基于细胞法检测人血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G

摘要

基于细胞的检测方法是一种广泛用于检测血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G的常用技术。该方法可应用于视神经脊髓炎谱系障碍的临床诊断和科学研究。

摘要

抗水通道蛋白-4（AQP4）免疫球蛋白G（IgG）是视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的核心诊断生物标志物。细胞为基础的检测法（CBA）是一种广泛用于检测人血清中抗AQP4 IgG的方法，具有高敏感性和特异性。简而言之，血清中的抗AQP4 IgG被固定在生物芯片上的AQP4转染细胞捕获，随后通过荧光素标记的二抗进行检测。采用荧光显微镜观察荧光信号，荧光强度由至少两名经验丰富的临床医生进行评估。NMOSD的最终诊断需结合抗AQP4 IgG检测结果、临床表现以及神经影像学发现。根据既往研究，CBA相较于其他抗AQP4 IgG检测方法具有更高的敏感性和特异性，可用于NMOSD的临床诊断及科学研究。该方法也存在局限性，例如目前仍缺乏国际统一的血清抗AQP4 IgG滴度评估标准。本文详细描述了一种利用CBA检测人血清中抗AQP4 IgG的实验方案。

引言

血清 AQP4 IgG 是视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的核心诊断生物标志物¹。细胞实验法（CBA）是一种广泛应用的抗 AQP4 IgG 检测方法，具有高敏感性和特异性。本文介绍了一种 CBA 的详细实验方案。

水通道蛋白AQP4具有六个跨膜结构域和两个围绕一个水通道的螺旋结构域²。抗AQP4 IgG通过与主要位于星形胶质细胞足突上的靶标AQP4结合，参与视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的发病机制³。研究表明，约三分之二的NMOSD患者抗AQP4 IgG检测呈阳性⁴。在最新的国际NMOSD诊断标准中，抗AQP4 IgG被视为核心诊断生物标志物⁵。因此，建立一种可靠的检测人血清中抗AQP4 IgG的方法，对于促进NMOSD的临床诊断至关重要。

目前，已有多种抗AQP4 IgG检测方法，例如细胞结合试验（CBA）、基于组织的检测法、酶联免疫吸附试验和流式细胞术^6,7。CBA采用转染了人源AQP4的EU90细胞来捕获抗AQP4 IgG，被捕获的抗AQP4 IgG通过荧光标记的二抗进行检测，并随后通过显微镜观察。越来越多的证据表明，CBA在敏感性和特异性方面优于其他抗AQP4 IgG检测方法^6,7。一项荟萃分析显示，CBA的敏感性和特异性分别为76%和99%，高于基于组织的检测法和酶联免疫吸附试验⁶。此外，已有研究开展了针对抗AQP4 IgG诊断检测方法的多中心比较⁷。该研究共纳入来自15个欧洲诊断中心的193名受试者⁷，采用四种不同的方法检测血清中的抗AQP4 IgG⁷，结果表明CBA在敏感性和特异性方面优于其他方法⁷。由于AQP4存在两种主要亚型（AQP4-M1和AQP4-M23），抗AQP4 IgG捕获细胞可分别转染AQP4-M1或AQP4-M23。然而，哪种类型的捕获细胞更优仍存在争议。有研究支持基于AQP4-M1的CBA⁸，而其他研究则提示基于AQP4-M23的CBA更优^7,9,10。然而，基于AQP4-M23的CBA可能因非特异性IgG结合而导致假阳性结果⁸。Jarius 等.¹¹报道，基于AQP4-M1与基于AQP4-M23的CBA在抗AQP4 IgG检出率方面无显著差异。

总之，血清抗AQP4 IgG是视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）的核心生物标志物。与其它抗AQP4 IgG检测方法相比，细胞结合试验（CBA）具有更高的特异性和敏感性。目前关于基于AQP4-M1还是AQP4-M23的CBA更优仍存在争议。本文详细描述了一种基于AQP4-M1的CBA实验方案，可用于NMOSD的临床诊断及相关研究。

方案

该程序经吉林大学第一医院伦理委员会批准，并在约1,500名受试者中进行。

1. 患者入组与血液样本采集

1. 对具有以下主诉和症状的临床患者进行血清抗AQP4 IgG的实验室检测。同时进行体格检查。
   
   视神经炎：患者出现视力障碍，如视野缺损和视力下降。
   急性脊髓炎：患者可能出现瘫痪、感觉障碍和自主神经功能障碍。
   延髓最后区综合征：患者可能出现无法解释的呃逆、恶心或呕吐症状。
   急性脑干综合征：脑干病变可因病变部位不同而引起不同的症状和体征。
   伴有NMOSD典型间脑部MRI病变的症状性发作性睡病或急性间脑临床综合征。
   伴有NMOSD典型脑部病变的症状性大脑综合征。
   
   注意：根据国际公认的NMOSD诊断标准⁵，若患者血清抗AQP4 IgG阳性，并至少具备上述一种核心临床特征，即可诊断为NMOSD。然而，我们不推荐对仅表现为视神经炎的患者进行抗AQP4 IgG检测。
2. 血液样本采集
   ​注意：患者无需空腹。
   1. 使用4 mL真空采血管采集2–3 mL静脉血。
   2. 在室温（RT）下静置30分钟使血清凝固。
      注意：凝固时间过长可能导致血小板内容物渗漏，从而升高血清中相关物质水平。
   3. 以2100 × g 离心5分钟。小心将血清转移至新试管中。
   4. 立即进行血清分析，或分装后于-20 °C或-80 °C保存。
      注意：-20 °C适用于数月内的短期保存，而-80 °C适用于长期数年保存。

2. 抗AQP4抗体检测

警告：患者样本和使用过的试剂盒试剂应视为具有传染性的材料。试剂盒中含叠氮化钠的试剂具有毒性。图1提供了本实验方案的流程图。

1. 准备
   1. 使用前将试剂盒恢复至室温（RT）。
      注意：试剂盒应储存于 2–8 °C。
   2. 配制至少 200 mL 含 0.2% Tween 20 的 PBS 洗涤缓冲液。将 100 mL 洗涤缓冲液倒入 500 mL 烧杯中。
   3. 用洗涤缓冲液将血清样本稀释 10 倍。根据供应商说明书配制阳性对照和阴性对照。
2. 样本孵育
   1. 向试剂托盘的反应区域加入 30 µL 预稀释的样本、阳性对照或阴性对照（图 2）。
      注意：避免产生气泡。
   2. 移除生物芯片载片上的保护盖。
      注意：切勿触碰生物芯片，以防固定细胞脱落或污染。在移除保护盖时，应手持载片两侧操作。
   3. 将生物芯片载片置于试剂托盘上（图 2），在室温下开始 30 分钟孵育。
      注意：每个样本应形成独立的液滴，并与对应的生物芯片区域接触，不得与其他液滴混合。
   4. 用洗涤缓冲液轻轻冲洗生物芯片载片一次。将载片浸入盛有 100 mL 洗涤缓冲液的 500 mL 烧杯中，至少浸泡 5 分钟。如有可能，将烧杯置于摇床上进行操作。
   5. 从洗涤缓冲液中取出生物芯片载片。用纸巾小心擦去反应区域外残留的缓冲液。将载片在空气中暴露 1–2 分钟，使反应区域表面残留的缓冲液蒸发。
      注意：切勿使反应区域完全干燥。切勿用纸巾接触生物芯片表面。
3. 二抗孵育
   1. 根据供应商说明书配制二抗溶液。
   2. 向洁净的试剂托盘的反应区域加入 25 µL 荧光标记的二抗。
   3. 将生物芯片载片置于已加入二抗的试剂托盘上，在室温下孵育 30 分钟。
4. 封片
   1. 倒掉使用过的洗涤缓冲液，向烧杯中加入 100 mL 新鲜洗涤缓冲液。重复步骤 2.2.4 和 2.2.5 中所述的洗涤过程。
   2. 小心地向生物芯片载片的每个反应区域加入封片介质（每区域一滴）。用一片盖玻片密封载片，避免产生气泡。
5. 荧光检测
   1. 开启显微镜荧光光源，预热 15 分钟。选择 488 nm 滤光片。
   2. 打开图像采集软件。对所有反应区域的转染区和未转染区，在不同放大倍数下拍摄图像。首先以 4× 放大倍数拍摄一张概览图像，随后使用 10× 和 20× 放大倍数拍摄更多图像。
      注意：详细实验方案见表 1。结果解读参见代表性结果部分。

3. 患者诊断

1. 如果患者血清抗AQP4 IgG阳性，并且至少表现出一种NMOSD的核心临床特征（参见讨论部分），则诊断该患者为NMOSD⁵。然而，如果患者抗AQP4 IgG阴性，也不能排除NMOSD的诊断。

结果

使用此处所述方法，可检测血清中特异性的抗AQP4 IgG。在操作过程中，将预稀释的样本、阳性对照和阴性对照加入反应区域，该区域包含转染和未转染的区域。图2）。转染区域中阴性对照的荧光信号主要表明二抗在生物芯片上与转染细胞发生了非特异性结合图3）。可见均匀的弱荧光（图3）。作为阳性对照，向反应区域添加了抗AQP4抗体。在转染区域观察到强烈的荧光，表明抗AQP4 IgG与转染细胞中的AQP4-M1特异性结合（图4). 未转染区域阳性对照的荧光显示，抗AQP4 IgG对生物芯片上固定的细胞存在非特异性结合迹象图4）。对于10倍稀释的样本，抗AQP4 IgG阴性血清显示出与阴性对照相似的荧光模式，而阳性血清则显示出与阳性对照相似的荧光模式（图5...

讨论

我们介绍了一种广泛适用的方法，用于检测人血清中的抗AQP4 IgG。抗AQP4 IgG与视神经脊髓炎谱系疾病（NMOSD）密切相关，建立可靠的抗AQP4 IgG检测方法对于NMOSD的临床诊断至关重要。首先，抗AQP4 IgG对NMOSD具有特异性。多发性硬化症也是一种中枢神经系统的免疫介导性疾病，与NMOSD有许多相似之处¹²。然而，抗AQP4 IgG仅在NMOSD患者中呈阳性¹³。其次，NMOSD患者中普遍存在抗AQP4 IgG。大约三分之二的NMOSD患者血清抗AQP4 IgG呈阳性⁴。第三，目前最新的NMOSD诊断标准基于血清抗AQP4 IgG检测⁵。综上所述，血清抗AQP4 IgG检测有助于NMOSD的临床诊断。

在多种抗AQP4 IgG检测方法中，细胞结合试验（CBA）因其高灵敏度和特异性而被广泛用于临床诊断^6,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗水通道蛋白-4间接免疫荧光检测	Euroimmun	FA 1128-2005-50	包含经AQP4-M1转染和未转染的EU 90细胞包被的生物芯片载片、荧光素标记的抗人IgG、抗AQP4抗体阳性对照、抗体阴性样本、pH 7.2 PBS用盐、Tween 20及封片介质。
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	摄影软件
凝胶 &和凝血活化剂管	改善医疗	623040202	来自一家中国本地公司