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一种改进的高通量呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验

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DOI：

10.3791/59025

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2019年1月26日

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1Murdoch Children's Research Institute, 2Department of Paediatrics, University of Melbourne, 3School of Chemistry and Molecular Bioscience, University of Queensland, 4London School of Hygiene and Tropical Medicine

本文内容

摘要

本研究描述了一种高通量、 基于成像的微中和试验以测定针对呼吸道合胞病毒（RSV）的中和抗体滴度。该检测方法已在不同类型的样本中进行过验证。

摘要

呼吸道合胞病毒特异性中和抗体（RSV NAbs）是抵抗呼吸道合胞病毒感染的重要保护性标志。目前全球使用多种不同的检测方法，因此亟需一种准确且高通量的RSV NAbs检测方法。本文介绍一种基于成像的微中和检测法，该方法已用于呼吸道合胞病毒A亚群的检测，并可进一步适用于B亚群及不同类型的样本。该方法具有高度可重复性，参考抗血清的批间变异小于10%。我们认为，该检测方法可在全球众多实验室以相对较低的成本快速建立。开发一种改进的高通量RSV NAbs检测方法，对于推动该检测技术的国际标准化，以及未来新型呼吸道合胞病毒疫苗候选物的评估具有重要意义。

引言

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球儿童群体中下呼吸道感染的首要病因1。尽管其疾病负担严重，目前仍无可用的疫苗或治疗方法。自2013年起，世界卫生组织（WHO）已将RSV疫苗的研发列为重大研究优先事项，并每年召开WHO咨询会议2,3。WHO已达成共识，采用RSV中和抗体（NAb）检测来监测疫苗的免疫原性，因为该指标被公认为是保护作用的主要血清学标志4。多项研究及针对抗RSV单克隆抗体帕利珠单抗的临床试验已证实，中和抗体可在一定程度上预防严重的RSV感染，而帕利珠单抗目前是唯一可用的预防策略4。

全球各地的实验室采用多种中和抗体（NAb）检测方法，包括基于细胞的检测和基于分子的检测，这使得标准化工作面临挑战5,6,7,8。然而，传统的斑块减量中和（PRN）试验——通过检测呼吸道合胞病毒（RSV）特异性抗体存在时斑块形成单位（PFU）数量的减少——仍然是金标准9。本文报道了一种经过改进、简化且适用于高通量的PRN检测方案，该方案可用于多种细胞系、不同RSV毒株，并显著提高检测通量。本方案已在来自不同临床环境的样本以及动物模型实验样本中进行了验证。

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方案

注意：除非另有说明，所有步骤均须在生物安全二级（BSL2）生物安全柜中进行。在进行PRN实验前，必须预先测定病毒滴度，以确定PRN实验中使用的最佳呼吸道合胞病毒（RSV）浓度。建议将病毒储备液分装为小体积，每次实验仅解冻一次并用于单次中和抗体（NAb）实验。建议同一研究中所有样本的NAb实验均使用同一批病毒储备液。在向细胞培养板中添加前，务必确保培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）已预热至37 °C。

1. RSV 病毒滴度测定

注意：根据病毒储备液的数量和重复次数，可按照图1设置检测板。每种病毒储备液应在检测板上进行三份重复梯度稀释，起始浓度最高（即1:10）。通常采用1:10的连续梯度稀释法。A549细胞的培养与维持以及呼吸道合胞病毒（RSV）的培养程序采用标准操作流程，本方案中未予包含。

  1. 铺板（第1天）
    1. 将A549细胞重悬于含10%胎牛血清（FCS）和1000 IU青霉素/链霉素（pen/strep）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，浓度为4 × 105/mL。向96孔平底无菌板每孔加入100 μL，每孔含4 × 104个A549细胞。
    2. 将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜（细胞将处于对数生长期）。
      注意：在传代23次后使用新的A549细胞冻存管。建议不要在新细胞冻存管仍处于前三个传代阶段时开始实验。
  2. 病毒感染（第2天）
    1. 病毒系列稀释液的制备
      1. 将一支冷冻保存的呼吸道合胞病毒（RSV）冻存管迅速置于37 °C水浴中，直至几乎完全解冻，立即转移至冰上。对每种待检测的RSV病毒原液准备3个重复孔，初始病毒稀释比例为1:10，每孔加入100 μL稀释后的病毒液，并至少保留一列作为阴性对照。
        注意：图1展示了阴性对照的三个重复。
      2. 在96孔U型底无菌板的A行各孔中，分别加入100 μL 1:10稀释的病毒液，共3个重复。在B至H行各孔中加入不含FCS的DMEM + 1000 IU pen/strep，每孔90 μL。
      3. 通过将10 μL液体从A行转移至B行，在板上进行1:10的系列稀释。用移液器将液体上下吹打5次以混匀，继续进行10倍稀释至H行。最后弃去10 μL，使每孔终体积为90 μL。
        注意：每次稀释必须使用新的枪头。
    2. 将病毒接种至A549细胞
      1. 取出前一天准备的A549细胞培养板。确保96孔板中的A549细胞单层融合度约为80%。轻轻将板倒置，用无菌吸水纸轻压以去除培养基。
      2. 每孔加入100 μL PBS洗涤两次，每次洗涤后轻轻将板倒置并用无菌吸水纸轻压以去除多余PBS。注意避免培养板干燥。
      3. 将病毒滴定板中的病毒稀释液（图1）转移至A549细胞板的对应孔中。在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。孵育1小时后，用移液器小心吸去上清液（避免交叉污染），每孔取出90 μL。
      4. 向每孔加入100 μL含青霉素/链霉素的1× Medium 199（M199，见材料表）+ 1.5%低黏度羧甲基纤维素钠盐（CMC）+ 2% FCS。
        注意：2× M199 + 4% FCS + 2% pen/strep 和 3% CMC溶液需提前配制，并于4 °C保存以备后续使用。使用前确保溶液已在37 °C预热。
        1. 配制2× M199溶液：将1袋M199溶于500 mL蒸馏水中，加入20 mL FCS和10 mL pen/strep（配成2× M199）。使用0.22 μm滤器过滤溶液。
        2. 配制3% CMC溶液：将15 g CMC缓慢加入500 mL蒸馏水中。使用金属搅拌加热器在50 °C下溶解CMC，约需1小时。充分混匀后配成3% CMC溶液，并进行高压灭菌。
          注意：必须将CMC固体加入水中才能溶解；若将水加入干燥的CMC固体中，会形成难以溶解的团块。
        3. 通过将步骤1.2.2.4.2中配制的2× M199与3% CMC按1:1比例混合，配制含pen/strep的1× M199 + 1.5%低黏度CMC + 2% FCS溶液。
      5. 将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育3天。
  3. 检测板显色与分析（第5天）
    1. 固定与显色检测板
      1. 轻轻将板倒置，弃去含pen/strep的M199 + CMC + 2% FCS。缓慢加入200 μL固定液（80%丙酮，20% PBS，-20 °C保存），以避免扰动细胞层。在-20 °C孵育20分钟。
      2. 弃去固定液，用吸水纸轻轻吸干。将板倒置放置10分钟使其干燥。
        注意：从本步骤起，实验可在BSL2生物安全柜外进行。
      3. 在含0.05%吐温20（polysorbate 20）的过滤PBS（PBS-吐温，见材料表）中配制5%脱脂奶粉封闭液。对于一块板，按每孔200 μL、共110孔计算所需封闭液体积：200 μL/孔 × 110孔 = 22 mL（即1.1 mL浓缩奶粉稀释液加入20.9 mL过滤的PBS-吐温中）。此阶段还需配制足够量的封闭液用于一抗和二抗孵育。对于一块板，按每孔50 μL、共110孔计算每种抗体溶液所需体积：50 μL/孔 × 110孔 = 5.5 mL。因此，单块板检测所需的奶粉封闭液总体积为33 mL。
      4. 每孔加入200 μL封闭液，在室温（RT）孵育30分钟。轻轻将板倒置，用吸水纸吸去液体。
      5. 用封闭液将山羊抗RSV抗体（单克隆抗体，一抗）按1:500稀释。每孔加入50 μL一抗溶液，在37 °C孵育1小时。用过滤的PBS-吐温洗涤3次。
      6. 用封闭液将Alexa Fluor标记的驴抗山羊IgG（二抗）按1:5,000稀释。每孔加入50 μL二抗溶液，在37 °C孵育1小时。用过滤的PBS-吐温洗涤5次。
      7. 使用自动斑点读板仪，选择异硫氰酸荧光素（FITC）通道及如图2所示的计数参数读取结果。将板用铝箔包裹后于4 °C保存。检测前使用未使用的96孔培养板进行仪器校准，并输入计数参数。
        注意：如需，可在数日内重新扫描。若后续检测使用相同类型的板，可保存并重复使用本次校准和计数参数。
      8. 检查各孔图像，排除伪影斑块或细胞单层破坏的孔（图3）。排除细胞单层被破坏的孔。
        注意：根据伪影斑块的大小，可能需要对这些孔进行人工计数或从数据分析中剔除。有效结果的判定标准包括：在超过一个重复孔中未检测到细胞单层破坏或伪影斑块，且阴性孔（未加病毒的孔）中未检测到PFU。
    2. 确定病毒浓度
      1. 选择最后两个可清晰计数斑点的稀释度。计算同一稀释度下重复孔的平均斑点数。使用以下公式计算原液样本的病毒滴度（每毫升空斑形成单位，PFU/mL）：
        PFU/mL = 平均空斑数 /（稀释倍数 × 加入孔中的稀释病毒液体积）
        注意：所测定的每种RSV原液浓度现在可用于PRN实验（步骤2）。

2. RSV 中和实验

  1. 铺板（第1天）
    1. 将 A549 细胞重悬于 DMEM + 10% FCS + 1000 IU 青霉素/链霉素中，浓度为 4 x 10⁶ 个细胞/mL5/mL。将含4 × 10⁴个细胞的100 μL细胞悬液接种于96孔平底无菌培养板中，每孔100 μL。4 A459 细胞并置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜2 （细胞将处于对数生长期）。
      注意： 在传代23次后使用新的A549细胞冻存管。不建议使用传代次数少于3次的A549细胞。
  2. 病毒与血清制备（第2天）
    注意： 根据样本类型，在进行中和抗体检测前需对样本进行必要的预处理步骤。建议使用目前可向英国国家生物标准与控制研究所（National Institute for Biological Standards and Controls，NIBSC）申请获取的呼吸道合胞病毒国际标准血清。
    1. 血清稀释液的制备
      1. 解冻人呼吸道合胞病毒参考抗血清（参考血清，REF）及待测血清样本，置于室温下。使用前，在56 °C水浴中将血清样本和参考抗血清加热灭活30分钟。根据板式模板进行稀释图4).
      2. 制备 REF 的 1:100 稀释液。每块检测板至少准备 110 μL 用不含 FCS 的 DMEM + pen/strep 稀释的 REF（例如, 150 μL 总体积中含 1.5 μL REF。在 96 孔 U 型底无菌板的 A12 孔中加入 110 μL 1:100 稀释的 REF。
      3. 向第12列的B12至H12孔中每孔加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素。通过从A行转移55 μL至B行，用移液器将孔内液体上下吹打混匀5次，然后继续依次进行1:2倍比稀释至H行。每步稀释均需使用新的枪头。完成稀释后弃去最后一孔（H行）多余的55 μL培养基，使每孔终体积为55 μL。
      4. 制备血清待测样本的1:100稀释液。由于所有血清样本均进行三复孔检测，每个血清待测样本至少需准备330 μL（110 μL/孔 × 3孔）的稀释后样本。
      5. 将每种稀释后的血清检测样本（1:100稀释；S1 = 血清1，S2 = 血清2，依此类推）各110 μL，分别加入96孔无菌板中的对应孔A1至A9以及E1至E9，依据 图4.
      6. 向所有标记为 X 的孔中加入 55 μL 不含 FCS 的 DMEM + 青霉素/链霉素。按照步骤 2.2.1.3 进行 1:2 系列倍比稀释，直至 D 行（适用于样品 1、2 和 3）。弃去最后 55 μL 培养基，使每孔终体积为 55 μL。同样地，对样品 4、5 和 6 进行 E 至 H 行的 1:2 系列倍比稀释。
        注意： 每次稀释都必须使用新的吸头。
      7. 向第10列和第11列的孔中加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素
    2. 病毒的制备
      1. 将一支冻存的RSV冻存管在37 °C水浴中快速解冻至几乎完全融化，立即置于冰上。

      2. 根据步骤1.3.2测定的RSV分装样品浓度，用不含FCS的DMEM加青霉素/链霉素稀释病毒，制备每孔约200 PFU的稀释度。总体积配制5.5 mL（用于100孔）。
    3. 病毒-血清混合物的制备
      1. 根据板式模板，向第1-9列的所有孔以及第10列和第11列的E-H行孔（阳性对照）中加入55 μL稀释后的病毒图4).
      2. 向第10列和第11列的A至D行各孔中加入55 μL不含FCS的DMEM + 青霉素/链霉素（阴性对照）。将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育1 h。2.
    4. 病毒接种至 A549 细胞
      1. 在孵育期结束前，取出步骤 2.1.1 中准备的 A549 细胞培养板。确保 96 孔板中的 A549 细胞单层汇合度约为 80%。
      2. 轻轻倒置培养板，用无菌吸水纸轻压以弃去培养基。每孔加入100 μL PBS洗涤两次，每次洗涤后轻轻倒置培养板，用无菌吸水纸轻压以去除多余PBS。注意避免培养板干燥。
      3. 将100 μL/孔的病毒-血清混合物根据板模板加入至A549细胞板相应的孔中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时2.
      4. 孵育1小时后，用移液器吸出每孔90 μL，加入100 μL预热的1× M199培养基（含1.5% CMC、2% FCS及青霉素/链霉素）。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育3天。2.
        注意： 确保在将溶液加入培养板前已在37 °C预热。
  3. 开发检测板并进行分析（第5天）
    1. 按照步骤 1.3.1.1 至 1.3.1.8 进行固定和检测板的制备。
    2. 确定50%中和滴度 

      1. 通过计算高于和低于“无血清”对照孔（阳性病毒对照 - 第10列，E-H行）50%值的血清稀释倍数倒数之间的比例距离，确定50%中和滴度。
      2. 计数PFU的数量（即，由血清孔和无血清对照孔中的单个病毒感染产生的斑块）。计算无血清对照孔的PFU平均值，并确定其50%值。
      3. 确定血清稀释度，其空斑数应分别略高于和略低于无血清对照孔空斑数的50%。使用半对数坐标图或电子表格模板，以PFU数量为x轴（线性刻度），血清稀释倍数的倒数为y轴（对数刻度）进行作图。10 绘制一条连接两点的直线，并从该直线读取测试血清样本的50%中和滴度。
        注意： RSV PRN 检测工作表（补充工作表用于确定50%中和滴度。

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结果

在进行PRN实验前，对病毒原液进行从1:10至1:108的系列稀释，以测定其浓度（结果见图5）。根据图5，在1:104和1:105稀释度下可可靠地计数PFU。对同一稀释度下的三个复孔中PFU数量取平均值。由于1:105稀释度下平均斑点数为14，因此该病毒原液的病毒滴度计算如下：

14（斑点平均数）/[10-5（稀释度）× 0.1 mL（接种物体积）] = 1.4 × 107 PFU/mL

采用上述方法，我们已对人源样本中的呼吸道合胞病毒A型（RSV-A）和B型（RSV-B）中和抗体（N...

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讨论

我们开发并优化了一种简单高效的呼吸道合胞病毒（RSV）微量中和实验方法，该方法可轻松适用于大多数实验室。本实验能够通过计算机图像扫描，在细胞水平上检测病毒感染能力以及中和抗体（NAb）对病毒感染的抑制作用。与传统的噬斑检测方法相比，基于成像的平台结合特异性抗体检测系统显著提高了斑点检测的特异性和灵敏度6,7。该方法可用于对感染性较低的RSV毒株进行表征，并可在进行PRN实验前准确量化RSV的浓度。

建议在每项研究中使用同一批次的病毒原液，以尽量减少不同 RSV 病毒原液批次间的差异。该检测的其他重要方面包括病毒接种浓度的一致性、A549 细胞单层的完整性，以及使用相同的计数设置，以确保检测的一致性和准确性。加入平板的病毒量可通过单独的噬斑病毒滴定实验再次验证。然而，监测 PRN 检测中的阳性对照孔也可反映实际的病毒滴度，且值得在不同检测中持续监控。此外，每块板中均应包含参考血清，这是另一项质量控制措施，以确保检测的可重复性。我们的实验未使用近期经验证的 NIBSC ...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢所有参与人员。我们感谢维多利亚州政府运营基础设施支持计划的支持。PVL 是澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）职业发展研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞系
A549ATCCCCL-185由昆士兰大学Keith Chappell博士提供
病毒株
RSV A2ATCCVR-1540批号 60430286
试剂
丙酮Merck1000142511
Alexa-Fluor 驴抗山羊IgG（储存于4 °C）Life TechnologiesA11055
CMC钠盐粉末Sigma-AldrichC5678-500G
DMEM（无血清，3.7 g/L NaHC，P/S）（储存于4 °C）Scientific Services – 组织培养MCRI内部供应
胎牛血清（以50 mL分装储存于-20 °C）InterpathSFBS-F
山羊抗RSV抗体MerckAB1128
人多克隆抗呼吸道合胞病毒（RSV）血清（以45 µL分装储存于-20 °C）BEI ResourcesNR-4022注册后可通过BEI Resources免费订购。该血清属于人抗RSV血清和免疫球蛋白系列（NR-32832）
M199粉末Life Technologies31100035
脱脂奶粉封闭液（储存于4 °C）Australian Biosearch50-82-01
青霉素/链霉素（以6 mL分装储存于-20 °C）Life Technologies15140122
来自Milli-Q分配器的s.d.H2OMerck内部分配
用于培养的无菌1×PBS（储存于4 °C）Scientific Services – 组织培养MCRI内部供应
吐温20聚山梨酯Sigma-Aldrich9005-64-5
通用耗材
锥形Falcon管（50 mL）Invitro TechnologiesFAL352070
滤器单元0.22 μm（500 mL）Thermo FisherNAL5660020
无菌Eppendorf管（1.5 mL）Australia PLAM12400
无菌平底板（96孔带盖）Interpath655180
无菌U型底板（96孔带盖）Interpath650180
5 mL移液管Sigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL移液管Interpath607180
25 mL移液管Sigma-AldrichCLS4251-200EA
移液枪头 1-200 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×96个/包（共960个）Fisher BiotecTF-200-L-R-S
移液枪头 5-20 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×96个/包（共960个）Fisher BiotecTF-20-L-R-S
移液枪头 100-1,000 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×100个/包（共1000个）Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
移液枪头 1-10 µL 透明最大回收率架装预灭菌 10架×100个/包（共1001个）Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
仪器与软件
ELISpot读板系统AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot软件版本5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

参考文献

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