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无高速离心条件下U937细胞的细胞组分分离

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DOI：

10.3791/59022

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2019年1月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

本文内容

摘要

本文介绍一种无需使用高速离心即可分离U937细胞质膜、细胞质和线粒体的实验方案。该技术可用于纯化亚细胞组分，以便后续分析蛋白质的定位。 通过 免疫印迹。

摘要

本实验方案详细描述了一种无需使用超速离心或非特异性去垢剂即可获得U937细胞亚细胞组分的方法。该方法利用低渗缓冲液、皂苷（digitonin）、机械裂解和差速离心，分离细胞质、线粒体和质膜组分。该流程可根据研究人员的需求进行规模调整，成本低廉且操作简便。本方法使研究人员能够在无需专用离心机和商业试剂盒的情况下确定蛋白质在细胞内的定位，而这两者通常价格昂贵，难以普及。我们已成功应用该方法分离人单核细胞系U937中的胞质、质膜和线粒体蛋白。

引言

在研究真核细胞中的分子通路时，通常需要可靠地鉴定蛋白质的定位。研究人员常采用获取细胞器组分的方法，以更深入地分析感兴趣的细胞结构组分。

现有的细胞分级分离方法大多可分为两大类：基于去垢剂的方法1,2和基于超速离心的方法3,4,5，这两类方法在速度、精确性和成本方面有所不同。基于去垢剂的方案依赖于使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，以溶解细胞的不同组分。该方法处理样品快速且方便，若样品数量较少且体积较小，则可能具有较高的成本效益。市面上可购买到基于去垢剂的试剂盒，用于从细胞中分离胞质、膜/细胞器（混合组分）以及核组分。然而，这些试剂盒存在若干缺点，限制了其在科研中的应用价值。这些试剂盒仅设计用于简便地分离一种或两种细胞组分，无法同时从同一样品中分离出所有组分。由于使用了去垢剂，细胞质膜和膜包被的细胞器将被同等程度地溶解，因而无法彼此分离。此外，这些试剂盒中含有专有组分，使得研究人员无法根据特定应用需求调整实验条件。最后，这类试剂盒使用次数有限，对于大规模实验而言可能价格过高。虽然也存在非去垢剂型试剂盒可用于线粒体的分离，但它们并不适用于质膜的分离，且样品得率明显低于基于密度梯度离心的分离方案6,7。

利用超速离心法获取组分的方法较为耗时，但通常比基于去垢剂的试剂盒获得的组分纯度更高。为在不首先溶解细胞的情况下分离细胞质膜（避免与膜性细胞器发生污染），需采用非去垢剂方法裂解细胞，随后分离细胞组分 通过 差速离心——质膜分离需要100,000 × g的离心速度 g 以完成。在许多情况下，差速离心后还需进行等密度梯度离心，以进一步分离细胞组分或去除污染物。尽管这些方法较为彻底且具有可调整性，但其缺点包括成本较高、耗时较长，以及需要使用超速离心机来进行组分分离和进一步纯化 通过 密度梯度离心。大多数高速离心机价格昂贵，对个体研究者而言难以负担，通常为学术机构内共享的核心设备。因此，在这些情况下，超速离心机的可及性受到限制。

在本分离方案中，我们展示了在不使用溶解性去污剂且无需高速离心的情况下，分离亚细胞组分的方法。该方法可使研究人员分离真核细胞的质膜、线粒体及细胞质组分，且各组分间的交叉污染最小。

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方案

1. 准备缓冲液和试剂

注意：见表1。

  1. 配制缓冲液A、裂解缓冲液B、样品缓冲液和皂苷溶液。
    1. 在900 mL去离子水中加入8.77 g NaCl和50 mL HEPES（1 M，pH 7.4），用去离子水定容至1 L，配制缓冲液A。
      注：终浓度为150 mM NaCl和50 mM HEPES。
    2. 在900 mL去离子水中加入20 mL HEPES（1 M，pH 7.4）、0.75 g KCl、0.19 g MgCl2、2 mL乙二胺四乙酸（0.5 M EDTA）、2 mL乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（0.5 M EGTA）、38.26 g甘露醇和23.96 g蔗糖，用去离子水定容至1 L，配制裂解缓冲液B。
      注：终浓度为20 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、210 mM甘露醇和70 mM蔗糖。
    3. 在10 mL Tris缓冲盐水（TBS）中加入0.01 g十二烷基硫酸钠（SDS），配制样品缓冲液，终浓度为0.1% SDS。
    4. 在100 mL去离子水中加入25 mg皂苷，配制皂苷储存液（终浓度为250 µg/mL）。
    5. 所有缓冲液于4 °C保存，皂苷于-20 °C保存，直至实验开始前使用。
  2. 在使用前，新鲜配制蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂溶液，并加入缓冲液中。
    1. 在1 mL 100%乙醇中加入17.4 mg苯甲基磺酰氟（PMSF），配制PMSF储存液（终浓度为100 mM）。
      注意：操作PMSF时应穿戴适当的防护装备并小心操作。PMSF若被摄入具有危害性，与皮肤接触（刺激物）、眼睛接触（刺激物）或吸入时具有轻微危害性；对眼睛和皮肤具有腐蚀性。
    2. 根据生产商说明书配制市售的蛋白酶抑制剂混合物（100×）（参见材料表）。
    3. 在1 mL去离子水中加入92 mg原钒酸钠（SOV），配制SOV储存液（终浓度为500 mM）。
      注意：操作时应穿戴适当的防护装备并小心操作。SOV在眼睛接触（刺激物）、摄入或吸入时具有危害性。严重暴露可能导致死亡。

2. PBS 洗涤

  1. 在分馏前，用磷酸盐缓冲液（PBS）浓缩并洗涤细胞。
    1. 以适当转速离心细胞悬液以形成沉淀。例如，将U937细胞悬液在400 × g条件下离心 g 10 分钟。
    2. 去除上清液，将细胞沉淀用室温 PBS 重悬，终浓度为 4 × 106 细胞/mL，轻轻吹打以分散团块。
    3. 将细胞悬液在400 × g 离心10分钟以沉淀细胞。
    4. 去除上清液，并将细胞沉淀重悬于 冰冻的 缓冲液A，终浓度为2 × 107 细胞/毫升
      注意：所有后续步骤均应在 4 °C 或置于冰上，所有缓冲液均应 预冷的.

3. 胞质蛋白提取

  1. 通过用去污剂皂苷（digitonin）孵育提取胞质蛋白。
    1. 在细胞重悬之前（步骤 3.1.3），向 878 µL 缓冲液 A 中加入 10 µL PMSF 储存液（100 mM）、10 µL 蛋白酶抑制剂（100×）、2 µL SOV 储存液（500 mM）和 100 µL digitonin 储存液（250 µg/mL），终浓度分别为 1 mM PMSF、1× 蛋白酶抑制剂、1 mM SOV 和 25 µg/mL digitonin（根据所用细胞数量调整最终体积）。将该溶液置于 冰上，直至加入细胞沉淀中。
    2. 将细胞悬液在 400 × g 离心 10 分钟，并弃去上清液。
    3. 将细胞沉淀用含有抑制剂和 digitonin 的缓冲液 A 溶液（按步骤 3.1.1 配制）重悬，终浓度为 2 × 107 个细胞/mL，轻轻吹打以分散团块。
    4. 将细胞悬液置于 4 °C 下，使用翻转式旋转仪孵育 20 分钟。
    5. 将细胞悬液在 400 × g 离心 10 分钟。收集上清液并转移至洁净的离心管中。
    6. 将收集的上清液在 18,000 × g 离心 20 分钟，以沉淀细胞碎片。
    7. 将上清液转移至另一洁净离心管中。
    8. 重复步骤 3.1.5 和 3.1.6，直至离心后无沉淀产生。
    9. 收集含有 胞质蛋白 的上清液，于 4 °C 短期保存或 -20 °C 长期保存。
  2. 通过离心去除过量 digitonin 和胞质蛋白。
    1. 将经 digitonin 透化的细胞沉淀（来自步骤 3.1.5）用缓冲液 A 重悬，终浓度为 4 × 106 个细胞/mL，轻轻吹打以分散团块。
    2. 将经 digitonin 透化的细胞悬液在 400 × g 离心 10 分钟，并弃去上清液。
      注：可重复用缓冲液 A 洗涤，以去除过量的胞质污染物。

4. 细胞匀浆

  1. 将细胞在含有裂解缓冲液B的冰上孵育，并通过机械方法裂解细胞。
    1. 在重悬细胞前（步骤4.1.2），立即向988 µL裂解缓冲液B中加入10 µL PMSF储备液（100 mM）和2 µL SOV储备液（500 mM），使终浓度分别为1 mM PMSF和1 mM SOV（根据待裂解细胞数量调整最终体积），并将该溶液置于冰上，直至加入细胞沉淀中。
    2. 将细胞沉淀（来自步骤3.2.2）重悬于含PMSF和SOV的预冷裂解缓冲液B中（按步骤4.1.1配制），终浓度为4 × 106 细胞/mL。
    3. 将细胞悬液置于冰上孵育30分钟。
    4. 将细胞悬液转移至预冷的Dounce匀浆器（配备紧密贴合的B型杵头）中，在冰上以缓慢、均匀的动作进行40次匀浆操作。
      注：也可采用讨论部分所述的其他机械裂解方法。
    5. 收集匀浆液并转移至洁净的离心管中。
    6. 用少量裂解缓冲液B（1至2 mL）冲洗匀浆器的杵头和管体，并将冲洗液加入匀浆液中。
    7. 在400 × g 条件下（或足以沉淀未破裂细胞的最低转速）离心10分钟。
    8. 将上清液转移至新的洁净离心管中。
      注意：若仍有明显沉淀残留，可重复步骤4.1.4至4.1.6，以提高组分得率，具体参见讨论部分。本实验方案可在此处暂停，匀浆液可在4 °C短期保存（24小时）。

5. 差速离心

  1. 以逐渐增加的离心速度离心匀浆液，以去除细胞碎片，并分离线粒体和膜组分。
    1. 将上清液（来自步骤 4.1.8）在 500 × g 条件下离心 10 分钟。将上清液转移至洁净的离心管中，并弃去任何沉淀。
    2. 将上清液（来自步骤 5.1.1）在 1,000 × g 条件下离心 10 分钟。将上清液转移至洁净的离心管中，并弃去任何沉淀。
    3. 将上清液（来自步骤 5.1.2）在 2,000 × g 条件下离心 10 分钟。将上清液转移至洁净的离心管中，并弃去任何沉淀。
    4. 将上清液（来自步骤 5.1.3）在 4,000 × g 条件下离心 15 分钟。将上清液转移至洁净的离心管中，保留含有线粒体的沉淀。
    5. 用少量裂解缓冲液 B（0.5‒1 mL）重悬线粒体沉淀。
    6. 将悬浮的沉淀在 4,000 × g 条件下离心 15 分钟。弃去上清液，并将线粒体沉淀重悬于所需终体积的样品缓冲液中（例如，250 至 500 µL，根据沉淀大小和所需浓度而定）。
    7. 将上清液（来自步骤 5.1.4）在 4,000 × g 条件下离心 15 分钟。将上清液转移至洁净的离心管中。重复此步骤，直至离心后不再产生沉淀。
    8. 将上清液在 18,000 × g 条件下离心 3 小时。
    9. 弃去上清液，保留含有膜蛋白的沉淀。用少量裂解缓冲液 B（0.5–1 mL）重悬膜沉淀。
    10. 将悬浮的沉淀在 18,000 × g 条件下离心 1 小时。
    11. 弃去上清液，并将膜沉淀重悬于所需终体积的样品缓冲液中（250 至 500 µL，根据沉淀大小和所需浓度而定）。
  2. 将样品沉淀置于冰浴中，以 5 的功率设置（20 kHz 下最大功率 125 W 的 50%，参见材料表）超声处理 3 秒。
  3. 将样品储存在 4 °C（短期）或 -20 °C（长期）。
  4. 通过使用针对细胞质、线粒体和膜区室中蛋白质标志物的抗体进行 Western 印迹，检测样品的分馏纯度（参见代表性结果部分）。

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结果

成功分离未分化的 U9378 采用上述详细方案并参照图示，完成了悬浮培养细胞的实验。 图1采用该方法获得的样品进行蛋白质印迹检测9 采用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。随后使用针对细胞质、线粒体及膜定位蛋白标志物的抗体对膜进行孵育图2, 图3, 图4）。可通过使用针对胞质蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抗体探测印迹，验证细胞质蛋白提取是否成功。10 （GAPDH），通常定位于细胞质中。免疫印迹结果如图所示图2；下图，泳道 1 和 2），GAPDH 仅存在于皂苷素提取的样品中，且在 4,000 × g 沉淀

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讨论

本实验方案的建立源于使用商业化试剂盒无法有效分离线粒体和细胞膜组分，以用于坏死性凋亡过程中蛋白质定位分析的问题14预装试剂盒的主要局限性在于无法根据个体研究者的需求进行调整、单个样本成本较高，以及可处理的样本数量有限。本文所述方法无需使用昂贵的试剂，也无需依赖昂贵的仪器设备。该方法可按需扩展以适应任意数量的细胞，并可根据研究者的需求进行调整，从而提高各组分的得率，针对具体研究内容优化操作步骤，并在方法执行上提供灵活性。若研究者不需分析最终样本中蛋白质的磷酸化状态，缓冲液中的正钒酸钠可省略；同样，若研究者希望对样本进行进一步纯化，最终缓冲液中的SDS也可省略。 通过 密度梯度离心。尽管我们仅使用该方法成功分离了U937细胞（一种非贴壁型单核细胞系），但经过微小调整后，该方案应适用于多种细胞系和组织。悬浮培养的细胞可参照本文所述U937细胞的方法进行沉淀，而贴壁细胞系则需在开始本方案前从生长表面解离。类似地，组织在进行细胞分离前必须充分匀浆。可通过使用松配合的Dounce匀浆器、Potter-Elvehjem玻璃-聚四氟乙烯匀浆器或其他（商业）方法实现匀浆。

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致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为1R15HL135675-01，授予Timothy J. LaRocca

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DigitoninTCI ChemicalsD0540用于细胞质提取
D-MannitolSigma-AldrichM4125用于裂解缓冲液B
Dounce匀浆器VWR22877-282用于匀浆
滚轴混合仪BarnsteadN/A用于细胞质提取
乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）Alfa AesarJ61721用于裂解缓冲液B
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-AldrichE7889用于裂解缓冲液B
GAPDH (14C10)Cell Signalling Technologies2118用于Western blot检测细胞质组分，稀释比例：1:10000
HEPESVWRJ848用于裂解缓冲液A和B
KClSigma-AldrichP9541用于裂解缓冲液B
MgCl2Alfa Aesar12315用于裂解缓冲液B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)Cell Signalling Technologies23565用于Western blot检测质膜组分，稀释比例：1:1000
NaClSigma-Aldrich793566用于裂解缓冲液A
苯甲基磺酰氟（PMSF)VWRM145用于细胞质提取和匀浆缓冲液
探头式超声仪QsonicaQ125-110用于最终样品处理
蛋白酶抑制剂混合物（通用型）VWRM221-1ML用于细胞质提取
冷冻离心机Beckman-CoulterN/A
十二烷基硫酸钠（SDS）VWR227用于上样缓冲液
正钒酸钠（SOV）Sigma-Aldrich450243用于裂解缓冲液A和B
蔗糖Sigma-AldrichS0389用于裂解缓冲液B
Tris缓冲盐水（TBS）VWR788用于上样缓冲液
VDAC (D73D12)Cell Signalling Technologies4661用于Western blot检测线粒体组分，稀释比例：1:1000

参考文献

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