本文介绍一种无需使用高速离心即可分离U937细胞质膜、细胞质和线粒体的实验方案。该技术可用于纯化亚细胞组分，以便后续分析蛋白质的定位。 通过 免疫印迹。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案详细描述了一种无需使用超速离心或非特异性去垢剂即可获得U937细胞亚细胞组分的方法。该方法利用低渗缓冲液、皂苷（digitonin）、机械裂解和差速离心，分离细胞质、线粒体和质膜组分。该流程可根据研究人员的需求进行规模调整，成本低廉且操作简便。本方法使研究人员能够在无需专用离心机和商业试剂盒的情况下确定蛋白质在细胞内的定位，而这两者通常价格昂贵，难以普及。我们已成功应用该方法分离人单核细胞系U937中的胞质、质膜和线粒体蛋白。
引言
在研究真核细胞中的分子通路时，通常需要可靠地鉴定蛋白质的定位。研究人员常采用获取细胞器组分的方法，以更深入地分析感兴趣的细胞结构组分。
现有的细胞分级分离方法大多可分为两大类：基于去垢剂的方法1,2和基于超速离心的方法3,4,5，这两类方法在速度、精确性和成本方面有所不同。基于去垢剂的方案依赖于使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，以溶解细胞的不同组分。该方法处理样品快速且方便，若样品数量较少且体积较小，则可能具有较高的成本效益。市面上可购买到基于去垢剂的试剂盒，用于从细胞中分离胞质、膜/细胞器（混合组分）以及核组分。然而，这些试剂盒存在若干缺点，限制了其在科研中的应用价值。这些试剂盒仅设计用于简便地分离一种或两种细胞组分，无法同时从同一样品中分离出所有组分。由于使用了去垢剂，细胞质膜和膜包被的细胞器将被同等程度地溶解，因而无法彼此分离。此外，这些试剂盒中含有专有组分，使得研究人员无法根据特定应用需求调整实验条件。最后，这类试剂盒使用次数有限，对于大规模实验而言可能价格过高。虽然也存在非去垢剂型试剂盒可用于线粒体的分离，但它们并不适用于质膜的分离，且样品得率明显低于基于密度梯度离心....
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方案
1. 准备缓冲液和试剂
注意：见表1。
- 配制缓冲液A、裂解缓冲液B、样品缓冲液和皂苷溶液。
- 在900 mL去离子水中加入8.77 g NaCl和50 mL HEPES（1 M，pH 7.4），用去离子水定容至1 L，配制缓冲液A。
注：终浓度为150 mM NaCl和50 mM HEPES。 - 在900 mL去离子水中加入20 mL HEPES（1 M，pH 7.4）、0.75 g KCl、0.19 g MgCl2、2 mL乙二胺四乙酸（0.5 M EDTA）、2 mL乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（0.5 M EGTA）、38.26 g甘露醇和23.96 g蔗糖，用去离子水定容至1 L，配制裂解缓冲液B。
注：终浓度为20 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mM EGTA、210 mM甘露醇和70 mM蔗糖。 - 在10 mL Tris缓冲盐水（TBS）中加入0.01 g十二烷基硫酸钠（SDS），配制样品缓冲液，终浓度为0.1% SDS。
- 在100 mL去离子水中加入25 mg皂苷，配制皂苷储存液（终浓度为250 µg/mL）。
- 所有缓冲液于4 °C保存，皂苷于-20 °C保存，直至实验....
- 在900 mL去离子水中加入8.77 g NaCl和50 mL HEPES（1 M，pH 7.4），用去离子水定容至1 L，配制缓冲液A。
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结果
成功分离未分化的 U9378 采用上述详细方案并参照图示，完成了悬浮培养细胞的实验。 图1采用该方法获得的样品进行蛋白质印迹检测9 采用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。随后使用针对细胞质、线粒体及膜定位蛋白标志物的抗体对膜进行孵育图2, 图3, 图4）。可通过使用针对胞质蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶的抗体探测印迹，验证细胞质蛋白提取是否成功。10 （GAPDH），通常定位于细胞质中。免疫印迹结果如图所示图2；下图，泳道 1 和 2），GAPDH 仅存在于皂苷素提取的样品中，且在 4,000 × g 沉淀
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讨论
本实验方案的建立源于使用商业化试剂盒无法有效分离线粒体和细胞膜组分，以用于坏死性凋亡过程中蛋白质定位分析的问题14预装试剂盒的主要局限性在于无法根据个体研究者的需求进行调整、单个样本成本较高，以及可处理的样本数量有限。本文所述方法无需使用昂贵的试剂，也无需依赖昂贵的仪器设备。该方法可按需扩展以适应任意数量的细胞，并可根据研究者的需求进行调整，从而提高各组分的得率，针对具体研究内容优化操作步骤，并在方法执行上提供灵活性。若研究者不需分析最终样本中蛋白质的磷酸化状态，缓冲液中的正钒酸钠可省略；同样，若研究者希望对样本进行进一步纯化，最终缓冲液中的SDS也可省略。 通过 密度梯度离心。尽管我们仅使用该方法成功分离了U937细胞（一种非贴壁型单核细胞系），但经过微小调整后，该方案应适用于多种细胞系和组织。悬浮培养的细胞可参照本文所述U937细胞的方法进行沉淀，而贴壁细胞系则需在开始本方案前从生长表面解离。类似地，组织在进行细胞分离前必须充分匀浆。可通过使用松配合的Dounce匀浆器、Potter-Elvehjem玻璃-聚四氟乙烯匀浆器或其他（商业）方法实现匀浆。
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为1R15HL135675-01，授予Timothy J. LaRocca
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | 用于细胞质提取 |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | 用于裂解缓冲液B |
| Dounce匀浆器 | VWR | 22877-282 | 用于匀浆 |
| 滚轴混合仪 | Barnstead | N/A | 用于细胞质提取 |
| 乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA） | Alfa Aesar | J61721 | 用于裂解缓冲液B |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E7889 | 用于裂解缓冲液B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | 用于Western blot检测细胞质组分，稀释比例：1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | 用于裂解缓冲液A和B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 用于裂解缓冲液B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | 用于裂解缓冲液B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | 用于Western blot检测质膜组分，稀释比例：1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | 用于裂解缓冲液A |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF) | VWR | M145 | 用于细胞质提取和匀浆缓冲液 |
| 探头式超声仪 | Qsonica | Q125-110 | 用于最终样品处理 |
| 蛋白酶抑制剂混合物（通用型） | VWR | M221-1ML | 用于细胞质提取 |
| 冷冻离心机 | Beckman-Coulter | N/A | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | VWR | 227 | 用于上样缓冲液 |
| 正钒酸钠（SOV） | Sigma-Aldrich | 450243 | 用于裂解缓冲液A和B |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | 用于裂解缓冲液B |
| Tris缓冲盐水（TBS） | VWR | 788 | 用于上样缓冲液 |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | 用于Western blot检测线粒体组分，稀释比例：1:1000 |
参考文献
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K.
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