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方法文章

位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

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DOI：

10.3791/58996

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2019年2月5日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

本文内容

摘要

定点突变是一种用于在脱氧核糖核酸（DNA）中引入特定突变的技术。本实验方案介绍了基于两步法和三步法聚合酶链式反应（PCR）的定点突变操作方法，该方法适用于任何感兴趣的DNA片段。

摘要

定点突变是一种用于在DNA中引入特定突变的技术，以研究小非编码核糖核酸（sRNA）分子与靶标信使RNA（mRNA）之间的相互作用。此外，定点突变还可用于绘制蛋白质在RNA上的特异性结合位点。本文描述了基于两步和三步PCR引入突变的方法。该方法适用于所有蛋白质-RNA及RNA-RNA相互作用的研究。简而言之，该技术依赖于设计含有目标突变的引物，通过两步或三步PCR扩增获得带有突变的PCR产物，随后将该产物用于克隆。在此，我们介绍了如何采用两步法和三步法对sRNA分子McaS以及mRNA csgD 进行定点突变，以研究RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用。我们应用此技术研究RNA相互作用，但该技术同样适用于所有类型的突变研究（例如DNA-蛋白质相互作用、氨基酸替换/缺失/插入）。除非天然碱基外，可引入任意类型的突变，但该技术仅适用于能够将PCR产物用于后续实验操作（如克隆或作为进一步PCR的模板）的情况。

引言

DNA 常被称为活细胞的蓝图，因为细胞的所有结构信息都编码在其 DNA 序列中。精确的复制和 DNA 修复机制确保了突变的发生率极低，这对于维持编码基因的正常功能至关重要。DNA 序列的改变可能在多个层次上影响后续功能，从 DNA 水平（转录因子和限制性内切酶的识别）、到 RNA 水平（碱基互补配对和二级结构的改变），以及/或者蛋白质水平（氨基酸替换、缺失、插入或移码）。尽管许多突变对基因功能影响不大，但某些 DNA 中的突变可能带来重大影响。因此，定点突变技术是研究特定 DNA 位点在各个层面重要性的有力工具。

本方案描述了一种用于引入特定突变的靶向诱变方法。该方案依赖于两种不同的PCR策略：两步PCR或三步PCR。若目标突变位于目的DNA的5'端或3'端附近，则可采用两步PCR方法（<200个碱基对（bp）处）时，三步PCR在所有情况下均适用。

在两步PCR方法中，需要设计3种引物，其中一对引物用于扩增目的DNA（分别为正向引物1和反向引物3），另一种引物用于引入突变。引入突变的引物（引物2）若突变位点靠近5'端则应设计为反向，若突变位点靠近3'端则应设计为正向。在第一轮PCR中，引物1+2或2+3分别扩增靠近5'端或3'端的小片段。将所得PCR产物作为第二步中的引物，分别与引物1或引物3组合使用，从而获得在目的DNA中带有突变的PCR产物（图1A）。

在三步PCR中，共设计4条引物，其中一对引物用于扩增目的DNA片段（分别为正向引物1和反向引物4），另一对引物用于引入具有重叠互补性的特定突变（分别为反向引物2和正向引物3）。在第一步和第二步中，引物1+2和引物3+4分别扩增5'端和3'端。在第三步中，以上两步所得的PCR产物作为模板，使用引物1+4进行扩增。因此，最终获得的PCR产物即为携带目标突变的目的DNA片段（图1B）。

尽管突变后的 DNA 可用于任何后续应用，但本实验方案描述了如何将该 DNA 重新组合到克隆载体中。使用克隆载体具有多个优势，例如克隆操作简便，并可根据载体的特定特征实现特定的实验应用。这一特性常用于 RNA 相互作用研究。另一种用于 RNA 相互作用研究的技术是针对 RNA 与其他 RNA1,2 或蛋白质3,4 形成复合物时的结构探针分析。然而，结构探针分析仅能在体外进行，而定点突变及后续的克隆操作则可实现体内相互作用研究。

定点突变已广泛用于RNA相互作用研究，如此处所述。然而，关于两步或三步PCR的关键方法可适用于任何DNA片段，因此不仅限于RNA相互作用研究。

为说明该技术及其可能的应用，对mRNA转录后调控中重要区域的表征， csgD, 的 大肠杆菌 (E. coli）被使用。在 大肠杆菌，csgD 在蛋白Hfq的协助下，小非编码RNA McaS靶向抑制CsgD的蛋白表达2,4,5该技术用于向碱基配对区域引入突变 csgD 以及 McaS 和 Hfq 结合位点 csgD所获得的DNA随后被克隆至适用于后续实验的载体中。该技术的下游应用包括体内和体外实验。作为示例，示例1通过蛋白质印迹法（western blot assay）进行体内表征，示例2则通过电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）进行体外表征。在这两种情况下，均展示了位点定向诱变如何与其他技术结合使用，以对目标基因作出生物学结论。

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方案

1. 载体选择

  1. 选择用于后续实验的载体。任何载体均适用于本两步和三步PCR方法。
  2. 根据所选载体，选择合适的限制性内切酶用于克隆。

2. 位点定向突变的引物设计

  1. 选择使用两步法或三步法 PCR 策略（两步法仅适用于突变位点距离目标 DNA 任一末端 <200 bp 的情况）。若采用两步法 PCR，请转至步骤 2.2；若采用三步法 PCR，请转至步骤 2.3。
  2. 设计两步法 PCR 引物。
    1. 设计引物 1 和引物 3，用于扩增目标 DNA，并在其 5’ 端添加包含 4 个核苷酸（例如 ATAT 或 AGCT）的突出端，后接克隆至所选载体所需的相应限制性酶切位点。
    2. 设计引物 2，用于在目标位点引入突变，并在突变位点两侧各包含 10–15 个互补核苷酸。若突变位于 5’ 端，则设计为反向引物；若突变位于 3’ 端，则设计为正向引物。
  3. 设计三步法 PCR 引物。
    1. 设计引物 1 和引物 4，用于扩增目标 DNA，并在其 5’ 端添加包含 4 个核苷酸（例如 ATAT 或 AGCT）的突出端，后接克隆至所选载体所需的相应限制性酶切位点。
    2. 设计引物 2 和引物 3，用于在目标位点引入突变，并在突变位点两侧各包含 10–15 个互补核苷酸。引物 2 与引物 3 互为反向互补序列。

3. 用于克隆的野生型DNA的PCR扩增

注意：有关 PCR 的详细信息，请参见6。

  1. 使用引物1+2（两步PCR）或1+4（三步PCR），以野生型DNA为模板进行PCR6，以获得PCR产物I。采用表1中的PCR程序。
  2. 通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR结果。
    1. 制备琼脂糖凝胶溶液（2%），即每100 mL 1×三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（EDTA）（TAE）缓冲液中加入2 g琼脂糖。用微波炉加热至琼脂糖完全溶解。向琼脂糖凝胶溶液中加入DNA染色染料溴化乙锭（终浓度约为0.5 µg/mL），以便后续观察。
    2. 倒入琼脂糖凝胶，置于电泳装置中，加入已混合DNA上样染料的PCR样品以及已知大小的DNA分子量标记物。在75 W条件下电泳45分钟，或直至条带充分分离，然后在紫外（UV）透射仪或凝胶成像系统中观察条带。
  3. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化PCR产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化后DNA的浓度。
  4. 将纯化的DNA储存于-20 °C（溶于三羟甲基氨基甲烷-EDTA（TE）缓冲液中，用于长期保存）或4 °C（溶于dH2O中，用于短期保存），待步骤5使用。

4. 通过PCR在DNA中引入定点突变

  1. 两步法 PCR（三步法 PCR 请参见步骤 4.2）
    1. 使用引物 1+2（若突变位于 5’ 端）或引物 2+3（若突变位于 3’ 端）进行 PCR6，以野生型 DNA 为模板，获得 PCR 产物 II（PCR 程序见 表 1）。
    2. 通过琼脂糖凝胶电泳验证 PCR，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。
    3. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。
    4. 将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中），直至步骤 5 使用。
    5. 以 PCR 产物 II 作为引物，与引物 3（若突变位于 5’ 端）或引物 1（若突变位于 3’ 端）组合，以野生型 DNA 为模板进行 PCR6，获得 PCR 产物 III（PCR 程序见 表 1）。
    6. 通过琼脂糖凝胶电泳验证 PCR，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。
    7. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。
    8. 将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中），直至步骤 5 使用。
  2. 三步法 PCR
    1. 分别使用引物 1+2 和引物 3+4 进行 PCR6，以野生型 DNA 为模板，获得 PCR 产物 II 和 III（PCR 程序见 表 1）。
    2. 通过琼脂糖凝胶电泳验证各 PCR 反应，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。
    3. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。
    4. 将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中）。
    5. 使用引物 1+4 进行 PCR6，以 2–5 ng 的 PCR 产物 II 和 III 作为模板（在同一反应中）获得 PCR 产物 IV（PCR 程序见 表 1）。
    6. 通过琼脂糖凝胶电泳验证 PCR，方法同步骤 3.2.1 和 3.2.2。
      注：出现多个非特异性条带是常见现象（有时可通过减少模板量来降低）；然而，只要切取正确大小的条带并进行凝胶回收，非特异性 PCR 产物可被忽略。
    7. 若结果正确，使用凝胶回收试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物，并用分光光度计（材料表）测定纯化 DNA 的浓度。
    8. 将纯化的 DNA 储存于 -20 °C（TE 缓冲液中）或 4 °C（dH2O 中），直至步骤 5 使用。

5. 将野生型和突变型DNA重组至所选载体中

注意：有关后续步骤的详细信息，请参见7。

  1. 使用相应的限制性内切酶消化纯化的PCR产物I和III（来自两步PCR）和/或IV（来自三步PCR）。
    1. 在20 µL的1×消化缓冲液中加入每种限制性内切酶各1 µL，于37 °C条件下消化200 ng PCR产物，反应30–60分钟。
  2. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）通过凝胶回收法纯化已消化的PCR产物，使用分光光度计（材料表）测定纯化后DNA的浓度，并将DNA储存于-20 °C（TE缓冲液中）或4 °C（dH2O中），直至用于步骤5.6。
  3. 使用相应的限制性内切酶消化纯化的载体，并用碱性磷酸酶处理以减少载体自连事件。切勿对PCR产物进行碱性磷酸酶处理。
    1. 在30 µL的1×消化缓冲液中加入每种限制性内切酶各1 µL以及1 µL碱性磷酸酶，于37 °C条件下消化1,000 ng载体，反应30–60分钟。
  4. 采用琼脂糖凝胶电泳方法（如步骤3.2.1和3.2.2所述）将已消化的载体与废弃DNA（例如未切割的载体和切除的DNA片段）分离。
  5. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）通过凝胶回收法纯化已消化的载体，使用分光光度计（材料表）测定纯化后DNA的浓度，并将DNA储存于-20 °C（TE缓冲液中）或4 °C（dH2O中），直至用于步骤5.6。
  6. 按照表2中指定的反应条件，将已消化的PCR产物连接至已消化的载体中。
  7. 在室温下孵育2小时，或在16 °C下过夜孵育。
  8. 将连接反应产物转化至感受态菌株（例如E. coli K12）中。
    1. 将菌株培养至OD600=0.3–0.5，然后将1 mL培养物转移至与连接反应数量相同的1.5 mL离心管中。
    2. 在3,500 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
    3. 用200 μL转化缓冲液（含0.1 g/mL聚乙二醇3350、5%二甲基亚砜和20 mM MgCl2的10 mL LB培养基）重悬细胞。
    4. 加入连接反应产物，将离心管置于冰上30分钟。
    5. 在42 °C下热激2分钟。
    6. 向1.5 mL离心管中加入1 mL LB培养基，在37 °C下孵育至少45分钟，以实现抗生素抗性表型的表达。
    7. 在3,500 × g条件下离心5分钟，弃去1 mL上清液，用剩余的上清液重悬细胞。
    8. 将细胞涂布于含有适当抗生素的平板上，并在37 °C下过夜培养。
  9. 鉴定含有成功插入DNA片段载体的转化子（例如，使用载体特异性和插入片段特异性引物进行PCR验证）。
  10. 通过Sanger测序验证DNA序列。
    注意：用于测序的引物不得与步骤5.9中所用引物相同。

6. 使用构建的载体进行体外和/或体内实验

  1. 体内实验
    注意：这是使用载体表达野生型/突变型 RNA 以表征转录后调控的一个示例。有关蛋白质印迹的更多细节，请参见8.
    1. 培养 E. coli 在适当培养基中培养含有构建载体的K12菌株，必要时诱导表达。通过离心收集样品。
    2. 将细胞沉淀溶于1× SDS上样缓冲液（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8，2.5% SDS，0.002%溴酚蓝，5% β-巯基乙醇，10%甘油）中，于95 °C煮沸5分钟，以制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样品。
      注意：可以自行灌制凝胶，也可使用 commercially available precast gel（商用预制凝胶）。本文所呈现的结果中采用的是后者。 图3 (材料表).
    3. 加入107 将各样本的细胞分别加入不同的孔中（包括蛋白ladder），在200 V电压下电泳，直至蛋白完全分离（约45分钟）。
    4. 将蛋白质通过半干式转膜法在80 mA电流下转印1小时至纤维素膜上。
    5. 用蛋白质混合物（例如，5%脱脂奶粉溶于1x Tween 20-Tris缓冲盐溶液（TTBS）缓冲液）封闭膜。
    6. 加入针对目标蛋白（如GFP、FLAG或HIS标签蛋白）的一抗（溶于1x TTBS缓冲液中），室温下轻柔振荡孵育1小时。
    7. 用1x TTBS洗涤膜10分钟，以去除未结合的抗体。重复此步骤两次。
    8. 加入针对一抗的二抗（溶于1× TTBS缓冲液中），以实现检测（例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗），室温轻柔振荡孵育1小时。
    9. 用1×TTBS洗涤膜10分钟，以去除未结合的抗体。重复此步骤两次。
    10. 使用与二抗兼容的技术对膜进行显影（例如，若使用了HRP标记的二抗，则在与鲁米诺衍生产物孵育后进行成像）。
  2. 体外实验
    注意：本示例展示了如何利用该载体作为体外转录RNA的模板，以表征RNA-蛋白质相互作用。有关EMSA的更多细节，请参见9.
    1. 使用T7体外转录试剂盒制备体外转录本（材料表）以及第5步中的载体作为模板。
    2. 使用4.5%含7 M尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA转录本，并通过透析袋电洗脱法直接从凝胶中提取RNA材料表).
    3. 标记RNA（例如，使用γ-32使用T4多聚核苷酸激酶进行P-ATP标记材料表）并用柱子再次纯化（材料表).
      警告：在使用放射性物质前，须咨询当地辐射安全官员。
    4. 在1x结合缓冲液（20 mM Tris，pH 8，100 mM KCl，1 mM MgCl₂）中，分别进行不同反应，将标记的RNA与浓度递增的蛋白质混合。2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。
      注意：在展示的结果中（图4)，将2 nM的放射性标记csgD mRNA与0至2 µM的Hfq蛋白（单体浓度）梯度混合。
    5. 让蛋白质和RNA杂交后，将杂交混合物上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，于200 V电压下电泳1.5小时。
    6. 使用与步骤6.1.3中标记方法相兼容的技术对凝胶进行成像（例如，若使用了放射性标记，可通过磷屏成像检测）。
    7. 使用图像处理程序量化迁移条带的相对强度，并利用图形与数据分析软件对数据进行曲线拟合（S型曲线）。材料表）。根据拟合曲线计算解离常数（Kd) 值可通过软件自动确定。

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结果

研究RNA相互作用以探讨转录后调控 csgD 双载体系统被选用：一个用于表达 csgD mRNA 和另一种用于表达小非编码 RNA McaS 的分子。 csgD 被克隆到pBAD33中，这是一种具有氯霉素抗性的阿拉伯糖诱导型中拷贝质粒，而McaS被克隆到mini R1 pNDM220中，这是一种具有氨苄青霉素抗性的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导型低拷贝质粒。野生型 csgD 使用引物1A和4A（4A包含一个FLAG序列）对目标片段进行PCR扩增，得到PCR产物IA；同时使用引物1B和4B对野生型McaS进行PCR扩增，得到PCR产物IB。采用三步PCR策略在预测的碱基配对区域引入替换突变。 csgD 和 McaS. 在前两步中，分别使用引物1A+2A和3A+4A扩增得到PCR产物IIA和IIIA。在第三步中，以PCR产物IIA和IIIA为模板，使用引物1A和4A扩增得到PCR产物IVA。图 2A

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讨论

定点突变技术具有广泛的应用，本文包含了体内和体外实验的代表性结果，用以举例说明如何利用该技术得出生物学结论。长期以来，定点突变一直是RNA相互作用研究的金标准。该技术的优势在于将引入相关突变与后续检测和实验（如Western印迹或EMSA）相结合，从而推断特定DNA位点及其在相应基因产物功能中的重要性。在决定进行定点突变时，应仔细设计引物，以最大限度地发挥该技术的效能（例如，确定需要突变的位点）；务必包含正确的末端延伸序列和限制性酶切位点，并注意引物/模板的特性。

本方案中描述的实际诱变依赖于PCR。因此，该步骤最关键的环节是PCR的反应条件。优化PCR的方法有多种，包括Mg2+浓度梯度、DMSO浓度以及退火步骤的温度梯度。更多细节请参见文献3。除了优化PCR反应本身外，在进行定点诱变时还需特别注意两点：高质量的模板和精心设计的引物。

高质量的PCR模板往往是PCR成功与失败的关键。尽管可以使用细胞裂解液作为DNA模板来源，但优先选择纯化的DNA（基因组DNA、载体DNA或PCR产物...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢南丹麦大学开放获取政策基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
兔源抗GroEL抗体默克G6532一抗
Azure c200AzureNA凝胶成像工作站
定制DNA寡核苷酸默克VC00021
DeNovix DS-11DeNovixNA用于核酸测量的分光光度计
DNA上样缓冲液（6X）赛默飞世尔科技R0611
1% 溴化乙锭溶液卡尔·罗斯2218.1
GeneJET 胶回收试剂盒赛默飞世尔科技K0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12用于电洗脱的透析管
MEGAscript T7 转录试剂盒InvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT 电泳槽伯乐（Bio-Rad）1704406水平电泳系统
小鼠源单克隆 ANTI-FLAG M2 抗体默克F3165一抗
小鼠免疫球蛋白Dako CytomationP0447HRP 标记的二抗
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971RNA纯化
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶赛默飞世尔科技NP0323BOX用于蛋白质分离的 Bis-Tris 凝胶
Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）新英格兰生物实验室M0531SDNA聚合酶
PowerPac HC 高电流电源供应器Bio-Rad1645052
兔免疫球蛋白Dako CytomationP0448HRP 标记的二抗
SeaKem LE 琼脂糖Lonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNA图形与数据分析软件工具
T100热循环仪伯乐（Bio-Rad）1861096PCR仪
T4 DNA连接酶New England BiolabsM0202连接酶
T4 多核苷酸激酶New England BiolabsM0201S
TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA）（50X）赛默飞世尔科技B49

参考文献

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
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  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
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  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
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