低成本小鼠足迹分析与悬挂箱实验方案在慢性束缚应激中的应用

摘要

由束缚应激后的足迹分析和悬挂箱实验组成的低成本方案，可用于评估小鼠模型的运动障碍。

摘要

步态异常在运动障碍患者中经常被观察到。在用于研究运动障碍的小鼠模型中，步态分析是一种重要的行为学检测方法，用于判断小鼠是否模拟了患者的症状。当小鼠模型中未观察到自发性运动表型时，通常可通过施加应激来诱导运动功能缺陷。因此，结合应激负荷的步态分析可能是评估小鼠模型运动表型的一种敏感方法。然而，研究人员面临需要昂贵设备才能从步态分析中自动获取定量结果的问题。在施加应激方面，人们更倾向于采用无需电击或强制跑步等昂贵装置的简单方法。因此，我们介绍一种简单且低成本的实验方案，包括使用纸张和墨水进行足迹分析、通过悬挂箱实验评估运动功能，以及利用锥形管限制固定来施加标准化的应激负荷。该方案成功检测出了小鼠的运动功能缺陷。

引言

运动障碍是指神经系统功能异常，表现为自主或自动运动过多或过少¹。其中，步态障碍在运动障碍患者中尤为常见^2,3,4。因此，步态分析是验证运动障碍动物模型的一种合适的行为学检测方法。在小鼠中，已有针对自然速度行走⁵以及在跑台控制速度下行走^6,7的自动化步态分析方法。这些分析可自动提供定量的步态数据。另一种检测步态障碍的方法称为足迹分析。该方法通过将墨水涂抹于小鼠足底，使其在纸上行走，随后对留下的足迹进行分析。最初使用凡士林和炭粉来显影足迹⁸，之后改用记录纸上的墨水⁹以及相纸上的显影液¹⁰。目前仍广泛采用一种成本较低且毒性较小的墨水-纸张方法¹¹。与自动化分析方法相比^5,6,7，足迹分析成本更低，对于研究经费有限的研究人员而言，可用于评估小鼠模型中的运动障碍。

悬挂箱试验是一种利用金属丝笼盖¹²和金属网筛¹³的四肢悬挂测试。该箱子是一种顶部带有可绕中心杆旋转的网状盖的装置。除了步态分析外，该试验还可低成本且简便地实施。因此，本方案中我们在足印分析之外，还进行了悬挂箱试验以评估抓握力和平衡能力。

应激可诱发运动障碍的症状^14,15。即使在运动障碍小鼠模型中未观察到自发性运动表型，多种慢性应激仍常可诱导产生运动功能缺陷^16,17,18。限制法是小鼠应激加载的常用方法之一，因为该方法不会对动物造成身体损伤¹⁹，且相较于使用专用设备施加电击或使用跑步机进行强迫跑步等方法，成本更低。通过管状装置进行限制（即将小鼠置于带有通气孔的50 mL锥形管中）比其他方法（如金属网筛限制、肢体固定胶带束缚或纱布包裹动物）更为简便（已有综述²⁰）。本文总结了管状限制后进行足迹分析和悬挂箱实验的操作方案。该方案将有助于我们利用那些无自发性运动表型的运动障碍小鼠模型。

方案

所有动物实验均以人道方式开展。本研究已获日本医科大学机构动物实验委员会批准，并严格遵循日本文部科学省管辖下的学术研究机构动物实验机构规章以及《学术研究机构动物实验及相关活动适当实施的基本指南》。本方案中所用小鼠此前已有描述²¹。

1. 悬挂箱实验

1. 记录每只小鼠的体重。使用记号笔标记尾巴以进行个体区分（例如., 单线、双线和三线。
   注意： 生长曲线被用作评估总体健康的指标²².
2. 将小鼠置于实验室内至少30分钟，再进行行为学测试。设置悬吊箱装置，该装置由一个透明箱体（25 × 25 × 40 cm）组成³）顶部带可旋转网盖（图1网状盖子可沿中央杆旋转，使顶部翻转180度。
3. 将一只小鼠置于网盖中央，小心地将网盖翻转倒置。
4. 测量小鼠从网格盖上的坠落潜伏期（悬挂时间）。
   注意： 若小鼠在5分钟内未落下，则记录潜伏期为5 min。
5. 将小鼠放回其居住笼中。每次测试后，用70%乙醇清洁悬挂箱。

2. 足迹分析

注意：在完成悬箱实验后，进行足迹分析。

1. 设置跑道路线（图2A）。
   1. 将一张白色纸张（29.7 cm × 42 cm × 0.09 mm）纵向裁成三条等宽的纸条。取其中一条（9.9 cm × 42 cm）平铺于桌面上。
   2. 将深色目标箱置于纸张远端。在跑道两侧放置其他箱子（长度与纸张大致相同），并在两侧设置挡板，防止小鼠逃逸。
   3. 将黑色墨水和红色墨水分别倒入两个培养皿（直径35 mm）中。
2. 训练阶段。
   注意：仅在小鼠4周龄时进行训练。
   1. 将小鼠放置在纸张近端（头部朝向目标箱）。让小鼠从近端行走至目标箱。随后从小鼠目标箱中取出。若小鼠在纸张上停止不动，可用手指轻轻推动小鼠使其继续前进至目标箱。
   2. 用拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤以限制前肢活动；然后用拇指指腹与其他手指夹住小鼠背部和尾部，以限制后肢活动。
      注意：若抓握小鼠不充分，可能导致墨水沾染衣物。
   3. 将小鼠前肢底部浸入红色墨水中，后肢底部浸入黑色墨水中。立即将小鼠放回纸张近端（头部朝向目标箱）。让小鼠从近端行走至目标箱。若小鼠中途停止，可用手指轻轻推动其至目标箱。
   4. 从小鼠目标箱中取出小鼠，进入测试阶段。
3. 测试阶段。
   1. 完成训练后，使用一张新裁剪的白色纸张重新设置用于采集足印的跑道路线。
   2. 用拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤以限制前肢活动；然后用拇指指腹与其他手指夹住小鼠背部和尾部，以限制后肢活动。
   3. 将小鼠前肢底部浸入红色墨水中，后肢底部浸入黑色墨水中。立即将小鼠放置在纸张近端。让小鼠从近端行走至目标箱。
      注意：由于小鼠偏好黑暗环境，当其接近深色目标箱时行走会更加稳定。若小鼠在纸张上停止不动，可用手指轻轻推动其至目标箱。若因小鼠停顿导致无法获得可靠的足印数据（详见步骤2.4 足印分析），则需重新进行测试。
   4. 从小鼠目标箱中将小鼠放回其原饲养笼。每次测试结束后，用70%乙醇清洁目标箱。将带有足印的纸张自然风干。
4. 足印分析
   1. 使用直尺从足印纸张上测量每个参数的三个数值（前肢和后肢步长、前肢和后肢步宽、前肢与后肢足印重叠距离，图2B）。
      注意：由于近端和远端的足印常因停顿或奔跑而出现较大变异，应选择步态稳定的足印区域进行测量。通常，足印纸张的中间部分适合用于分析。
      1. 测量步长时，应测量同一部位（如脚垫或脚趾）连续两次足印之间的距离。
      2. 测量前肢步宽时，先在连续的右侧（或左侧）前肢足印之间画一条直线，然后测量左侧（或右侧）前肢足印脚垫到该直线的垂直距离。
      3. 测量后肢步宽时，先在连续的右侧（或左侧）后肢足印之间画一条直线，然后测量左侧（或右侧）后肢足印脚垫到该直线的垂直距离。
      4. 测量重叠距离时，测量左侧（或右侧）前肢与后肢足印脚垫之间的距离。
   2. 对每个个体的三个测量值取平均值，并将各参数的个体平均值用于统计分析。
      1. 对于步长，采用左、右步长个体平均值的均值。
      2. 对于步长不对称性，采用左肢与右肢步长个体平均值之差的绝对值。
      3. 对于其他参数（前肢步宽、后肢步宽和重叠距离）的统计分析，直接使用个体平均值。

3. 制动应激负荷

1. 固定管的制备
   1. 使用方钻在50 ml锥形管（直径30 mm，长度115 mm）上沿刻度线（5、10、15、20、25、30、35、40 mL）及其背面位置共打16个孔（直径约2 mm）（图3）。将锥形管尖端剪去，形成一个直径约5 mm的孔，用于通气。在管盖上打一个直径约4 mm的孔，以便小鼠尾巴穿过。
2. 应激处理
   1. 将小鼠放入实验室内适应环境。
   2. 用拇指和食指捏住小鼠颈背部皮肤，将其头部朝前送入固定管中，尾巴从管盖上的孔中穿出，然后拧紧管盖。
      注意：需限制小鼠前肢活动，因为小鼠会以前肢抵抗进入管内。
   3. 在室温下将小鼠封闭于固定管中持续2小时，之后将其从固定管中取出，并放回原饲养笼。
      注意：固定管经清洗和干燥后可重复使用。

4. 实验时间安排（图4）：

1. 在4周龄当天，对所有小鼠进行悬挂箱实验和足迹分析（详见步骤1. 悬挂箱实验和步骤2. 足迹分析），作为分组为“应激组”和“非应激组”前的基线测量。
   注意：一次实验可使用2-3窝共8-10只小鼠。4周龄时的足迹分析包括训练阶段和测试阶段。
2. 将小鼠随机分为“应激组”和“非应激组”。
   注意：若使用来自多个窝的小鼠，应将同窝仔鼠平均分配至两组中，每组约4-5只。
3. 在两周内对“应激组”施加6次束缚应激（详见步骤3. 施加束缚应激操作）。
   注意：每两周施加6次束缚应激，并在6至12周龄期间进行悬挂箱实验和足迹分析。在进行悬挂箱实验和足迹分析的测试当天，不得施加束缚应激。
4. 在6、8、10和12周龄当天，分别于同一天进行悬挂箱实验和足迹分析的测试阶段。

结果

本方案使用了快速发作性肌张力障碍帕金森综合征小鼠模型——Atp1a3 杂合雄性小鼠（Atp1a3^+/−）及其野生型同窝小鼠。Atp1a3^+/− 小鼠在 4 周龄时前肢和后肢的步幅长度均显著短于野生型小鼠（图 5A 和 图 5B，空心圆和空心方块）。在 8 周龄时，“应激”Atp1a3^+/− 小鼠双侧肢体的步幅长度均显著短于“非应激”Atp1a3^+/− 小鼠（图 5A 和 图 5B，实心与空心圆）。所有组别小鼠在各年龄阶段的双侧肢体步幅长度不对称性均无显著差异（图 5C 和

讨论

足迹分析和悬挂箱实验是评估小鼠运动功能的简单且经济的行为学测试方法。这些测试已成功检测出多种小鼠模型中的神经行为表型。例如，通过足迹分析发现，肌萎缩侧索硬化症小鼠的步长缩短²⁴，共济失调毛细血管扩张症小鼠的非对称步长增加²⁵，亨廷顿病²⁶和肌张力障碍²⁷小鼠的步幅重叠长度增加，以及共济失调^28,29、Angelman综合征³⁰和肌张力障碍³¹小鼠的步宽增宽。此外，在杜氏肌营养不良小鼠模型中观察到其悬挂时间短于对照组小鼠³²。因此，本文所述的两种实验方法均有助于评估小鼠的运动功能障碍。

获得清晰足印的本方案中有一个关键步骤：将小鼠四肢底部...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
悬挂箱	O’hara & Co.	http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
记号笔	ZEBRA	MO-120-MC-BK
目标箱	O’hara & Co.	http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/	平衡木实验装置的附件
箱体	O’hara & Co.	-	跑道侧壁
黑色墨水	Shin-asahi	-
红色墨水	Maruyamakogyo	BC-6
一次性培养皿	Corning	351008	培养皿（直径 35 mm）
Askul Multipaper 超白 J 单色 A3 纸	Askul	701-712	白色纸张（29.7 cm × 42 cm × 0.09 mm）
50 mL 圆锥管	Corning	430829
方凿	KAKURI Corporation	DIY FACTORY (K32-0313)