单关节膝痛小鼠模型中疼痛的自发性与诱发性评估

摘要

我们开发了一种诱发性关节炎疼痛的检测方法，并将其与标准化的自发性疼痛测量方法相结合，用于检测不同化学诱导型小鼠关节炎模型中的疼痛。这些方法对不同类型的关节疼痛具有较高的敏感性和可重复性。

摘要

疼痛是关节炎致残的主要原因。目前，关节炎疼痛的治疗仍缺乏有效的手段。临床前模型对于研究疼痛机制以及评估关节炎疗法的有效性具有必要性和实用价值。在关节炎动物模型中测量疼痛具有挑战性。我们已建立在三种小鼠关节炎模型中测量诱发性疼痛和自发性疼痛的方法。我们通过量化小鼠在对疼痛膝关节进行有力触诊时的反应来评估诱发性疼痛。此外，通过测量单侧膝关节诱导关节炎疼痛后，小鼠四只肢体各自承受的体重比例及负重时间，来评估其自发性疼痛。在这些小鼠模型中，关节疼痛会引起诱发性疼痛反应的显著增加以及负重行为的改变。由于小鼠为四足动物，它们会将疼痛肢体的负荷转移至对侧肢体、前肢或两者的组合。这些方法操作简便，所需设备最少，且具有良好的可重复性和对疼痛检测的敏感性。它们适用于在小鼠中研究疾病修饰类关节炎治疗药物以及镇痛药物的效果。

引言

疼痛是关节炎致残的主要原因^1,2。目前可用的镇痛药物常常疗效不佳、具有毒性，并可能加剧全国范围内的麻醉药品滥用问题³。对于终末期关节炎，手术并非总是可行的治疗选择，尤其是在老年患者中，他们可能伴有多种共病。关节内注射类固醇和黏弹性补充治疗在疾病早期可能有效，但在疾病晚期通常会失去疗效⁴。目前尚缺乏有效的关节炎镇痛疗法，而现有治疗方法无法满足这一重大未被满足的临床需求。

临床前模型有助于理解镇痛疗法的作用机制并预测其限制性毒性，但在动物中进行疼痛测量具有挑战性⁵。疼痛的测量方式可以是直接且自发的（静态或动态负重、足部姿势、步态分析、自发活动以及机械或热敏感性），也可以是间接或诱发的（后肢回缩试验、膝关节压缩力或脑成像）⁶。对于轻度单关节炎，步态分析不敏感且缺乏一致性⁷。静态负重可用于测量大鼠后肢疼痛，但在小鼠中实施较为困难。诸如 von Frey 试验等机械敏感性测量方法可间接检测膝关节炎状态下足垫的敏化，但并不能直接测量膝关节疼痛，且操作繁琐。使用 P.A.M.（Pressure Application Measurement）设备测量的膝关节压缩力可用于大鼠，但该设备体积较大，在小鼠中使用时容易引发负面行为，而这些行为未必反映真实的疼痛状态⁸。

我们已开发出用于测量三种不同小鼠关节炎模型中自发性疼痛和诱发性疼痛的方法，这些方法对评估疼痛严重程度以及关节内治疗的镇痛效果具有较高的敏感性和可重复性^9,10。我们还可以将疼痛缓解情况与其他组织学疼痛标志物进行关联分析，并筛选在人体中难以开展研究的实验性药物。通过评估疗效中等的镇痛药物之间的协同作用，可发现更为有效的联合治疗方案。通过采用已被验证的诱发性疼痛和自发性疼痛检测方法，我们避免了仅依赖一种疼痛行为检测而遗漏另一种所反映的疼痛问题，使疼痛测量更接近人类疼痛的评估情况¹¹。通过将疼痛评估限定为两种方法，我们最大限度地减少了动物应激反应（应激可能影响疼痛行为），同时提高了实验室的工作效率。

方案

所有动物实验操作和方案均经明尼阿波利斯退伍军人事务医疗系统（VAHCS）机构动物护理与使用委员会批准，并符合 "实验动物护理和使用指南" （美国国家学术出版社）¹².

1. 动物的选择

注意：所有三种关节炎模型均使用 C57Bl6 小鼠。

1. 可使用雄性或雌性小鼠，但需注意，关节炎疼痛的反应可能因性别以及所测试模型的发病机制而异。
2. 选择已达到性成熟、不再快速生长、且尚未进入可能自发产生关节炎而干扰疼痛测量的老年阶段的小鼠。
   注：在本文所述模型中，12周龄是进行疼痛测量的理想年龄，但具体年龄需根据研究设计而定。关节炎诱导的起始年龄取决于模型发展所需的时间。急性炎症性关节炎（卡拉胶模型）需3小时发展，因此动物在诱导时为12周龄。慢性炎症性关节炎（完全弗氏佐剂模型）需3周发展，因此动物在诱导时为9周龄。慢性退行性关节炎（胶原酶模型）需4周发展，因此动物在诱导时为8周龄。也可在6周龄时诱导关节炎以建立更慢性的退行性关节炎模型，从而允许关节损伤发展6周。然而，小鼠的慢性退行性关节炎不会引起明显的诱发性疼痛。
3. 从国家认可的商业育种机构获取实验动物。
4. 将动物以每笼最多8只的方式群养于标准聚碳酸酯笼中，并自由供应啮齿类动物饲料和饮水。
5. 维持环境温度为72 °C ± 1 °C，相对湿度为33% ± 1%，并保持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。

2. 膝关节内注射

1. 通过使用内径为0.38 mm、外径为1.09 mm的聚乙烯管套包裹0.5英寸针头的长度，仅使针头前端2.5 mm露出，制备一根30 G 2.5 mm的无菌针头。此设计可防止针头插入过深而从关节后方穿出。
2. 选择单侧膝关节进行注射，使用市售电动面部毛发修剪器剃毛，并用聚维酮碘溶液进行皮肤消毒。
3. 以1 L/min的流速给予3%异氟烷与100%氧气混合气体，麻醉小鼠3分钟±1分钟。操作过程中通过鼻罩维持麻醉状态。通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度。注意监测呼吸状况，并尽量减少麻醉暴露时间，以维持充分的呼吸功能。
4. 待小鼠完全麻醉后，将无菌套管针从髌骨下缘稍下方的髌腱中线处穿入关节腔。此前方中线入路可最大程度提高进入关节腔及注射目标物质的准确性。
5. 注射致关节炎物质或镇痛物质均采用相同入路。假手术对照组则按上述方法插入针头，但不注射任何物质。

3. 关节炎的制备

1. 按照上述步骤 2.3 对动物进行麻醉。
2. 称取适量（见下文）的角叉菜胶、完全弗氏佐剂和 IV 型胶原酶，在超净工作台中用生理盐水稀释至适当浓度，以确保操作安全和无菌。
3. 使用 Hamilton 注射器将 10 µl 浓度为 2.5% 的角叉菜胶溶于 0.9% 无菌生理盐水中，注入膝关节，以诱导急性炎症性关节炎。关节炎在注射后 3 小时达到高峰。
4. 向膝关节内注射 30 µL（30 µg）完全弗氏佐剂（CFA），以诱导慢性炎症性关节炎。注射后首先出现急性炎症期，于 1 周时达到高峰，随后进入慢性期，在 3 周时达到高峰。
5. 注射含 10 IU IV 型胶原酶的 10 µL 溶液，以诱导慢性退行性关节炎。关节炎疼痛在注射后 4 周达到高峰。

4. 诱发性关节疼痛的测量

1. 始终先检查正常对照侧膝关节，以尽量减少疼痛膝关节引起的交叉痛觉反应（痛觉敏化）¹³. 
2. 训练检查者施加一致且稳定的700 gf/cm的压力² 使用 Palpometer 4 级压力计施加 10 psi 的压力；当达到此压力水平时，设备将发出 4 次蜂鸣声。该压力水平在关节炎关节中引发的疼痛反应始终强于正常关节。
   注意：该设备在出厂时已校准，当施加适当压力时会发出4声蜂鸣。仅将该设备用于训练；不可在动物身上使用，但在检查动物时，应应用通过训练所掌握的压力程度。
3. 用食指和拇指捏住小鼠颈部的皮肤以固定，力度应足以防止其随意移动，并使用第4指^th 和 5^th 用手指固定尾巴。小鼠在用力或受到刺激时应能够做出微小而短暂的移动，但不能自由或持续地活动。
4. 用空闲手的拇指和食指，以每秒一次的频率，在小鼠膝关节线附近同时对双侧膝关节的外侧和内侧进行重复的有力触诊（Palpometer 4级力度），持续一分钟，同时固定小鼠。小鼠检查时不得使用Palpometer；该仪器仅用于培训。
5. 让第二位观察者记录在此一分钟时间内动物发声以及试图挣脱束缚的次数。挣脱次数与发声次数的总和即为诱发性疼痛评分。
6. 始终由同一名检查者完成整个研究过程，并确保检查者和观察者对实验条件保持盲态。

5. 自发性关节疼痛的测量。

注意：高级动态承重（ADWB）设备可计算动物每只肢体所花费时间占总时间的百分比，以及每只肢体所承受重量占总体重的百分比。

1. 将2升水倒入一个塑料烧杯中。将设备附带的泡沫垫和中密度纤维板与装有水的烧杯一同置于实验室天平上，记录总重量。
2. 打开ADWB程序并选择 小鼠 传感器类型
3. 每次实验前校准系统：
   1. 选择 完全校准 在……之下 校准 菜单。输入 0.00 作为 去皮值 泡沫垫、中密度纤维板、塑料烧杯及水的重量作为 校准砝码，然后选择 下一步.
   2. 选择 塔尔 在将任何物品放置于传感器上之前。在选择之前 获得预览，依次用提供的泡沫垫、中密度纤维板和装有2升水的塑料烧杯覆盖传感器垫。选择 获得预览 一旦校准砝码放置在传感器上。
   3. 调整校准砝码，使其在各个传感器上均匀分布，并当数值达到时 校准指示器 高于95时，选择 增益定义该过程可为各个传感器生成归一化均值，并验证各个传感器的完整性。最后，选择 下一步.
   4. 将校准文件保存到校准文件夹中。
4. 选择 新方法 并在提供处输入 项目 名称和 动物 用于测试的第一只小鼠的名称。
5. 选择 浏览 并打开为该项目创建的校准文件。选择 下一步，确保 启用视频采集 选定，并选择 好的.
6. 称重动物，选择 捕获，并在软件中记录重量。选择 好的.
7. 在采集数据前，不要让小鼠在实验箱中适应，因为该设备用于测量小鼠的自发行为。
8. 将小鼠放入实验箱中，进行5分钟的测试。当动物进入箱内后，选择 启动软件将记录动物在此期间的活动，录制视频并与传感器数据同步，同时自动将视频分割为可分析和不可分析的片段。
   注意：当检测到至少一个稳定区域时，软件将视为可分析的片段。稳定区域的定义为：一个传感器检测到≥2 g，且至少有一个相邻传感器检测到≥1 g，同时该区域的重量分布稳定持续超过0.38秒。
9. 在进行系列分析中的首次分析之前选择 简易评分 和 独立爪部设置.
   注意：简便的评分方式允许对各片段进行迭代验证，其中稳定区域的判定不依赖于该片段首个稳定区域的验证结果。独立的爪子设置使观察者可通过键盘快捷键单独识别每只爪子。观察者在视频和激活传感器的缩放地图上将光标置于相应片段时，使用键盘快捷键将符合最低标准的区域分配为右后爪、左后爪、右前爪、左前爪、双前爪、其他身体部位或忽略区域。
10. 选择 >> 移动到第一个可分析的片段。如果稳定区域未正确识别足部，则将光标悬停在该区域并按下快捷键（右后足， s左后肢， a；右前， w左前， q；双前肢， e；身体的其他部位， z，忽略区域， x）与正确的身体部位相对应。
    注意：为达到分析阈值，至少需要1.5分钟的可分析时间。软件会自动将分析片段按单个或多个足爪进行累加和平均处理后输出。
11. ADWB 软件随后会自动计算在四个肢体选项上所花费的分析时间百分比以及施加的体重百分比（g）。通过选择将这些数值导出至新的电子表格中 结果, 导出，选择 是 回答提示问题，确认是否仅导出前五条摘要行，并选择输出文件的保存位置。
12. 实验结束后，通过吸入二氧化碳安乐死动物，随后进行胸骨切开术。
13. 对于同一组中的每只额外动物，选择 新 并输入一个独特的动物名称，但不要更改项目名称。选择 下一步，确保 启用视频采集 选定，并选择 好的按照步骤5.5至5.12对第二只动物进行相同操作。

结果

通过在使用上述方案进行疼痛评估之前，向C57BL/6J雄性和雌性小鼠的左膝关节内（IA）注射，诱导产生急性和慢性炎症性以及慢性退行性关节疼痛。关节疼痛通过诱发性疼痛评分（EPS）和利用先进的动态负重（ADWB）设备测量的自发性疼痛行为进行评估。在本报告中，采用学生t检验进行组间个体比较。对于比较镇痛剂量的实验，方差分析（ANOVA）可能是更合适的统计学比较方法。

EPS（累计打斗次数与发声次数之和）在三种类型的关节疼痛中均有所增加（图1）。与正常小鼠相比，急性及慢性炎症性关节疼痛小鼠在ADWB（双侧后肢负重百分比）测量中，左后肢负重比例均降低。仅在患有慢性退行性关节疼痛（COL）的雌性小鼠中观察到ADWB测量值的类似下降，雄性则无此现象（图2A）。患有急性炎症性关节疼痛的雄性小鼠较正常动物将更多体重转移至前肢。与正常小鼠相比，雌性小鼠在前肢负重比例上有所增加，但在患有慢性退行性关节疼痛（COL）的雄性小鼠中未见此变化（图2B）。与正常小鼠相比，急性及慢性炎症性关节疼痛小鼠在患侧左后肢上所花费时间的百分比（ADWB测量）有所下降，但差异无统计学意义。这些动物在左后肢上所花费的时间显著少于右后肢。在患有慢性退行性关节疼痛的雄性和雌性小鼠中，其左后肢停留时间与正常小鼠相比无显著差异。患有慢性退行性关节疼痛的雌性小鼠在非关节炎性右后肢上停留的时间较正常小鼠更长（图3A）。患有急性炎症性关节疼痛的小鼠以及患有慢性退行性关节疼痛的雌性小鼠在前肢上停留的时间显著长于正常动物（图3B）。

图 1。左（蓝色柱）和右（红色柱）后肢的诱发性疼痛评分（EPS）。 右后肢作为内部对照，未接受任何关节内（IA）注射。测量在以下条件下进行：未注射的正常动物（雄性和雌性）、急性炎症性卡拉胶诱导关节炎（CAR）、慢性炎症性完全弗氏佐剂诱导关节炎（CFA）以及慢性非炎症性胶原酶诱导关节炎（COL，雄性和雌性）。在正常动物中，雄性左后膝的EPS与右后膝相比无统计学差异，雌性中仅存在轻微差异（**P = 0.038），这可能是由于检测顺序带来的交叉疼痛反应所致（即后检测的左膝出现疼痛反应增强）。在所有关节炎组中，患有关节炎的左膝EPS显著高于对侧无关节炎的右膝。当将各关节炎组左膝的EPS与正常动物相比时，所有关节炎组的左膝EPS评分均显著高于正常动物的左膝，该结果在雄性和雌性中均成立。*P < 0.05 与正常雄性比较，#P < 0.05 与正常雌性比较。所有图中的误差线均表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：通过四肢承重百分比测量的自发性疼痛行为。（A）通过左（蓝色柱）和右（红色柱）后肢所承受的总体重百分比来测量自发性疼痛行为。在雄性和雌性未处理动物中，左后肢与右后肢承重百分比之间无显著差异。与未处理组相比，雄性小鼠在由CAR和CFA诱导的关节疼痛模型中，以及雌性小鼠在由COL诱导的关节疼痛模型中，左后肢承重显著减少。*P < 0.05，与雄性未处理组比较；#P < 0.05，与雌性未处理组比较。（B）通过前肢所承受的总体重百分比来测量自发性疼痛行为。在由CAR诱导急性关节疼痛的雄性小鼠和由COL诱导慢性关节疼痛的雌性小鼠中，前肢承重显著增加。该现象在由CFA或COL诱导关节疼痛的雄性小鼠中未观察到。未处理雌性小鼠前肢承重趋势上高于未处理雄性小鼠（P = 0.02）。其他身体部位（如尾巴或臀部）也可能承担部分重量，但通常占比极小，对疼痛反应的理解无显著影响，因此未予展示。*P < 0.05，与雄性未处理组比较；#P < 0.05，与雌性未处理组及雄性4周COL模型前肢负重比较。请点击此处查看此图的放大版本。

图3: 通过肢体所占时间百分比测量的自发性疼痛行为。 (A) 通过计算左右后肢承重所占总时间的百分比来评估自发性疼痛行为（左后肢为蓝色柱，右后肢为红色柱）。在雄性和雌性 naïve 小鼠中，左右后肢承重时间之间无显著差异。在患有 CAR 和 CFA 诱导关节炎的雄性小鼠中，其患肢（左后肢）承重时间较 naïve 小鼠有所减少，但差异未达到统计学显著性，可能与该指标在这些小鼠中变异性增大有关。在这些动物中，右后肢与左后肢相比存在显著差异，右后肢承重总时间明显长于左后肢。在 COL 诱导关节炎的雌性小鼠中，其右后肢承重时间比例高于 naïve 雌性小鼠。*P < 0.05（右侧与左侧比较，#）P < 0.05，与雌性未处理组及雄性4周COL组在前肢站立时间上的比较。B通过前肢负重时间总量测量的自发性疼痛行为。在CAR诱导关节炎的雄性小鼠和COL诱导关节炎的雌性小鼠中，其前肢负重时间显著长于未处理小鼠。未处理雌性小鼠的前肢负重时间长于未处理雄性小鼠。*P < 0.05 与雄性未处理组相比，#P < 0.05，与雌性未处理组相比。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在炎症性关节炎和退行性关节疾病临床前模型中对关节疼痛进行测量，正成为评估新型关节炎疼痛治疗方法及关节功能恢复效果的日益重要的工具^9,10。在患有慢性退行性关节疾病的 小鼠中测量疼痛行为具有挑战性。由于小鼠为四足动物，它们可通过其余三条肢体或尾巴的任意组合来卸载疼痛肢体的负重。单个肢体功能下降的表现可能不如双足行走的人类那样明显。作为被捕食动物，小鼠在进化上具有抑制疼痛行为以利于生存的优势。

本报告表明，使用简单且相对经济的方法即可在小鼠中测量由不同病理机制引起的关节疼痛。炎症性关节疼痛会导致体重负荷时间和分布发生更显著的变化，因此可能是检测镇痛效果更为敏感的模型。然而，在评估新的潜在镇痛药物时，其他类型的关节疼痛模型也具有重要意义，因为不同病理条件下疼痛的启动与维持机制可能不同。我们发现在不同性别之间以及不同关节炎疼痛模型之间，存在负荷转移模式的差异。

需要注意的是，小鼠的疼痛行为可能存在品系和性别的差异^14,15,16。已知不同品系小鼠在疼痛阈值方面存在显著差异。我们发现，在患有慢性退行性关节疼痛的C57/Bl6小鼠中，雌性小鼠表现出明显更多的自发性疼痛行为（前肢负重时间和重量增加）（图2 和 图3）。本研究未测定这些雌性小鼠的动情周期阶段，因此无法判断其对结果是否有影响；但其他研究已表明，动情周期阶段并不能解释C57/Bl6小鼠中观察到的性别差异¹⁷。

诱发性疼痛行为对所有测试类型的关节疼痛均敏感，且具有良好的可重复性。检查者必须经过培训，以施加一致且标准化的触诊压力，并采用一致的固定方法，从而能够检测到疼痛和镇痛反应的完整范围。始终先检查正常膝关节非常重要，以尽量减少因交叉效应导致的正常膝关节疼痛反应，并最大化正常膝关节与疼痛膝关节之间疼痛反应的差异。建议使用第二位观察者记录构成EPS的各项疼痛反应，以便检查者专注于保持触诊的一致性，同时确保对发声和挣扎行为的计数准确且一致。可能需要特别练习固定方法，以确保动物能够充分对疼痛产生反应，但又不会过于敏感而削弱疼痛反应。EPS测量的一个优势在于，其原理类似于对人类患者关节压痛的评估。

我们认为，这些方法优于现有方法，因为它们能够直接测量来自小鼠膝关节的疼痛，可用于不同类型的单关节炎疼痛模型，既包括自发性疼痛反应，也包括诱发性疼痛反应，且相对经济、可靠且可重复。随着更有效的关节炎治疗方法的不断开发，这些方法将有助于确认治疗手段是否真正缓解了关节炎最具致残性的症状——疼痛。

我们的方法存在一些局限性。首先，EPS 测量受限于需要由单一名检查者和观察者完成，并且要求操作技术高度一致。诱发性疼痛的测量方法则更为自动化，不易受到观察者间差异的影响。未来对 EPS 测量的进一步优化可能包括采用自动化方法来记录触诊引起的发声次数，例如使用超声波蝙蝠探测器来计数发声。在该方法得以广泛应用之前，需将其与我们现有的方法进行比较，以验证其敏感性和特异性。

综上所述，我们描述了两种不同的疼痛行为检测方法，用于量化小鼠的关节疼痛。在选择实验模型之前，必须考虑性别和品系差异。诱发性疼痛的检测需要实验人员经过仔细培训并保持操作的一致性。建议同时采用自发性疼痛和诱发性疼痛行为检测来评估疼痛严重程度和功能受限情况，并应利用这两种方法全面评价新型镇痛药物的潜在疗效。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级动态负重装置	Bioseb In Vivo Research Instruments, Vitrolles, France	型号：BIO-DWB-M - 适用于小鼠
C57/Bl6 小鼠（雄性和雌性）	Jackson Labs, Bar Harbor ME	货号： 000664 | Black 6
角叉菜胶	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	22049-5G-F
完全弗氏佐剂	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F5881
触压计	Palpometer Systems, Inc. Victoria, B.C	已不可用 - 公司已停业
IV型胶原酶	Worthington Biomedical Corp, Lakeville, NJ	LS004210