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方法文章

一种用于分析单个纳米颗粒的封闭式无线纳米孔电极

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DOI：

10.3791/59003

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2019年3月20日

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory for Advanced Materials, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China University of Science and Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种封闭式无线纳米孔电极的制备方案，以及随后对单个纳米颗粒碰撞进行的电化学测量。

摘要

通过纳米电化学测量单个纳米颗粒的本征特性具有重要的基础研究意义，并在纳米科学领域具有潜在影响。然而，对单个纳米颗粒进行电化学分析具有挑战性，因为传感纳米界面难以控制。为应对这一挑战，本文描述了一种闭合式无线纳米孔电极（WNE）的制备与表征方法，该电极具有高度可控的形貌和优异的重现性。WNE的制备过程简便，可在普通化学实验室中实现结构明确的纳米电极的制备，无需使用洁净室和昂贵设备。文中还重点介绍了一种30 nm闭合式WNE在混合物中分析单个金纳米颗粒的应用，其电流分辨率达0.6 pA，时间分辨率达0.01 ms。凭借其优异的形貌特征和小尺寸直径，闭合式WNE的应用前景可进一步拓展，从纳米颗粒表征延伸至单分子/离子检测及单细胞探测。

引言

由于具有催化能力、特殊的光学特性、电化学活性以及高比表面积等多样化的特性，纳米颗粒已受到广泛关注1,2,3,4。对单个纳米颗粒进行电化学分析是理解纳米尺度下内在化学和电化学过程的直接方法。为了实现对单个纳米颗粒的高灵敏度测量，已有两种电化学方法被用于从电流响应中读取纳米颗粒的信息5,6,7。其中一种方法是将单个纳米颗粒固定或捕获在纳米电极界面，用于研究电催化过程8,9。另一种策略则是基于单个纳米颗粒与电极表面的碰撞，通过动态的氧化还原过程产生瞬态电流波动。

这两种方法均需要一种纳米级超灵敏传感界面，其尺寸需与单个纳米颗粒的直径相匹配。然而，传统的纳米电极制备主要采用微机电系统（MEMS）或激光拉制技术，这些方法繁琐且难以精确控制10,11,12,13。例如，基于MEMS的纳米电极制备成本高昂，且需要使用洁净室，限制了纳米电极的大规模生产和推广应用。另一方面，激光拉制法制备纳米电极在很大程度上依赖操作人员在毛细管内对金属丝进行封接和拉伸的经验。如果金属丝在毛细管中未实现良好密封，则纳米移液管内壁与金属丝之间的间隙会显著引入额外的背景电流噪声，并增大电化学活性传感面积。这些缺陷会大幅降低纳米电极的灵敏度。此外，间隙的存在还会增大电极面积，从而降低纳米电极的灵敏度。因此，由于每次制备过程中电极形貌无法控制，难以保证性能的可重复性14,15。因此，迫切需要一种具有良好可重复性的通用纳米电极制备方法，以推动对单个纳米颗粒本征特性的电化学研究。

近年来，纳米孔技术作为一种优雅且无需标记的单分子分析方法得到了发展16,17,18,19,20由于其可调控的制备方式，纳米移液管可提供纳米尺度的限域空间，通过激光毛细管拉制仪可获得直径在30–200 nm范围内均匀的纳米孔21,22,23,24此外，这种简单且可重复的制备方法确保了纳米移液管的普适性。近期，我们提出了一种无线纳米孔电极（WNE），该电极无需在纳米移液管内部密封金属导线。通过一种简便且可重复的制备工艺，WNE在纳米移液管内实现了纳米尺度的金属沉积，从而形成电活性界面。25,26,27,28由于纳米线电极（WNE）具有结构明确且限域形态均一的特点，因而能够实现高电流分辨率以及低电阻-电容（RC）时间常数，适用于高时间分辨率的测量。我们此前已报道了两种类型的WNE，即开放型和封闭型，可用于实现单实体分析。开放型WNE采用在纳米移液管内壁沉积的纳米金属层，将单个实体的法拉第电流转换为离子电流响应。26通常，开放式WNE的直径约为100 nm。为进一步缩小WNE的直径，我们提出了闭合式WNE，其中通过化学-电化学方法使实心金属纳米尖端完全占据纳米移液管的尖端。该方法可在纳米孔限域内快速生成直径为30 nm的金纳米尖端。闭合式WNE尖端区域清晰明确的界面，可确保在单个纳米颗粒电化学测量中获得高信噪比。当带电金纳米颗粒与闭合式WNE发生碰撞时，尖端界面处的超快充-放电过程会在离子电流轨迹中引发电容反馈响应（CFR）。与此前的单纳米颗粒碰撞研究相比 通过 内部含有金属丝的纳米电极29封闭式WNE表现出更高的电流分辨率，为0.6 pA ± 0.1 pA（RMS），以及更高的时间分辨率，达0.01 ms。

本文介绍了一种具有高度可控尺寸和优异重现性的封闭式钨纳米电极（WNE）的详细制备方法。在本方案中，通过 AuCl4- 与 BH4- 之间的简单反应，生成完全堵塞纳米移液管孔口的金纳米尖端。随后采用双极电化学方法，在纳米移液管内部连续生长长度达数微米的金纳米尖端。该简单流程使得此类纳米电极的制备可在任何普通化学实验室中完成，无需洁净室和昂贵设备。为确定封闭式 WNE 的尺寸、形貌及内部结构，本方案提供了利用扫描电子显微镜（SEM）和荧光光谱法进行详细表征的步骤。文中重点介绍了一个最新应用实例，即直接测量金纳米颗粒（AuNPs）碰撞封闭式 WNE 纳米界面时的本征动态相互作用。我们相信，封闭式 WNE 可为未来在单实体水平上研究活细胞、纳米材料和传感器开辟新的途径。

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方案

1. 溶液的配制

注意：请遵守所有化学品的常规安全预防措施。在通风橱中处理化学品，并佩戴手套、护目镜和实验服。易燃液体应远离火源或火花。所有水溶液均使用超纯水（25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm）配制。配制的溶液使用孔径为 0.22 μm 的滤膜进行过滤。

  1. 氯化钾溶液的制备
    1. 将0.074 g氯化钾溶解于100 mL去离子水中。
  2. NaBH4溶液的制备
    1. 将0.018 g硼氢化钠溶解于10 mL乙醇中。
  3. HAuCl4 溶液的制备
    1. 将0.010 g氯化钾溶解于1 mL质量分数为1%的氯金酸溶液中。
  4. 硅橡胶的制备
    1. 按体积比1:1混合含有A组分和B组分的硅橡胶（见材料表）。
    2. 在1分钟的操作时间内，立即用混合后的硅橡胶在载玻片上涂布反应区域。
    3. 将载玻片上制备好的硅橡胶固化5分钟。
  5. 金纳米颗粒的制备30
    1. 在剧烈搅拌下，将4.8 mL质量分数为1%的氯金酸加入40 mL去离子水中。
    2. 将溶液加热至沸腾。
    3. 迅速向溶液中加入10 mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液。
    4. 继续加热溶液15分钟，直至最终溶液呈红色。
      注意：在本实验中，氯金酸溶液被柠檬酸三钠迅速还原，观察到溶液颜色迅速由无色-黄色变为深黑色。

2. 实验装置的准备

  1. 电流测量系统的准备
    1. 开启包含电流放大器（参见材料表）和低噪声数据采集系统（参见材料表）的电流测量系统
    2. 启动电压钳模式
    3. 将滤波带宽设置为 10 kHz，采样率设置为 100 kHz
    4. 组装自行设计的特制铜制屏蔽笼，用于在倒置显微镜（参见材料表）上屏蔽实验细胞和前置放大器的外部噪声
    5. 将法拉第笼外壳、放大器外壳以及倒置显微镜系统接地
  2. 暗场检测系统的搭建
    1. 通过暗场显微镜监测纳米移液管内金纳米尖端的生成过程。
      注：使用倒置显微镜系统（参见材料表）采集图像和散射光谱。采用真彩色数字CCD相机拍摄纳米移液管和纳米孔电极的图像。使用暗场聚光镜［数值孔径（NA）= 0.8–0.95］实现暗场照明。采用10X（NA = 0.3）、20X（NA = 0.45）和40X（NA = 0.6）物镜采集闭合式WNE的图像。利用荧光检测进一步验证纳米尖端与纳米移液管内壁之间是否存在间隙。该实验通过另一台EMCCD（参见材料表）完成，该设备也集成在倒置显微镜上，激发光源为内置汞灯，配备450–490 nm带通滤光片。

3. 封闭式 WNE 的制备

  1. 纳米移液管的制备
    1. 将石英毛细管（参见 材料表在15 mL离心管中加入丙酮，超声清洗10分钟。
    2. 倒出 丙酮，然后将乙醇加入同一离心管中。
    3. 将离心管放入超声波清洗器中清洗10分钟。
    4. 将毛细管放入另一含有去离子水的15 mL离心管中，以去除乙醇，并进行10分钟超声清洗。
    5. 用去离子水对毛细管进行超声清洗，重复三次，以去除残留的乙醇。
    6. 使用氮气流干燥毛细管。
    7. 将毛细管置于新的、洁净的离心管中。
    8. 打开 CO2 激光拉制仪（参见 材料表)
    9. 预热拉制仪15-20分钟，以确保激光功率稳定。
    10. 将清洗后的毛细管安装到拉制仪上。
    11. 在 CO 控制面板上设置加热、细丝、速度、延迟和拉力等拉制参数。2 用于特定直径的激光拉制仪。本方案中拉制直径为30 nm纳米移液管的具体参数如所示 表1 (图1).
    12. 将制备好的纳米移液管用可重复使用的粘合剂固定在培养皿上（参见 材料表）以进行进一步表征。
  2. 制备 封闭式WNE
    1. 注射10 μL制备好的HAuCl₄溶液4 使用微载样器将溶液装入纳米移液管中。
    2. 将纳米移液管在约 1878 x 条件下离心 5 分钟 g 用于去除纳米移液管中的气泡。
      注意：此步骤中，我们将纳米移液管尖端朝下放入一个自制支架内，并置于2 mL离心管中。
    3. 将纳米移液管用预先准备好的硅橡胶固定在盖玻片上（见步骤 1.4），并将纳米移液管内部区域定义为“顺式” 侧面和外侧作为 “转”侧
    4. 等待5分钟，直至橡胶固化。
    5. 将整合后的装置置于倒置显微镜的载物台上。
    6. 打开暗场照明，并调节至在10倍物镜下聚焦纳米移液管尖端。
    7. 切换至20倍和40倍物镜以获得更高的空间分辨率。
    8. 将一个Ag/AgCl电极放入纳米移液管内。
    9. 将另一个接地的 Ag/AgCl 电极放入 转 侧
    10. 将一对Ag/AgCl电极连接至前置放大器。
    11. 打开电流测量系统及相应软件（参见 材料清单用于记录离子电流。
    12. 将施加的电位设为 300 mV。
    13. 缓慢加入 150 μL NaBH4 溶液注入到 转 侧边以触发 HAuCl 之间的反应4 和 NaBH4 (图2).
      注意：NaBH₄的还原4 在水溶液中以剧烈的反应速率进行。因此，H₂的生成2 来自 NaBH 的还原反应4 可能在金纳米尖生长过程中因产生空腔而导致纳米尖结构缺陷。
    14. 同时使用电流测量系统和暗场检测系统记录电流轨迹以及暗场图像/散射光谱图3).
      注意：乙醇溶液在暗场照明下易挥发。制备过程中需注意乙醇的体积。
    15. 在离子电流回降至 0 pA 后，关闭施加的电位。
    16. 用去离子水从底部到尖端冲洗已制备的封闭型WNE。
  3. 表征 封闭式WNE
    1. 使用扫描电子显微镜（SEM）对封闭式WNE进行表征，这是纳米移液管表征的通用方法。22,31,32,33,34.
    2. 使用钙离子荧光实验验证金纳米尖端在纳米移液管内的密封状况。
      1. 注射10 μL的CaCl2 溶液注入到 顺式 封闭式WNE的一侧和Fluo-8溶液注入 转 侧
      2. 将Ag/AgCl电极连接到前置放大器。
    3. 施加 400 mV 的偏置电位，并使用 EMCCD（参见 材料表) 以监测尖端区域的荧光响应。利用聚焦离子束（FIB）从尖端到底部加工出封闭型钨纳米电极（WNE），然后通过扫描电子显微镜（SEM）表征确定内部金属层或纳米尖端的长度。
  4. 单个纳米粒子与闭合型WNE的碰撞
    1. 更换溶液 转 和 顺式 封闭型WNE制备完成后，将两侧连接至KCl溶液。
    2. 将50 μL的30 nm金纳米颗粒溶液转移至 转 侧。在300 mV电位下记录单个纳米粒子碰撞事件的电流信号。图5).
    3. 调节施加的电压，以监测电流信号的频率、幅度和波形变化。

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结果

我们展示了一种简便的方法，用于制备基于石英锥形纳米移液管的明确定义的30 nm无线纳米孔电极。纳米移液管的制备过程如图1所示，包括三个主要步骤。将内径为0.5 mm、外径为1.0 mm的微毛细管固定在拉制仪中，然后将激光聚焦于毛细管中心以熔化石英。通过对毛细管两端施加拉力，最终将其分离成两部分，每部分均具有纳米级锥形尖端。我们实验室制备30 nm纳米移液管所用的拉制参数见Table 1。需要注意的是，不同激光拉制仪的参数可能有所差异。实验人员应根据激光功率、温度和湿度调整参数。制备完成后，需进行扫描电镜（SEM）表征，以确认纳米移液管的实际直径。

图2 展示了在拉制过程后于纳米移液管尖端内生成金纳米尖的步骤。首先，将 AuCl4- 纳米移液管内的 BH 持续...

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讨论

制备结构明确的纳米移液管是封闭式WNE制备过程的第一步。通过将CO2激光聚焦在毛细管中心，一根毛细管可分离成两根具有纳米级锥形尖端的对称纳米移液管。通过调节激光拉制仪的参数，可轻松控制其直径，范围为30–200 nm。需要注意的是，不同拉制仪的拉制参数可能有所不同。环境温度和湿度也会影响纳米移液管的最终直径。

纳米移液管制备完成后，通过化学反应在纳米移液管内部生成固态纳米尖端。在本方案中，通过还原HAuCl生成金纳米尖端。4；通过设计相应的反应，也可制备其他金属纳米尖端。在纳米移液管尖端完全堵塞后，所生成的金纳米尖端通过双极电化学机制发生电化学极化，从而促进其进一步生长。 原位 随后构建电光表征系统，以在金纳米尖端生长过程中同步记录电流信号和光学信息。

在表征过程中，钙离子荧光检测有助于验证移液管内壁与金纳米尖端之间是否形成间隙。对于结构良好的封闭型WNE，其尖端区域在荧光图像中应始终呈暗态。此外，扫描电子显微镜（SEM）可用于对纳米移液管和封闭型WNE进行表征。可...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究受到国家自然科学基金（61871183，21834001）、上海市教育委员会创新计划（2017-01-07-00-02-E00023）以及上海市教育委员会与上海教育发展基金会“晨光计划”项目（17CG27）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Sigma-Aldrich650501高度易燃且易挥发
分析天平Mettler ToledoME104E
Axopatch 200B 放大器Molecular Devices
蓝丁胶可重复使用粘合剂Bostik
离心管康宁公司带CentriStar盖的离心管，15 ml
氯金酸能源化学E0601760010HAuCl4
Clampfit 10.4 软件Molecular Devices
Digidata 1550A 数字转换器Molecular Devices
DS Fi1c 真彩CCD相机尼康
Ecoflex 5 加成型固化硅橡胶Smooth-On17050377
Eppendorf Reference 2 移液器Eppendorf49200090410、100 和 1000 µL
乙醇Sigma-Aldrich24102高度易燃且易挥发
法拉第笼铜
iXon 888 EMCCD安道尔
微量离心管Axygen Scientific0.6、1.5 和 2.0 mL
微载样器Eppendorf5242 956.00320 µL
显微镜盖玻片Fisher ScientificLOT 1693820 mm × 60 mm - 1 mm 厚
Milli-Q 水纯化系统MilliporeSIMS00000丹顿电子束蒸发仪
P-2000 激光拉制仪Sutter Instrument
移液器吸头Axygen Scientific10、200 和 1,000 µL
氯化钾，+D25+A2:F2+A2:F25Sigma AldrichP9333-500GKCl
石英移液管SutterQF100-50-7.5外径：1.0 mm，内径：0.5 mm，长度：75 mm
冰箱西门子
硅油稀释剂Smooth-On1506330
银丝Alfa Aesar11466
硼氢化钠，天联化工科技71320NaBH4
Ti-U倒置暗场显微镜尼康

参考文献

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