需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

6.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/59028

⸱

2020年3月14日

 ,  , 
1Biomedical Innovation Department, Center for Scientific Research and Higher Education at Ensenada

本文内容

摘要

颅骨外植体的ex vivo培养可作为研究骨生理学以及评估药物在骨重塑和骨疾病中潜在作用的有力工具。本方案描述了从小鼠新生颅骨中分离颅骨外植体的制备与培养方法，以及其应用。

摘要

骨是一种结缔组织，由成骨细胞、骨细胞、破骨细胞以及矿化的细胞外基质构成，赋予其强度和柔韧性，使其能够实现相应的生理功能。骨持续暴露于多种刺激因素之下，在病理条件下这些刺激可能导致骨重建过程失调。为了研究骨的生物学特性与骨相关疾病，并评估潜在的治疗药物，有必要建立体外（in vitro）和体内（in vivo）模型。

本论文描述了从新生小鼠分离颅骨并进行培养以研究骨形成及骨肿瘤微环境的解剖过程和培养条件。与体外（in vitro）和体内（in vivo）模型相比，这种离体（ex vivo）模型可在定义明确的培养条件下保留组织的三维结构以及骨组织中细胞类型的多样性，从而模拟所需的微环境。因此，该模型可用于研究骨重塑及其机制，以及不同类型细胞之间的相互作用，例如癌细胞与骨组织之间的相互作用。

本实验采用5至7日龄BALB/C小鼠的颅骨进行检测。将获取的半颅骨在胰岛素、乳腺癌细胞（MDA-MB-231）或乳腺癌细胞培养的条件培养基存在下进行培养。经分析发现，胰岛素可诱导新骨形成，而癌细胞及其条件培养基则诱导骨吸收。颅骨模型已成功应用于基础与应用研究，用于研究骨发育及癌症诱导的骨疾病。总体而言，该模型是一种操作简便、信息丰富且成本较低的优良检测方法。

引言

骨是一种动态的结缔组织，具有多种功能，包括支撑肌肉、保护内脏器官和骨髓，以及储存和释放钙离子与生长因子1,2。为了维持其结构完整性和正常功能，骨组织持续经历着重塑过程。通常而言，骨重塑周期可分为骨吸收和骨形成两个阶段1。这两个阶段之间的失衡可导致骨病理状态的发生。此外，诸如乳腺癌等疾病也常影响骨的完整性；约70%以上的晚期患者已经或将会发生骨转移。当乳腺癌细胞侵入骨骼后，会干扰骨代谢，导致过度的骨吸收（破骨性病灶）和/或骨形成（成骨性病灶）3。

为了理解骨骼疾病的生物学机制并开发新的治疗方法，有必要深入了解参与骨重塑过程的相关机制。在癌症研究中，探究骨转移过程及其与转移微环境的关系至关重要。1889年，Stephen Paget 提出假说，认为转移的发生是由于肿瘤细胞与靶组织之间存在相容性，并指出转移部位取决于肿瘤对微环境的亲和性4。1997年，Mundy 和 Guise 提出了“骨转移恶性循环""的概念，用以解释肿瘤细胞如何改变骨微环境以实现自身的存活与增殖，以及骨微环境如何通过提供钙离子和生长因子来促进肿瘤细胞的生长5,6,7。

为了阐明骨重塑和骨转移过程中涉及的机制，并评估具有潜在治疗价值的分子，有必要开发 体外 和 体内 模型。然而，这些模型目前存在诸多局限性，例如对骨微环境的简化表征及其高昂的成本8,9骨组织外植体的培养 离体 具有保持骨组织三维结构以及骨细胞多样性的优势。此外，可对实验条件进行控制。外植体模型包括跖骨、股骨头、颅盖骨以及下颌骨或小梁骨核心的培养10. 该方法的优势在于 离体 多种模型已在不同的研究中得到证实。2009年，Nordstrand 及其合作者报道了一种基于骨细胞与前列腺癌细胞相互作用的共培养模型的建立。11此外，2012年，Curtin 及其合作者报道了一种三维模型的建立，该模型采用 离体 共培养12此类操作的目的在于 离体 建立模型的目的是尽可能准确地重现骨微环境的条件，以阐明正常或病理性骨重塑过程中涉及的机制，并评估新型治疗药物的疗效。

本实验方案基于Garrett13和Mohammad等14发表的方法。新生小鼠颅骨骨膜培养已被用作实验模型，因其在发育过程中保留了骨组织的三维结构以及包括处于各个分化阶段的骨细胞（即成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、基质细胞），最终可形成成熟的成骨细胞和破骨细胞，同时还保留了矿化基质14。ex vivo模型并不能完全代表骨疾病的病理过程，但可准确测量对骨重建或癌症诱导的骨溶解的影响。

简而言之，本实验方案包括以下步骤：分离5至7日龄小鼠的颅骨，颅骨预培养，颅骨培养应用（例如根据研究目的，在胰岛素、癌细胞或条件培养基存在下进行培养，甚至加入具有治疗潜力的试剂），骨组织固定与颅骨脱钙，组织处理，组织学分析及结果解读。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本实验所用小鼠均来自BALB/c小鼠品系，雄性和雌性小鼠均随机使用。既往培养实验也曾使用其他品系小鼠，如FVB、Swiss小鼠、CD-1和CsA小鼠11,12,14。所有小鼠的饲养均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南附录Q的规定。涉及动物实验的操作均已获得恩塞纳达科学研究与高等教育部中心（CICESE）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 颅骨剥离

  1. 对解剖器械（例如，1 × 2 齿组织镊、直手术剪、解剖剪、细尖镊子、细弯头解剖镊、解剖镊、手术刀）进行灭菌。每次解剖之间可用无菌蒸馏水清洁手术工具，每次清洗半颅骨时可使用无菌 1× PBS。
  2. 将无菌解剖器械、水、1× PBS 以及进行操作所需的材料（例如，微量移液器、沉淀玻璃器皿、无菌培养皿）放入超净工作台中。
    注意：整个操作过程需在无菌条件下进行。
  3. 向两个 10 cm 的培养皿中各加入 12 mL 无菌 1× PBS。
  4. 选取幼鼠并将其放置在超净台附近。
    注意：应从出生后 5–7 天的幼鼠中解剖颅盖骨。
  5. 使用解剖镊小心抓取并固定小鼠。
  6. 用解剖剪将小鼠断头，并将头部放入含有 PBS 的培养皿中。
    注意：断头法不适用于年龄较大的小鼠。若实验必须使用年龄较大的小鼠，应根据动物实验规范调整安乐死方法。
  7. 用 1 × 2 齿组织镊牢固夹住小鼠鼻部区域，去除颅骨表面的皮肤，直至颅盖骨暴露可见。
  8. 在暴露的颅盖骨上辨认颅骨的缝线（即矢状缝、冠状缝和人字缝）。
  9. 用显微剪的尖端在人字缝后方约 2 mm 处刺入，并沿人字缝平行做一直线切口。
  10. 将显微剪尖端插入颅骨后侧，沿人字缝远端向冠状缝方向做一直线切口。以相同方式处理另一侧人字缝。
  11. 再做另一切口（呈 45° 角），连接前囟处切口的末端与已做的切口。
  12. 对另一侧人字缝重复步骤 1.10 和 1.11。
    注意：准确识别缝线对于正确切开、充分包埋及后续数据分析至关重要。
  13. 使用细头镊子取出颅盖骨并置于培养皿中。用手术刀从后囟沿矢状缝经冠状缝至前囟做一直线切口，以获得两个半颅盖骨（hemi-calvarias）。
  14. 用细尖镊子分别夹取每个半颅盖骨，放入盛有 PBS 的新培养皿中。

2. 颅骨膜培养

  1. 在24孔板的每个孔中加入1 mL高糖DMEM培养基，培养基中添加0.1%牛血清白蛋白（BSA）和1%抗生素/抗真菌剂（即青霉素和链霉素）。用精细尖头镊子夹取每一块半颅盖骨，放入孔中。
    注意：将半颅盖骨的凹面朝下放置。
  2. 将半颅盖骨在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  3. 移除每个孔中的培养基，加入1 mL含有待测化合物或其他细胞的条件培养基的新鲜培养基。
    注意：每个处理组至少使用三块半颅盖骨，并设置阴性对照和阳性对照。
  4. 将半颅盖骨继续培养7天，每2–3天更换一次培养基。

3. 与癌细胞共培养

  1. 选择一个癌细胞融合度为80-90%的培养皿，并进行胰蛋白酶消化。消化时，先用PBS洗涤癌细胞一次（每75 cm2培养瓶使用5 mL PBS），随后在含有0.05%胰蛋白酶和0.53 mM EDTA的HBSS溶液中孵育（每75 cm2培养瓶使用2 mL溶液）。
  2. 将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中，在室温（RT）下以800 × g离心5分钟。
  3. 移除并弃去上清液。
  4. 将沉淀重悬于2 mL含有2%胎牛血清（FBS）和1%抗生素/抗真菌剂的DMEM培养基中，计数活细胞。
  5. 将半颅骨分配至各实验组（例如，用于RNA或组织学分析的阴性对照组和共培养组）。
  6. 从半颅骨中移除培养基，并加入1 mL含有2% FBS和1%抗生素/抗真菌剂的DMEM培养基，根据实验需要添加或不添加癌细胞。
    注意：所加细胞数量可能因测试的细胞系而异。对于MDA-MB-231或PC-3等癌细胞，每孔加入500,000个细胞较为合适。
  7. 在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。将每块半颅骨转移至新的孔中，以保留仅黏附于骨组织的癌细胞。
  8. 在37 °C、5% CO2条件下继续孵育7天，每2-3天更换一次培养基。

4. 固定

  1. 裁剪方形的吸水纸以包裹半颅盖组织。
    注意：也可使用活检泡沫垫或用于小活检样本的钢制胶囊。
  2. 使用直头精细镊子从矢状缝处夹取每一块半颅盖组织，置于吸水纸上并包裹好。
  3. 将包裹好的半颅盖组织放入已标记的包埋盒中。
  4. 将包埋盒放入盛有10%磷酸盐缓冲甲醛溶液的容器中。
  5. 在4 °C下固定24小时。

5. 脱钙

  1. 移除福尔马林，加入1× PBS，振荡组织30分钟，以清洗半颅盖骨。
  2. 移除PBS，加入10% EDTA（pH = 8，0.34 M）。
    注意：确保溶液完全覆盖组织。
  3. 在4 °C条件下脱钙48小时。
  4. 弃去EDTA溶液，加入1× PBS冲洗组织。
  5. 将半颅盖骨保存在70%乙醇中，直至进行组织学处理。

6. 组织处理

  1. 用96%乙醇脱水组织，每次60分钟，重复3次，随后用100%乙醇脱水，每次60分钟，重复3次。
  2. 用100%二甲苯替换乙醇，每次60分钟，重复3次。
  3. 将组织盒置于石蜡中孵育，每次60分钟，重复2次。

7. 包埋

  1. 打开包埋盒，小心取出吸水纸，剥去颅盖骨的包裹物。
  2. 小心夹取每一块颅盖骨，并将同一组的半颅盖骨按相同方向叠放整齐。
  3. 在模具中放入一些石蜡。
  4. 用镊子夹取所有半颅盖骨，将其放入模具中，使矢状缝朝下，贴近模具底部。
    注意：包埋时半颅盖骨的方向至关重要，以确保获得一致的组织切片和可重复的结果，因为该方向有助于后续识别颅盖骨的额骨和顶骨，以及冠状缝，从而便于进行定量评估。
  5. 松开镊子，确认半颅盖骨保持原位不动。
  6. 将标记好的包埋盒盖在模具上方，并加入更多石蜡，完全覆盖半颅盖骨。
  7. 将模具移至冷台表面。

8. 切片

  1. 使用切片机修剪矢状缝约 500–600 µm。
  2. 切取 4 µm 厚的切片，并收集所需切片。
  3. 再修剪 300 µm。
  4. 再切取并收集六张 4 µm 厚的切片。
  5. 将组织块进一步修剪 300 µm，并收集更多切片。
  6. 将切片贴附到玻璃显微镜载玻片上。
  7. 在室温下干燥载玻片。

9. 染色

  1. 将切片浸入100%二甲苯中3分钟。
  2. 浸入100%乙醇中1分钟。
  3. 转入96%乙醇中1分钟。
  4. 浸入80%乙醇中1分钟。
  5. 浸入70%乙醇中1分钟。
  6. 用水冲洗3分钟。
  7. 浸入苏木精染液中3分钟。
  8. 用水冲洗至切片清晰。
  9. 浸入饱和碳酸锂溶液中10秒。
  10. 用水冲洗3分钟。
  11. 浸入96%乙醇中1分钟。
  12. 浸入伊红染液中3分钟。
  13. 浸入96%乙醇中1分钟。
  14. 浸入100%乙醇中1分钟。
  15. 浸入100%二甲苯中3分钟。
  16. 在载玻片上加入适量封片介质，并加盖盖玻片。
    注：可结合抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色对苏木精-伊红（H&E）染色进行补充，以评估破骨细胞及骨吸收情况。

10. 定量评估：定义分析区域

  1. 在低倍镜（即 4x）下观察切片，以确定其方向和缝合线位置。
  2. 确定冠状缝的位置，并识别一侧的长骨表面和另一侧的短骨表面。
  3. 在 40x 放大倍数下识别冠状缝，沿长骨表面移动两到三个光学视野，对该区域进行成像以用于分析。
  4. 区分老骨区域与新骨区域。使用伊红 Y 与橙 G 染色时，老骨染色较深，新骨染色较浅。
  5. 使用 Image J 软件中的颜色阈值工具测量老骨和新骨的总骨面积，结果以 µm2 表示。

11. 数据分析

  1. 使用统计软件分析结果。组间显著性差异可通过适当的检验方法确定（例如，此处采用的非参数Mann-Whitney U检验）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了评估颅骨模型中的骨形成情况，我们将半颅骨组织在含有或不含50 µg/mL胰岛素的培养基中进行培养。制备组织切片并进行H&E染色。在这些条件下，组织学结果显示颅骨的结构完整性得以维持，能够清晰识别其不同组成部分（图1）。与对照组相比，经胰岛素处理的颅骨组织中骨组织量有所增加（图2A）。对半颅骨的厚度和骨面积进行定量组织形态学分析，证实与对照组相比，胰岛素处理组的这两个参数均显著增加（图2B）。这些数据表明，该离体（ex vivo）模型方案能够有效重现骨形成条件，具有可行性。

此外，颅骨顶骨 离体 模型可用于模拟癌症及骨微环境条件。本方案用于评估乳腺癌细胞MDA-M...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文描述了一种颅骨ex vivo模型的实验方案，用于评估骨形成或骨吸收，并研究癌细胞与小鼠颅骨之间的相互作用。该技术的关键步骤包括颅骨的解剖、培养、包埋以及组织形态计量学分析。在颅骨解剖过程中，至关重要的是将半颅骨切割成梯形，这将显著有助于后续石蜡包埋时的定位。在研究癌细胞与颅骨相互作用时，应使用未经细胞培养处理的多孔板，以防止癌细胞黏附并生长在塑料表面而非骨组织上。在组织包埋过程中，需仔细调整每块半颅骨的方向，应将其垂直放置，使矢状缘朝向石蜡块的外侧。骨组织的正确定位对于获得一致的组织学切片和可重复的实验结果至关重要。同样，在进行组织形态计量学分析时，为确保一致性，必须在颅骨中明确定义一个特定区域用于测量骨重塑。本文中，我们首先确定冠状缝的位置，然后选定长骨表面作为拍照和测量的区域。

为了实现标准化并建立所述方案，我们对一些既定方法进行了轻微修改。在分离半颅骨时，使用 PBS 冲洗小鼠头部，而非培养基。为了确定对颅骨产生效应所需的细胞数量，将组织与不同数量的乳腺癌细胞共孵育。通常情况下，每 5 × 105 个癌细胞适用于为期 7 天的实验。...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢 Mario Nomura 博士和 Rodolfo Díaz 在组织学方面的帮助，以及 Pierrick Fournier 博士为提高论文质量提出的宝贵意见。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔细胞培养板CorningCLS3524
24孔非组织培养板Falcon15705-060
2 mL 冻存管SSI2341-S0S
抗生素-抗真菌剂Corning30-004-CI
牛血清白蛋白（BSA）BiowestP6154-100GR
离心机Eppendorf22628188Centrifuge 5810R
盖玻片Corning2935-24X50
树脂封片剂（Cytoseal）Richard Allen8310-10
二甲基亚砜（DMSO）D2650-100ML
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），含4.5 g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠Corning10-017-CV
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS，10X）Corning20-031-CV
包埋盒SigmaZ672122-500EA
乙二胺四乙酸（EDTA）Golden26400
组织包埋工作站Thermo ScientificA81000001
伊红Golden60600
无水乙醇JALMEKE5325-17P
胎牛血清BiowestBIO-S1650-500
滤器CorningCLS431229
镊子和剪刀LANCETA HG74165
10%缓冲福尔马林SigmaHT501320
载玻片（25 × 75 mm）Premiere9105
哈里斯苏木精JalmekSH025-13
高轮廓切片刀片Thermo Scientific1001259
组织脱水机（Histoquinet）Thermo Scientific813150STP 120
牛胰岛素Sigma16634
显微镜ZEISSAxio Scope.A1
切片机Thermo Scientific905200MICROM HM 355S
小鼠饲料，18%蛋白，2018SHarlanT.2018S.15
血细胞计数板（Neubauer）VWR631-0696
橙黄GBiobasicOB0674-25G
石蜡Paraplast39601006
石蜡切片漂浮浴ElectrothermalMH8517X1
培养皿CorningCLS430167
焰红BProbiotek166-02072
台盼蓝SigmaT8154
胰蛋白酶-EDTACorning25-051-CI
石蜡分配器ElectrothermalMH8523BX1
二甲苯Golden534056-500ML

参考文献

  1. Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
  2. Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
  3. Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
  4. Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
  5. Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
  6. Mundy, G. R. Mechanisms of bone metastasis. Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).
  7. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
  8. Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
  9. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
  10. Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818(2016).
  11. Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
  12. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
  13. Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
  14. Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

颅骨培养组织形态计量分析离体模型癌细胞共培养胰岛素处理MDA-MB-231细胞组织处理定量分析
利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。