位点定向诱变在体外和体内实验中的应用——以大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA相互作用为例

摘要

定点突变是一种用于在脱氧核糖核酸（DNA）中引入特定突变的技术。本实验方案介绍了基于两步法和三步法聚合酶链式反应（PCR）的定点突变操作方法，该方法适用于任何感兴趣的DNA片段。

摘要

定点突变是一种用于在DNA中引入特定突变的技术，以研究小非编码核糖核酸（sRNA）分子与靶标信使RNA（mRNA）之间的相互作用。此外，定点突变还可用于绘制蛋白质在RNA上的特异性结合位点。本文描述了基于两步和三步PCR引入突变的方法。该方法适用于所有蛋白质-RNA及RNA-RNA相互作用的研究。简而言之，该技术依赖于设计含有目标突变的引物，通过两步或三步PCR扩增获得带有突变的PCR产物，随后将该产物用于克隆。在此，我们介绍了如何采用两步法和三步法对sRNA分子McaS以及mRNA csgD 进行定点突变，以研究RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用。我们应用此技术研究RNA相互作用，但该技术同样适用于所有类型的突变研究（例如DNA-蛋白质相互作用、氨基酸替换/缺失/插入）。除非天然碱基外，可引入任意类型的突变，但该技术仅适用于能够将PCR产物用于后续实验操作（如克隆或作为进一步PCR的模板）的情况。

引言

DNA 常被称为活细胞的蓝图，因为细胞的所有结构信息都编码在其 DNA 序列中。精确的复制和 DNA 修复机制确保了突变的发生率极低，这对于维持编码基因的正常功能至关重要。DNA 序列的改变可能在多个层次上影响后续功能，从 DNA 水平（转录因子和限制性内切酶的识别）、到 RNA 水平（碱基互补配对和二级结构的改变），以及/或者蛋白质水平（氨基酸替换、缺失、插入或移码）。尽管许多突变对基因功能影响不大，但某些 DNA 中的突变可能带来重大影响。因此，定点突变技术是研究特定 DNA 位点在各个层面重要性的有力工具。

本方案描述了一种用于引入特定突变的靶向诱变方法。该方案依赖于两种不同的PCR策略：两步PCR或三步PCR。若目标突变位于目的DNA的5'端或3'端附近，则可采用两步PCR方法（<200个碱基对（bp）处）时，三步PCR在所有情况下均适用。

在两步PCR方法中，需要设计3种引物，其中一对引物用于扩增目的DNA（分别为正向引物1和反向引物3），另一种引物用于引入突变。引入突变的引物（引物2）若突变位点靠近5'端则应设计为反向，若突变位点靠近3'端则应设计为正向。在第一轮PCR中，引物1+2或2+3分别扩增靠近5'端或3'端的小片段。将所得PCR产物作为第二步中的引物，分别与引物1或引物3组合使用，从而获得在目的DNA中带有突变的PCR产物（图1A）....

方案

1. 载体选择

1. 选择用于后续实验的载体。任何载体均适用于本两步和三步PCR方法。
2. 根据所选载体，选择合适的限制性内切酶用于克隆。

2. 位点定向突变的引物设计

1. 选择使用两步法或三步法 PCR 策略（两步法仅适用于突变位点距离目标 DNA 任一末端 <200 bp 的情况）。若采用两步法 PCR，请转至步骤 2.2；若采用三步法 PCR，请转至步骤 2.3。
2. 设计两步法 PCR 引物。
   1. 设计引物 1 和引物 3，用于扩增目标 DNA，并在其 5’ 端添加包含 4 个核苷酸（例如 ATAT 或 AGCT）的突出端，后接克隆至所选载体所需的相应限制性酶切位点。
   2. 设计引物 2，用于在目标位点引入突变，并在突变位点两侧各包含 10–15 个互补核苷酸。若突变位于 5’ 端，则设计为反向引物；若突变位于 3’ 端，则设计为正向引物。
3. 设计三步法 PCR 引物。
   1. 设计引物 1 和引物 4，用于扩增目标 DNA，并在其 5’ 端添加包含 4 个核苷酸（例如 ATAT 或 AGCT）的突出端，后接克隆至所选载体所需的相应限制性酶切位点。
   2. 设计引物 2 和引物 3，用于在目标位点引入突变，并在突变位点两侧各包含 10–15 个互补核苷酸。引物 2 与....

结果

研究RNA相互作用以探讨转录后调控 csgD 双载体系统被选用：一个用于表达 csgD mRNA 和另一种用于表达小非编码 RNA McaS 的分子。 csgD 被克隆到pBAD33中，这是一种具有氯霉素抗性的阿拉伯糖诱导型中拷贝质粒，而McaS被克隆到mini R1 pNDM220中，这是一种具有氨苄青霉素抗性的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导型低拷贝质粒。野生型 csgD 使用引物1A和4A（4A包含一个FLAG序列）对目标片段进行PCR扩增，得到PCR产物IA；同时使用引物1B和4B对野生型McaS进行PCR扩增，得到PCR产物IB。采用三步PCR策略在预测的碱基配对区域引入替换突变。 csgD 和 McaS. 在前两步中，分别使用引物1A+2A和3A+4A扩增得到PCR产物IIA和IIIA。在第三步中，以PCR产物IIA和IIIA为模板，使用引物1A和4A扩增得到PCR产物IVA。图 2A

讨论

定点突变技术具有广泛的应用，本文包含了体内和体外实验的代表性结果，用以举例说明如何利用该技术得出生物学结论。长期以来，定点突变一直是RNA相互作用研究的金标准。该技术的优势在于将引入相关突变与后续检测和实验（如Western印迹或EMSA）相结合，从而推断特定DNA位点及其在相应基因产物功能中的重要性。在决定进行定点突变时，应仔细设计引物，以最大限度地发挥该技术的效能（例如，确定需要突变的位点）；务必包含正确的末端延伸序列和限制性酶切位点，并注意引物/模板的特性。

本方案中描述的实际诱变依赖于PCR。因此，该步骤最关键的环节是PCR的反应条件。优化PCR的方法有多种，包括Mg²⁺浓度梯度、DMSO浓度以及退火步骤的温度梯度。更多细节请参见文献³。除了优化PCR反应本身外，在进行定点诱变时还需特别注意两点：高质量的模板和精心设计的引物。

高质量的PCR模板往往是PCR成功与失败的关键。尽管可以使用细胞裂解液作为DNA模板来源，但优先选择纯化的DNA（基因组DNA、载体DNA或PCR产物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
兔源抗GroEL抗体	默克	G6532	一抗
Azure c200	Azure	NA	凝胶成像工作站
定制DNA寡核苷酸	默克	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	用于核酸测量的分光光度计
DNA上样缓冲液（6X）	赛默飞世尔科技	R0611
1% 溴化乙锭溶液	卡尔·罗斯	2218.1
GeneJET 胶回收试剂盒	赛默飞世尔科技	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	用于电洗脱的透析管
MEGAscript T7 转录试剂盒	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT 电泳槽	伯乐（Bio-Rad）	1704406	水平电泳系统
小鼠源单克隆 ANTI-FLAG M2 抗体	默克	F3165	一抗
小鼠免疫球蛋白	Dako Cytomation	P0447	HRP 标记的二抗
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	RNA纯化
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶	赛默飞世尔科技	NP0323BOX	用于蛋白质分离的 Bis-Tris 凝胶
Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）	新英格兰生物实验室	M0531S	DNA聚合酶
PowerPac HC 高电流电源供应器	Bio-Rad	1645052
兔免疫球蛋白	Dako Cytomation	P0448	HRP 标记的二抗
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	图形与数据分析软件工具
T100热循环仪	伯乐（Bio-Rad）	1861096	PCR仪
T4 DNA连接酶	New England Biolabs	M0202	连接酶
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201S
TAE 缓冲液（Tris-乙酸-EDTA）（50X）	赛默飞世尔科技	B49