利用卡尔瓦里亚共同培养和教条法测量骨重塑和再造肿瘤-骨微环境

摘要

骨外植物的外生培养是骨生理学研究的宝贵工具，是骨改和骨病药物的潜在评价。提交的协议描述了从新生小鼠头骨分离的钙瓦里亚的制备和培养及其应用。

摘要

骨骼是由成骨细胞、骨细胞和成骨细胞组成的结缔组织，是一种成矿的细胞外基质，赋予其强度和灵活性，使其能够履行其功能。骨骼不断受到各种刺激，在病理条件下可以放松对骨重塑的调节。为了研究骨生物学和疾病，并评估潜在的治疗药物，有必要开发体外和体内模型。

本稿描述了从新生儿小鼠分离的钙质的解剖过程和培养条件，以研究骨骼形成和骨肿瘤微环境。与体外和体内模型不同，这种前活体模型允许保存组织的三维环境以及骨骼的细胞多样性，同时在规定的条件下进行培养以模拟所需的微环境。因此，可以研究骨重塑及其机制，以及与其他细胞类型的相互作用，如癌细胞和骨骼之间的相互作用。

这里报告的测定使用5-7天大的BALB/C小鼠的钙瓦里。获得的中度钙瓦解是在存在胰岛素、乳腺癌细胞（MDA-MB-231）或乳腺癌细胞培养物的调节介质的情况下培养的。经分析，确定胰岛素诱发新的骨骼形成，而癌细胞及其条件介质诱发骨吸收。钙质模型已成功应用于基础和应用研究，研究骨骼发育和癌症诱发的骨病。总体而言，它是简单、信息丰富、低成本测定的绝佳选择。

引言

骨骼是一种动态的结缔组织，具有多种功能，包括支持肌肉，保护内脏器官和骨髓，储存和释放钙和生长因子^11，2。2为了保持其完整性和功能，骨组织不断进行重塑。一般来说，骨重塑的周期可以分为骨吸收和骨骼形成^1。骨重塑这两个阶段之间的不平衡可能导致骨病理学的发展。此外，乳腺癌等疾病通常影响骨骼完整性;大约70%以上的晚期患者有或将有骨转移。当乳腺癌细胞进入骨骼时，它们影响骨骼代谢，导致过度再吸收（骨质病变）和/或形成（骨质病变^）3。

要了解骨病的生物学，开发新的治疗方法，必须了解骨重塑所涉及的机制。在癌症研究中，研究骨转移过程及其与转移微环境的关系至关重要。1889年，Stephen Paget假设当肿瘤细胞和目标组织之间存在相容性时就会发生转移，并建议转移位点取决于肿瘤对微环境⁴的亲和力。1997年，蒙迪和吉斯引入了"骨转移的恶性循环"的概念，以解释肿瘤细胞如何改变骨微环境以实现其生存和生长，以及骨微环境如何通过提供钙和生长因子^{55、6、76,7}

方案

这些测定中使用的所有小鼠都是从BALB/c小鼠菌株中获得的，不分青红皂白地使用雄性小鼠和雌性小鼠。以前的培养实验也使用其他菌株进行，如FVB、瑞士小鼠、CD-1和CsA小鼠11、12、14。^11,12,14所有小鼠均根据国家卫生研究院（NIH）指南，涉及动物主题的附录Q程序已获得恩塞纳达科学研究和高等教育中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 卡尔瓦里解剖

1. 消毒解剖仪器（例如，1 x 2 牙齿组织钳、直手术剪刀、解剖剪刀、细尖钳、细曲线尖端解剖钳、解剖钳、手术刀）。无菌蒸馏水可用于清洁每次解剖之间的手术工具，无菌 1x PBS 可用于清洁每个下部。
2. 将无菌解剖仪器、水、1x PBS 和执行该程序所需的材料（例如，微移液器、沉淀玻璃、无菌培养皿）放入层压流量罩中。
   注:在无菌条件下执行整个过程。
3. 将 12 mL 无菌 1x PBS 加入两个 10 厘米的培养皿中。
4. 选择小狗并将其放置在引擎盖附近。
   注:从5-7天老小狗中分离到钙瓦里亚。
5. 使用解剖钳仔细挑选和握住鼠标。
6. 用解剖剪刀将鼠标斩首，并将头放在带有PBS的培养皿中。
   注:斩首不适合....

结果

为了评估钙质模型中的骨形成，我们在具有或不含50μg/mL胰岛素的介质中培育了中层钙质。组织部分被制备并染色H&E。在这些条件下，组织学表明，骨骼的结构完整性得以保持，从而能够识别其不同成分（图1）。与对照相比，用胰岛素治疗的钙质比骨组织的数量增加了（图2A）。对血型钙质厚度和骨面积的定量组织形态分析证实，与对照对照相比，胰岛素治疗组织中的两个参数都有显著增加（图2B）。这些数据表明，前活体模型协议对骨骼形成条件进行复制的可行性。

此外，钙质外活体模型可用于重现癌症和骨微环境条件。该协议用于评估乳腺癌细胞MDA-MB-231对鼠钙瓦里亚的影响。为此，钙质骨直接与癌细.......

讨论

在这里，我们描述了计算骨骼形成或吸收以及研究癌细胞与钙质小鼠骨骼相互作用的钙质前活体模型的协议。该技术的关键步骤是钙质的解剖、培养、嵌入和形态学分析。在解剖钙质时，将半部钙质切成梯形至关重要，因为它将有力地促进石蜡加入过程中的方向。在研究癌细胞与钙质的相互作用时，使用未为细胞培养治疗的多孔板来防止癌细胞粘附和生长在塑料上而不是骨头上是很重要的。在组织内含过程中，仔细定向每个中部卡瓦里亚非常重要。它们需要以垂直方式放置，在石蜡块的外侧有下垂边框。骨骼的方向对于获得一致的组织部分和可重复的结果至关重要。同样，在态化分析期间，在计算骨骼重塑时定义特定区域以测量骨骼重塑，对于一致性也至关重要。在这里，我们首先确定了日冕缝合线，然后是拍摄照片和测量的长骨表面。

为了实现标准化并开发所述协议，我们稍微修改了一些既定方法。在解剖中，PBS用于冲洗小鼠头部，而不是培养介质。为了确定对钙化菌产生作用所需的细胞数量，组织用不同数量的乳腺癌细胞孵育。一般来说，5 x 10⁵癌细胞在7天的测定中工作良好。此外，在固定过程中，使用纸巾代替海绵来保护钙化。纸巾在纸里保存.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔细胞培养	康宁	CLS3524
24 孔非组织培养	Falcon	15705-060
2 mL 冻存管	SSI	2341-S0S
抗生素 - 抗真菌	康宁	30-004-CI
BSA	Biowest	P6154-100GR
离心	Eppendorf	22628188	离心机 5810R
盖玻片	康宁	2935-24X50
细胞密封填料	Richard Allen	8310-10
DMSO		D2650-100ML
Dulbecco 改良的 Eagles 培养基，含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠	康宁	10-017-CV
Dulbecco 的 PBS （10X）	宁	20-031-CV
包埋盒	Sigma	Z672122-500EA
EDTA	Golden	26400
包埋工作站	Thermo Scientific	A81000001
Eosin	Golden	60600
乙醇无水	JALMEK	E5325-17P
胎牛血清	Biowest	BIO-S1650-500
过滤器	康宁	CLS431229
镊子和剪刀	LANCETA HG	74165
福尔马林缓冲 10%	Sigma	HT501320
载玻片 25 x 75 毫米	Premiere	9105
Harris's 苏木精	Jalmek	SH025-13
高轮廓刀片	Thermo Scientific	1001259
Histoquinet	Thermo Scientific	813150	STP 120
牛胰腺胰岛素	Sigma	16634
显微镜	蔡司	Axio Scope.A1
切片机	Thermo Scientific	905200	MICROM HM 355S
小鼠食物，18% prot，2018S	Harlan	T.2018S.15
Neubauer	VWR	631-0696
橙色 G	生物基	OB0674-25G
石蜡	副质体	39601006
石蜡切片 浮选槽	电热	MH8517X1
培养皿	康宁	CLS430167
福洛辛 B	Probiotek	166-02072
台盼蓝	Sigma	T8154
胰蛋白酶-EDTA	康宁	25-051-CI
蜡分配器	电热	MH8523BX1
甲苯	金	534056-500ML