肾上腺皮质分泌的激素对动物抵抗应激和疾病至关重要。本文介绍了一种原代大鼠肾上腺细胞的培养方案。该方法可作为体外研究感兴趣试剂在肾上腺类固醇生成和脂质生物合成中作用机制的良好平台。
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摘要
摘要
肾上腺皮质分泌的激素对动物抵抗应激和疾病至关重要。本文所述方法为大鼠肾上腺细胞的原代培养及相关功能检测（包括脂滴表面蛋白的免疫荧光染色以及皮质酮分析）。与体内模型相比，肾上腺单层细胞培养的实验间变异较小，实验条件更易于控制。此外，大鼠的来源也比其他动物（如牛）更为稳定。目前也有多种人肾上腺细胞系（如 NCI-H295、NCI-H295R、SW13 等）可用于肾上腺研究。然而，这些细胞系的类固醇生成仍会受到多种因素影响，包括血清批次、传代次数、特定基因的突变或缺失等。除缺乏 17α-羟化酶外，大鼠肾上腺皮质细胞的原代培养是一种更优且更便捷的研究肾上腺生理学的技术。总之，大鼠肾上腺原代培养可为研究人员提供一个良好的体外平台，用于探究感兴趣试剂在肾上腺系统中的作用机制。
引言
内分泌系统负责调节生理活动和维持内环境稳态1。位于肾脏头端极的肾上腺是主要的内分泌器官之一，可分泌盐皮质激素、糖皮质激素和雄激素2,3。肾上腺由两个结构不同的部分组成：皮质和髓质。肾上腺皮质分为三层：外层的球状带、中间的束状带和内层的网状带3。球状带是盐皮质激素醛固酮的主要分泌部位，醛固酮有助于肾脏对钠离子和水的重吸收3。在正常生理条件下，束状带主要产生基础水平的糖皮质激素3。啮齿类动物中的皮质酮和人类中的皮质醇可通过调节血糖水平，帮助机体应对压力3。在一定程度上，它们还能抑制炎症反应并调节免疫系统4,5。与其他哺乳动物不同，由于肾上腺中缺乏17α-羟化酶的表达，小鼠和大鼠没有功能性的网状带6,7。因此，小鼠和大鼠的肾上腺不分泌C-19类肾上腺甾体（如皮质醇和肾上腺雄激素）。
原代培养的肾上腺皮质细胞已被证明可用于研究调控肾上腺生理功能的机制8。与其他类固醇生成组织类似，肾上腺的每个区域均以游离胆固醇为前体合成其类固醇激素9。在促肾上腺皮质激素（ACTH）刺激下，游离胆固醇通过脂滴降解而释放，从而增强束状带和网状带的类固醇生成10。
许多研究团队曾尝试建立稳定的肾上腺皮质癌细胞系。然而，若干问题限制了肾上腺皮质细胞系作为体外模型的应用8。细胞系的类固醇反应可能因传代次数、血清批号以及血清质量等因素而存在差异。此外， commercially available adrenal cell lines（Y1 和 SW13）不分泌皮质酮，这使得肾上腺类固醇生成的研究更加困难8。使用牛和马的肾上腺作为离体模型可能是一个较好的选择，尽管这些来源的组织可能带来一些未知风险。与之相比，大鼠肾上腺的获取和管理更为简便，且来源相对稳定、无病原体污染。综上所述，本文所述方法可用于研究大鼠肾上腺束状带细胞中皮质酮合成的相关机制。
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方案
所有涉及动物实验的操作均已获得高雄医学大学机构动物照护及使用委员会的批准。
1. 实验步骤
- 采用 CO2 安乐死法处死成年（8 至 12 周龄）雌性/雄性 SD 大鼠。
- 使用 70% 乙醇涂抹皮肤，待其吸收后，用纸巾擦拭皮肤。
- 将大鼠仰卧置于洁净的塑料板上。
- 用“外弯”型镊子在腹中线处提起皮肤，进行钝性分离，形成“Y”形切口（从大腿水平至肋下角）。
- 用 70% 乙醇冲洗剪刀，然后同样以“Y”形切开肌肉。
- 在胃后方寻找左侧肾上腺。
注意：右侧肾上腺位于肝脏深部。- 用一对镊子提起胃或肝脏，用另一把弯头镊子分离肾上腺。
- 将肾上腺组织放入无菌培养皿后，用精细镊子小心去除肾上腺包膜。
- 用精细剪刀在少量无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）/F-12 培养基中将肾上腺剪成小块。
- 准备三种不同孔径的巴斯德吸管，先用第一个吸管将所有肾上腺组织块吸入含有胶原酶 II（约 0.5–0.8 mg/mL）的 50 mL 锥形管中。
- 轻柔吹打组织块约 10 次。依次使用其余吸管重复上述步骤，直至所有组织块变小。
注意：可通过火焰加热制备不同孔径的巴斯德吸管。第一根为原始孔径（约 1 mm），第二根孔径约 0.8 mm，第三根约 0.5 mm。消化过程中组织块会逐渐变小，因此通过此机械操作可更充分地完成肾上腺组织的消化。将锥形管置于 37 °C 水浴中，每 5 分钟摇动一次，共摇动 4 次。
- 轻柔吹打组织块约 10 次。依次使用其余吸管重复上述步骤，直至所有组织块变小。
- 孵育 20 分钟后，加入新鲜且预冷的培养基（六倍体积；例如，5 mL 组织加 25 mL 冷 DMEM/F-12 培养基），其中含 2.5% 胎牛血清（FBS）和 5% 马血清，以终止酶反应。
- 以 800 × g 离心 10 分钟，收集细胞沉淀。
- 加入适量培养基重悬细胞。
注意：每只肾上腺可获得约 ~3 × 105 至 ~4 × 105 个细胞。 - 将细胞接种于所需培养板或培养皿中，加入生长培养基（DMEM 与 Ham’s F-12 培养基按 1:1 [v/v] 混合，添加 25 mM HEPES 及 1% 青霉素-链霉素），在 37 °C、95% 空气与 5% CO2 的湿化环境中培养过夜（第 0 天）。
注意：通常，我们为皮质酮检测将细胞接种于 24 孔板（每板四只腺体），为 Western blot 分析接种于 35 mm 培养皿（每只腺体约一至两个培养皿）。 - 第 1 天，用无血清的温 DMEM/F-12 培养基小心洗涤细胞两次，更换新鲜生长培养基。
- 将细胞继续在 37 °C、95% 空气与 5% CO2 的湿化环境中培养至第 3 天。
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结果
采用此处所述方法，可在相差显微镜下区分原代培养的肾上腺细胞（图1A）。为进一步确认细胞质内的囊泡为脂滴，可在培养第3天进行脂肪分化相关蛋白（ADRP）的免疫荧光染色（图1B）。细胞培养于玻璃盖玻片上，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次后，以4%多聚甲醛固定。再用PBS洗涤三次，随后在含5%脱脂奶粉的0.1% Triton X-100溶液中进行封闭和通透处理。将一抗ADRP抗体用5%脱脂奶粉按1:50稀释，4℃孵育过夜。PBS洗涤三次后，加入羊抗兔Alexa Fluor 488二抗（1:100）孵育。重复洗涤步骤后，用ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂封片，并在荧光显微镜下观察。此外，可通过皮质酮检测法测定大鼠肾上腺细胞的激素分泌能力。促肾上腺皮质激素（ACTH）刺激大鼠肾上腺细胞可作为阳性对照（图1C）。收集的培养上清液经稀释后，按照Chen等11
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讨论
肾上腺在环境适应中发挥关键作用3肾上腺皮质分泌的激素能够调节和维持生理功能及内环境稳态3体内 模型能够反映体内真实的生理效应，但其仍受多种复杂因素影响，导致实验结果不稳定。相比之下，体外细胞模型具有动物模型无法比拟的优势。首先，体外系统易于控制环境条件。激素易受各种刺激影响，而体内实验常因动物产生应激反应而导致非特异性结果。其次，物质在体内容易难以监测，但在培养体系中则易于检测。第三，体外系统可减少各独立实验间的变异。许多科学研究表明，含10%–20%胎牛血清（FBS）的肾上腺皮质细胞培养基12,13,14,15而本文所述方案采用5% FBS和2.5%马血清，可维持肾上腺细胞生长长达一周。
类固醇生成起始于游离胆固醇被细胞色...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得中国台湾国家科学委员会（NSC102-2320-B-037-008-MY3）以及国立成功大学医院研究基金（NCKUH-10102045）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 雌性/雄性，SD/Wistar 大鼠（8-12 周龄） | BioLASCO | 雄性或雌性大鼠均适用于实验。雌性大鼠的肾上腺比雄性大，但雌性大鼠具有动情周期，可能影响实验结果 | |
| 胶原酶 II 型 | Sigma | C-6885 | 用于肾上腺细胞的分离 |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | 肾上腺细胞用粉末培养基 |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | 肾上腺细胞用粉末培养基 |
| HEPES | JT.baker | 4018 | 缓冲液（粉末） |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| 马血清 | Hyclone | 16050014 | |
| 胎牛血清 | SAFC | 12103C | |
| 青霉素（10,000 U）-链霉素（10,000 µg/mL） | Corning | 30-002-Cl | 抗生素 |
| 弯镊 | BRAUN | BD343R | |
| 镊子 | BRAUN | BD331R | |
| 剪刀 | BRAUN | BC224R | 用于剪开大鼠皮肤和肌肉 |
| 精细剪刀 | BRAUN | BC101R | 用于剪切肾上腺 |
| 脂肪分化相关蛋白 | Abcam | ab108323 | 脂滴相关蛋白抗体 |
| 皮质酮 ELISA 试剂盒 | cayman | 500655 | 用于检测皮质酮合成 |
| 倒置光学显微镜 | Leica | ||
| 荧光显微镜 | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | 用于免疫荧光染色 |
| 山羊抗兔 IgG Alexa 488 荧光二抗 | ThermoFisher | A-11034 | 用于免疫荧光染色 |
| 抗 ADFP 抗体 | Abcam | 108323 | 用于免疫荧光染色 |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | ThermoFisher | P36935 | 用于免疫荧光染色 |
参考文献
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