK Filter-Differentiate”功能，再次右键输入微分值，按 ENTER 确认，然后左键单击应用该操作（对于以 33 帧/秒采集的视频，建议设置值为 2（∆t = ± 66–70 毫秒），随着图像采集速率的增加，该值也应相应增大）。
   注意： 在此背景下，差分处理将降低在指定帧数内无动态变化的记录区域（像素）的强度。因此，若设定数值为“2”，则会对记录中每一帧的每个像素进行分析，若某一像素在前后各1帧内均无荧光强度的动态变化，则该像素的强度将从记录中扣除。由此可去除无动态变化的背景噪声，提高信噪比。
4. 通过应用高斯滤波器来平滑分化后的视频。在视频窗口中右键单击以调出菜单，使用右键点击选择“STK Filter-Gauss KRNL”，再次右键单击以输入数值（始终使用奇数，对于以 33 FPS 采集的视频，输入值为 5 效果较好，1.5 x 1.5 µm，标准差 1.0），输入数值后按 ENTER 键，然后左键单击以应用图 3B).
5. 首先选择一段包含静止期（20–40帧）、随后发生CTC事件以及CTC发生后20–40帧的影片片段，以开始创建PTCLs。操作时，使用中键（MMB）在黄色条上左右滑动以浏览影片。
6. 选择完成后，在电影窗口中使用右键点击以访问“STK Ops – Ramp DS PTCLinfo”，然后左键点击应用。此功能将运行一个PTCL分析程序，逐步将阈值从最大强度递减至最小强度。该过程将在绘图窗口中以噪声图形式显示，同时在轨迹窗口中显示为三条彩色轨迹：绿色轨迹表示PTCL的数量，红色轨迹表示PTCL的平均大小，蓝色轨迹表示绝对强度阈值。
   注意：每个阈值下 PTCL 的数量和平均大小会自动计算，然后应用半手动阈值，该阈值选取 PTCL 平均大小开始下降时的强度，即 Trace Window 中红色轨迹曲线拐点处的强度图3D, 即由于空间受限的噪声PTCL数量较多，导致PTCL的平均尺寸减小。
7. 在绘图窗口中，按“H”键对PTCL噪声的显示图进行直方图均衡。通过按“[”键循环切换配色方案，直至背景显示为白色，上方叠加彩色轨迹。
8. 按“F”键调出测量工具，然后在图中彩色曲线向右侧偏移的交点处左键点击。这将在下方“轨迹窗口”的滚动条上标记一条垂直线。
9. 在轨迹窗口中，使用中键（MMB）从红色轨迹的拐点向左右滑动，直至步骤4.10中创建的白色垂直标记线处。确保通过右键单击选中蓝色轨迹，然后在轨迹窗口左下角读取显示的“yAVG”值。在轨迹窗口内单击一次中键以取消选中状态。
10. 在视频窗口中，按下“C”键调出颜色选择轮，然后按下“D”键调整阈值。有效的PTCL将在此时以红色显示在视频窗口中。图3C）而达到饱和的区域将显示为白色。通过按住鼠标左键向上滚动，去除白色区域。
11. 使用中键上下滚动，调整色轮中的黄色数值，将该数值设置为步骤4.11中获得的yAVG值。此操作将把所有显示为红色的区域指定为活性Ca²⁺ 在确定的阈值点处保存瞬态PTCL。要将此保存为基于坐标的粒子文件，使用右键单击访问“STK 3D-Save PTCLS 0”，然后左键单击以保存文件。
12. 退出体积测量并重新打开。打开在步骤 4.13 中创建的 PTCL 文件（.gpf 文件）。在此文件类型中，所有激活的 Ca²⁺ 瞬变信号被保存为均匀的蓝色PTCL（图3E由于每个多灶性T细胞淋巴瘤（PTCL）均为具有独立ID、面积和周长坐标、状态标志（见下文）及结果数组的独立实体，因此可简化对PTCL时空特征或PTCL间特征的分析。
13. 开始进行PTCL分析时，通过在电影窗口中使用右键点击以访问“PTCL STKOPS-Flag ptcls”功能，去除残留的PTCL噪声（即生成.gpf文件时产生的微小无效PTCL）。 >最小值=70’，单击左键以应用。此操作将标记大于6 µm的PTCLs² （约直径 > 2µm）且体积测量会将其分配至“FLAG 1”选集。完成后，在电影窗口中，高于此阈值的PTCLs将显示为浅紫色，而低于阈值的PTCLs则保持其原本的蓝色图3F).
14. 通过在“电影窗口”中右键点击以访问“PTCL STKops-StatMap Flag=”，创建PTCL活动的热图表示。右键点击该最终路径后，可输入要分析的标志编号。例如，若要量化分配给FLAG1的PTCL，只需输入“1”，按回车键，然后左键点击以应用设置。系统将生成一幅热图，显示整个记录时长内的总PTCL数量，不同颜色代表记录过程中PTCL出现的频率（%）。图3G，暖色表示该位置出现频率增加。
15. 右键单击热图，选择“STM Load Save - Save STM as .tif”，然后左键单击将其保存为TIFF格式。
16. 通过在电影窗口中右键点击以访问“PTCL Measure-PTCLStats STK =”，然后对该最终路径进行右键点击，可输入待分析的标志分配。因此，若要量化分配给 FLAG1 的 PTCL，只需输入“1”，按回车键，然后左键点击以应用。这将在轨迹窗口中生成一系列轨迹。
17. 体积测量将默认把第4.17步生成的PTCL轨迹相互叠加。在轨迹窗口中使用右键点击选择“对齐-分离轨迹”，再左键点击应用，即可将轨迹分开。这将显示出四条不同的PTCL轨迹，用于量化Ca²⁺ 电影中显示PTCL区域（绿色）、PTCL数量（红色）、PTCL大小（青色）以及PTCL大小标准差（蓝色）随时间变化的PTCL活性图 3H).
18. 这些轨迹可保存为文本文件，以便导入电子表格程序进行进一步分析。要保存轨迹，请按住 SHIFT 键，在轨迹窗口中使用右键单击以访问“杂项-导出 ROI 为文本”，然后单击左键保存文件。随后，这些信息可被收集并以直方图或其他适当的图形形式展示。图3H).
19. 为了观察PTCLs的最初发生情况（即， 为了识别放电位点，这些初始的PTCL被赋予不同的标记。为了更有效地分离出网络内发生的放电位点，仅将那些在前一帧中不与任何颗粒重叠，但在接下来的70毫秒内与颗粒发生重叠的PTCL视为放电位点。
20. 要应用此阈值，请在电影窗口中使用右键点击以访问“PTCL Behaviour-F1 InitSites”>F=3’，然后单击左键以应用。这会将起始的PTCLs标记为“FLAG 3”，且符合此条件的PTCLs现在将在视频中显示为浅绿色。图 4A).
21. 体积测量法还能够量化并绘制出在给定视野（FOV）内PTCL放电位点的数量，以及绘制其在一次CTC期间放电概率的图像。为分析这些参数，按照步骤4.16所述方法创建起始PTCLs的热图（FLAG 3）图4B).
22. 在绘图窗口中左键单击，然后按“C”键调出色轮，按“D”键进行阈值分割。此时，启动PTCLs的热图将变为灰白色。使用鼠标左键向上滚动，去除所有白色区域，并对热图中的PTCLs进行阈值分割，使仅有有效的PTCLs被灰色覆盖（通过上下滚动鼠标中键调整阈值）。
23. 在绘图窗口中的热图上单击右键，选择“STM PTCLs-Find PTCLs 70”，然后单击左键应用。此操作将选中图中所有面积大于70像素的灰色PTCLs。² 大小以分配为单独的颜色编码的起始PTCL或PTCL点火位点（图4C).
24. 右键点击PTCL放电图，选择“STM PTCLs-Create PTCL rois”，然后左键点击应用，即可将每个放电位点的活动随时间变化绘制成图。这将在电影窗口中生成一幅新图像，显示所有独立着色的PTCL放电位点，并在其周围标注出感兴趣区域（ROI）。
25. 在电影窗口中使用右键单击以访问“PTCL Measure-PTCLpixROIBM”>=1’，然后单击左键应用。这将识别视频窗口中包含至少一个PTCL的所有感兴趣区域（ROI），并在轨迹窗口中绘制这些ROI内的所有活动轨迹。默认情况下，这些轨迹将相互叠加显示。若要分离轨迹，请在轨迹窗口中单击右键，选择“Align-Separate Trace”，然后单击左键应用。若要保存轨迹数据，在轨迹窗口中按住SHIFT键并单击右键，选择“Assorted-Dump ROI as Text”，然后单击左键保存文件。
26. 每个放电位点的活动也可绘制成发生图。为此，请在电影窗口中使用右键点击以访问“PTCL Measure-ROI Pianola=10”，然后左键点击应用。这将在绘图窗口中生成所有放电位点随时间变化的图谱。每个放电位点将以不同颜色的独立实体显示，各自位于单独的“通道”中，这些图谱对应于 Ca²⁺ CTCs 期间启动的 PTCLs（图 4D，E) 通过右键单击这些发生图，选择“STM Load Save - Save STM as .tif”，然后左键单击将其保存为 TIFF 格式。
27. 为量化CTC期间每个放电位点的放电概率，使用鼠标右键点击影片窗口，选择“PTCL行为-标记IS=1”，然后使用左键点击以应用。此操作将识别影片中所有高于阈值的PTCL帧，并在影片窗口底部以垂直蓝色线条标记这些帧。
28. 循环肿瘤细胞群（CTCs）表现为在视野范围内多个放电位点异步放电的快速聚集，各CTC周期之间间隔约1秒。这种规律性以及CTC之间长时间无活跃的PTCLs间隙被进一步用于定义CTC以进行分析。
29. 在电影窗口中使用右键单击以访问“PTCL 行为-阻断 IS 间隙”<=’，并在最后一个点上右键单击以输入数值。此命令将步骤 4.28 中识别出的活动 PTCL 帧按活动 PTCL 之间的间隔帧数分组为若干区块。例如，对于 33 FPS 的录像，输入值 10 效果较好。若活动 PTCL 之间的间隔少于 10 帧（330 毫秒），则将其归为一个分析区块（这些区块将在电影窗口底部的垂直蓝线之上以粉红色矩形显示，每个粉红色矩形代表一个 CTC）。
30. 在电影窗口中使用右键点击以访问“PTCL Measure-PTCL Event Prob”功能。这将生成一个可导入电子表格程序的文本文件。该文本文件将提供大量关于从步骤4.16–4.23所定义的起始位点特征及其对CTCs贡献的数据。
    注意： 文本文件将显示起始位点的数量（称为“结构域”）、位点的大小（以像素和 μm 为单位）²，每个起始位点在每次CTC中启动一次或多次的概率（以%表示），在该起始位点发生的PTCL的平均持续时间和大小，CTC周期的数量（按步骤4.23定义），以及在每个CTC周期中被激活的起始位点所占的百分比。这些信息将被收集，并以直方图或其他适当的图形形式展示图4F).

结果

利用 Kit-Cre-GCaMP6F 小鼠（图 1），可在原位成像胃肠道中 ICC 的动态 Ca²⁺ 信号行为。通过共聚焦显微镜，可以获得特定 ICC 群体的高分辨率图像，且不会受到同一组织中其他解剖层面不同的 ICC 群体信号的干扰（图 2A）^37,39,40,41。该方法能够记录短暂（<100 ms）、局部的 Ca²⁺ 事件，而这些事件使用膜通透性 Ca²⁺ 指示剂是无法检测到的。利用 Volumetry 或 ImageJ 软件进行时空映射，可在原位生成细胞内所有 Ca²⁺ 事件的时空图谱（STMs）。采...

讨论

对完整组织内或细胞网络中特定类型细胞的 Ca²⁺ 成像通常会揭示复杂的 Ca²⁺ 瞬变模式。此类活动需要进行细致而深入的分析与量化，以尽可能获取有关这些事件及其动力学特征的更多信息。STM 和 PTCL 分析方法能够最大限度地从此类记录中提取定量数据。

ICC-DMP 细胞呈细长的纺锤形形态，这种形态非常适合采用上述 STM 方法进行分析。然而，这种分析方法并不适用于呈星状且相互连接成网络结构的 ICC-MY 细胞（图 3A）。此外，ICC-MY 中的 Ca²⁺ 信号模式更为复杂，表现为从 ICC-MY 网络中多个起始位点传播的钙瞬变波（CTC）。因此，为了量化在某一视野（FOV）内整个 ICC-MY 网络中的活动情况，我们采用了一套自行开发的软件（Volumetry，版本 G8d，GWH，适用于 Mac OS 系统）进行颗粒（PTCL）分析（如需获取 Volumetry 的使用权限或相关咨询，请联系 Grant Hennig，邮箱：grant.hennig@med...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ImageJ 软件	NIH	1.5a	ImageJ 软件
体积测量	GWH	体积测量 8Gd	定制分析软件
异氟烷	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
他莫昔芬	Sigma	T5648
GCaMP6F 小鼠	杰克逊实验室	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre 小鼠	由 Dieter Saur 博士惠赠	c-Kit+/Cre-ERT2
乙醇	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6