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完全自主的生物大分子晶体表征与数据采集

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DOI：

10.3791/59032

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2019年3月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Structural Biology Group, European Synchrotron Radiation Facility, 2Grenoble Outstation, European Molecular Biology Laboratory

本文内容

摘要

本文介绍了如何利用某些同步辐射光束线提供的自动化筛选和数据采集选项。科研人员将低温冷冻的样品送至同步辐射装置，随后对样品的衍射特性进行筛选，自动采集并处理数据集，在条件允许的情况下完成结构解析——整个过程无需人工干预。

摘要

高亮度X射线束与自动化技术相结合 使得基于同步辐射的生物大分子X射线晶体学（MX）光束线被应用于结构生物学中最具挑战性的项目。然而，大多数设施仍要求科学家亲临现场进行实验操作。最近，新一代专用于全自动表征及采集生物大分子晶体衍射数据的自动化光束线已被开发出来。这些光束线为结构生物学家提供了新工具，可用于筛选初步结晶实验的结果和/或采集大量衍射数据集，而无需用户亲自操控光束线。本文将介绍如何设置自动筛选与数据采集实验，光束线上实验的具体执行过程，所获得数据集的处理方法，以及在条件允许时如何解析生物大分子的晶体结构。

引言

确定特定蛋白质的三维结构在生物学中至关重要。通过这一过程所获得的信息有助于揭示生物功能，以及被研究分子中活性位点和/或结合位点的形状与特异性。在许多情况下，这使得作用机制得以阐明，或在适当情况下推动潜在治疗分子的开发。X射线晶体学（MX）是获取结构信息最常用的技术，但其瓶颈在于确定获得良好衍射晶体的最佳条件。因此，需要在大量不同条件下进行结晶实验，并对这些实验结果进行筛选，以找到最适合用于衍射数据收集的晶体。结晶实验设置的自动化1显然在这一方面提供了帮助。然而，后续步骤（即晶体安装、衍射筛选和衍射数据收集）通常仍需手动完成，耗费大量时间、人力和资源。因此，实现衍射筛选与数据收集的自动化将极大提高时间效率和整体工作效率。

在X射线晶体学（MX）中，衍射筛选和数据收集通常在同步辐射MX光束线上进行，自动化技术已极大地促进了这一过程。然而，在大多数情况下，科学家仍需亲自到场或远程操作实验。最近，新一代完全自动化的MX光束线已被开发出来2。在此类光束线上，用户在实验过程中无需亲临现场，也无需远程参与。这使得科研人员能够将更多时间投入到非重复性任务上，而不必花费整天甚至整夜的时间用于晶体筛选和衍射数据收集。全球首个完全自动化的光束线是位于欧洲同步辐射设施（ESRF）的“大规模自动化样品筛选集成设施”（Massively Automated Sample Selection Integrated Facility, MASSIF-1, ID30A-1）2,3。该设施具有独特的样品环境，其中高容量样品杜瓦瓶与机器人样品更换装置协同工作，后者同时充当光束线的测角仪4,5。MASSIF-1是一条波荡器光束线，配备单光子计数混合像素探测器6，工作波长固定为0.969 Å（12.84 keV），X射线束强度高达2 × 1012 光子/秒。在样品位置处，光束尺寸可在最小10 µm（圆形光束）至最大100 µm × 65 µm（水平×垂直）之间调节。平均而言，该光束线可在24小时内以完全自动化的方式（见下文）处理约120个晶体。光束线的运行基于一系列工作流程7，每个流程均根据前一步骤的结果智能决策，以确保从待测样品中获取最优的数据。特别是对单个样品衍射特性的评估会综合考虑晶体体积和通量，并在晶体尺寸大于X射线束时，确保仅使用晶体中衍射质量最佳的区域进行后续数据收集。因此，所获得的衍射数据集在实现最高分辨率的同时，将辐射损伤降至最低2,3。此外，该系统还支持复杂的数据收集方案，例如针对天然态和单波长反常衍射（SAD）数据收集的伪螺旋式（多位置）数据采集策略8。

在MASSIF-1上进行的完全自动化实验包括：将晶体置于适用于目标光束线设备标准针（SPINE9）的磁性样品架上并进行低温冷却，在集成蛋白质晶体学光束线系统（ISPyB）10（一种用于MX实验的基于网络的信息管理系统）的“衍射计划”表格中输入所需的实验参数，并将样品送至光束线。在ESRF，样品往返光束线的所有运输费用均由ESRF用户办公室承担（详情请参见ESRF网站11）。在MASSIF-1上，对环状支撑的尺寸或晶体质量均无限制。用户在为特定晶体选择衍射计划时，可使用默认设置，也可从多种可针对每个样品定制的具体工作流程中进行选择。系统提供多种预设的工作流程。MXPressE3工作流程中，首先通过光学居中将含样品的环调整至样品位置，随后通过X射线居中确保晶体的最佳区域位于X射线束中心。接着，使用eEDNA（一种用于开发基于插件的应用程序的框架，特别适用于X射线实验中的在线数据分析）计算数据收集策略，并考虑晶体体积及光束线的实时通量。在完成一套完整的衍射数据采集后，系统将通过一系列自动化的数据处理流程12对数据进行处理，结果可在ISPyB中供查看和下载。MXPressE SAD3工作流程专为含有硒代甲硫氨酸的目标蛋白晶体设计，利用了MASSIF-1的工作能量略高于Se K边的特性。在此流程中，MXPressE eEDNA数据收集策略针对SAD数据采集进行了优化（即高冗余度，分辨率设定为Bijvoet对之间的Rmerge低于5%的水平）。若需对一系列晶体的衍射特性进行筛选而无需后续数据收集，可使用MXScore3工作流程，以获得所分析晶体的全面质量评估。在MXPressI3工作流程中，采用0.2°振荡收集180°旋转数据，起始phi角及分辨率由eEDNA策略确定。MXPressO3则在工作流程中引入预设分辨率（默认：dmin = 2 Å）。为初步评估结晶试验所得晶体的质量，系统提供MXPressM3 工作流程。该流程在样品支撑最宽取向上进行高剂量网格扫描，不进行数据收集或居中操作。最近，已实施两种新的实验工作流程——MXPressP 和MXPressP_SAD，可执行伪螺旋式数据采集8。用户可通过ISPyB在线实时跟踪所有工作流程中各步骤的执行情况。

本文展示了如何在MASSIF-1上准备完全自动化的微晶X射线衍射（MX）实验，以及如何检索和分析实验产生的数据。以人线粒体甘氨酸裂解系统H蛋白（GCSH）为例进行说明。该蛋白含有硫辛酸，是负责甘氨酸降解的甘氨酸裂解系统的一部分。该系统还包括P蛋白（一种依赖磷酸吡哆醛的甘氨酸脱羧酶）、T蛋白（一种需要四氢叶酸的酶）和L蛋白（二氢硫辛酰胺脱氢酶）。GCSH负责将甘氨酸的甲胺基团从P蛋白转移至T蛋白。H蛋白的缺陷会导致人类非酮性高甘氨酸血症（NKH）13。

方案

注意：GCSH 的表达、纯化和结晶方法详见补充文件1。

1. 离线样品制备与晶体上样简要说明

  1. 将已固定在SPINE针上的尼龙环或其他晶体挂载支撑物置于一个或多个晶体下方，并从沉淀溶液（20 µL 0.5 M 甲酸钠 pH 4.0 + 25 µL 蛋白质溶液）中提起晶体。
    1. 用滤纸芯接触挂载装置，吸除晶体周围多余的液体，以去除大量残留液。
  2. 将晶体浸入含有沉淀溶液并添加30%甘油的冷冻保护溶液中；随后取出晶体支撑装置及晶体。
    1. 用滤纸芯接触挂载装置，吸除晶体周围多余的液体，以去除大量残留液。
  3. 将挂载装置迅速浸入装有液氮的SPINE样品管中，并与其他类似处理的晶体一同在液氮温度下保存于欧洲分子生物学实验室（EMBL）/欧洲同步辐射装置（ESRF）样品交换托盘9中。
    注意：在此条件下，晶体可保持稳定，直至获得同步辐射机时。

2. 在 MASSIF-1 上申请机时

  1. 尽早通过欧洲同步辐射装置（ESRF）官网（http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying）申请机时。
    注意：ESRF MX 光束线有多种可能的使用方式。实验室可以以集体形式作为“区块分配组”（Block Allocation Group, BAG）申请，获得为期两年的机时分配。若研究团队希望单独申请，可选择滚动式访问（rolling access），在同行评审通过后快速获得光束线使用权限。研究组的提案将由 ESRF 安全小组进行审核并批准，期间可能被要求提供额外信息。若提案获批，将收到实验编号和密码。 proprietary research 可通过购买机时的方式进行。
  2. 在线完成所需的安全培训（http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining）。
  3. 在 MASSIF-1 日历上预订机时。
    注意：每轮班次最多可预订 50 个样品架进行分析。
  4. 填写 A 表格（http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form），申报邮寄实验，并提供待测样品所需的安全信息。

3. 在 ISPyB 中创建衍射计划

注意：衍射计划包含ISPyB中样品所需的所有信息，并可包含额外信息，以针对每个样品定制实验条件。

  1. 打开 ISPyB（网址：https://exi.esrf.fr/）。
  2. 选择 MX 实验。
  3. 使用实验编号和密码登录。
  4. 点击 运输 | 新增，并填写必要信息，然后点击 保存。
  5. 点击 添加包裹，填写所需信息，然后点击 保存。
  6. 接着点击 添加容器，将样品杆条形码作为名称输入，并选择 SPINE 样品杆，然后点击 保存。
  7. 点击容器图标，选择 编辑，并填写有关样品的必要信息，例如蛋白名称、首选工作流程、晶体在样品杆中的位置等。
  8. 选择已通过 ESRF 安全小组批准的蛋白（例如 GCSH 或溶菌酶）。
  9. 输入唯一的样品名称以标识每个单独的样品。可选择性地扫描针座条形码。以下其余信息为可选填写项。
  10. 填写可选信息。
    1. 针对每个单独的样品，在 实验类型 下输入实验类型（例如 MXPressE_SAD、SCORE 或 MXPressO 等，默认为 MXPressE）。这将定义用于处理每颗晶体的自动工作流程。由于 GCSH 晶体呈针状，应选择 MXPressP。
    2. 若已知，请输入空间群（例如 P1、C2 或 P212121）。如提供，该信息将用于数据采集策略计算以及可用的自动数据处理流程。
    3. 输入期望分辨率（默认：dmin = 2.0 Å）。这将决定初始网格扫描、表征以及默认数据采集时的晶体到探测器距离。
    4. 设置期望的阈值分辨率（例如 1.5 Å 或 2.3 Å），以防止对未达到此衍射极限的晶体采集完整数据集。这可以节省数据存储空间和分析时间。
    5. 设置所需的数据完整性（默认值：0.99）和所需的数据冗余度（默认值：4）。如果样品支撑上包含多个晶体，请设置需分析的最大晶体数量。MXPressP 的默认值为 1 或 5。
    6. 选择合适的光束尺寸（默认：50 µm）。若未选择特定数值，X 射线自动定位和数据采集策略计算将使用 50 µm 的光束尺寸。
      注意：在后续任何完整的数据集采集过程中，光束尺寸将自动调整。
    7. 若已知，请在“强制空间群”列中输入空间群。设置晶体的辐射敏感性（0.5–2.0 表示从低到高敏感性，默认值为 1）。
  11. 如需要，可设置完整数据集采集的总旋转角度（默认：由 eEDNA 确定的总旋转角度）。
  12. 保存设置值，点击 返回运输信息，然后点击 发送运输信息至 ESRF。
  13. 打印运输标签并寄送样品。用户应使用 ESRF 的账户信息安排快递取件。
    注意：必须选择 包含回程标签，以确保样品能够顺利返还（参见 https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement）。

4. 数据采集、查看与检索

注意：实验当天，样品将被转移至 MASSIF-1 高容量杜瓦瓶（HCD）。随后，光束线科学家启动数据采集，用户可远程实时查看整个过程。针对每种不同的样品类型，用户将收到电子邮件，通知其数据采集已开始。如前所述，用户可在线实时跟踪所有工作流程中各个步骤的执行情况。 通过 ISPyB，可在其中查看和下载结果。

  1. 针对每个待分析样品，检查 ISPyB（https://exi.esrf.fr/）中的自动实验结果。
    1. 使用实验编号和密码登录，然后点击 ID30A-1 上所需的实验会话。
    2. 选择评分最高的自动处理流程（例如 Grenades 或 XDS_APP），点击 最后采集结果，然后点击 下载，以获取已写入正确空间群、完整性最高且分辨率最高的数据。
      注意：所有网格扫描、线扫描和表征图像均位于每个样品对应的子目录 /MXPressE_01 中。欧洲同步辐射设施（ESRF）会自动运行五个独立的处理程序包，分别为 EDNA_proc12、Grenades12、XDS_APP14、autoPROC15 和 XIA216。数据整合基于 XDS，唯独 XIA2 基于 DIALS。所有程序包均以异常和非异常模式运行，以便在数据中存在异常信号时，可自动检测并用于 SAD 相位分析。各程序包采用不同的参数和决策树，因此某些程序包对特定样品的处理效果更佳。然而，当考虑程序包数量和可能的空间群时，结果数量可能非常庞大。因此，系统会根据分辨率以及其他质量指标（如最低分辨率壳层的 Rmerge、CC(1/2) 和数据完整性）对结果进行大致排序，旨在引导用户选择最优数据集，但仍需仔细检查所有可能的空间群和结果。
  2. 解压下载的文件夹，其中包含所有日志文件、未合并的 XDS_ASCII.HKL 文件以及合并缩放后的 .mtz 文件。
    注意：如果在实验开始时已将目标蛋白或其近源同源蛋白的结构（PDB 格式）上传至 ISPyB，ESRF 的自动处理流程将使用该结构作为搜索模型，对评分最高的解进行分子置换（MR）分析。MR 流程的结果将在 ISPyB 中显示，并可在处理后的数据文件夹中找到（例如 /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_mrpipe_dir/）。在此目录中，最终模型命名为 coot1.pdb，反射数据文件为 sidechains.mtz。请注意，该流程可能会降低晶胞的对称性（原始晶胞约简），以提高获得解的概率。在本例中，MR 流程输出的解为单斜晶系（C2），而非正交晶系（C2221）。有关手动执行分子置换分析的详细步骤（以第二高分的自动处理结果为例）请参见 补充文件。

结果

在ESRF的MASSIF-1光束线上，采用MXPressP工作流程对一系列人源GCSH晶体全自动地进行样品安装、X射线束中的居中定位、表征以及完整衍射数据集的收集。样品安装后，对环状支撑区域进行分析以确定扫描区域（图1，左图）。在完成衍射分析后，晶体内部选定四个点用于数据采集（图1，右图）。随后通过自动化数据分析流程（包括分子置换MR流程）进行处理，获得了高质量的数据集（表1），并成功获得MR相位解。该结果使用户能够快速评估所获得的数据集及所用搜索模型是否适用于分子置换法进行相位确定。此外，还可判断配体的存在情况，从而让用户仅针对最有前景的数据集进行后续分析。通过手动分子置换法进行结构解析，在经历一次自动精修循环后即获得高质量的电子密度图（图2a）。对于该数据集，自动化流程将数据截断至1.32 Å分辨率；然而，用户仍可选择在更低分辨率下截断数据，以获得不同质量统计参数（CC1/2、、Rmeas）的最高分辨率壳层数据。人源GCSH的晶体结构与牛源蛋白（3KlR）相似16。

除N端组氨酸标签外，整个氨基酸链的电子密度连续可见。在区分人与牛GCSH的四个替换位点中，有三个可清晰识别于电子密度图中（Ile/Val66、Asp/Glu98 和 Leu/Phe149；图2b-d）。而Asp/Lys125替换位点的情况较不明确，其侧链电子密度因柔性因素仅部分解析（图1e）。当前获得的模型Rwork和Rfree值分别为20.4%和23.8%，可通过进一步的自动与手动模型构建及精修循环进一步优化。

GRENADES 流程XDS_APP 流程
数据收集与处理
X射线源 / 光束线ESRF / MASSIF-1
波长 (Å)0.966
分辨率 (Å)41.88 – 1.48 (1.53 – 1.48)41.86 - 1.32 (1.39 – 1.32)
总反射数 / 唯一反射数127670 / 28644177332 / 40134
(12178 / 2775)(23772 / 5714)
用于指标化、缩放和合并的空间群C222C2221
晶胞参数
       a, b, c (Å)42.20, 83.75, 95.8542.19, 83.72, 95,82
镶嵌度0.050.05
Rmeas (%)10.0 (110.7)11.1 (198.2)
9.6 (1.3)7.6 (0.7)
CC1/2 (%)99.7 (53.9)99.7 (19.1)
完备性 (%)99.6 (99.6)99.5 (98.6)
多重性4.5 (4.4)4.4 (4.2)
分子置换与初步模型优化
用于相位确定的空间群C2C2221
晶胞参数
       a, b, c (Å)83.74, 42.18, 95.8242.19, 83.72, 95,82
       α, β, γ (°)90, 90.03, 9090, 90, 90
分子置换搜索模型 (PDB)3KLR3KLR
每不对称单元中的蛋白质分子数21
蛋白质残基数250125
首次优化后的 Rwork/Rfree (%)24.3 / 26.520.4 / 23.8
首次优化后的键长 RMSD (Å)0.010.01
首次优化后的键角 RMSD (°)1.21.83
首次优化后的旋转异构体异常值 (%)1.074.29
首次优化后的 Ramachandran 偏好/允许/不允许 (%)95.93 / 4.07 / 095.12 / 4.88 / 0

表1：X射线衍射数据收集、结构精修与验证统计信息。 最高分辨率壳层的数值在括号中给出。

光学衍射、显微图像（A）、衍射信号热图（B）、光子学分析。
图 1：数据采集前的样品分析。（A）扫描选定区域以红框标示。（B）衍射图像的分析以热图形式显示。在定位的晶体内部选择了四个位置用于数据采集。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质电子密度图、模型拟合、结构分析；原子位置示意图。
图 2：精修后获得的电子密度图的可视化验证。 在 2 倍均方根（r.m.s.）水平等高线绘制的电子密度图显示了围绕 (a) Trp143、(b) Val66（人源 GCSH 中为 Ile）和 (c) Glu98（人源 GCSH 中为 Asp）的区域，以及在 1 倍均方根（r.m.s.）水平等高线绘制的围绕 (d) Phe149（人源 GCSH 中为 Leu）和 (e) Lys125（人源 GCSH 中为 Asp）的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

全自动光束线能够在无需科学家在场（无论是在光束线现场或远程）的情况下，对大量大分子晶体进行自动表征和数据采集。与手动操作相比，使用完全自动化的光束线具有诸多优势。例如，基于X射线网格扫描和线扫描的自动样品居中定位比人眼操作更为精确，因为它不受热效应或光学效应的影响。事实上，这些网格扫描和线扫描可提供额外的数据（即晶体的详细尺寸以及衍射效果最佳的区域），这些信息对于确定数据采集时应使用的合适光束尺寸至关重要——尤其是对于小晶体18——并且通常能够提高所获得衍射数据的质量。此外，通过在自动实验设置中利用用户自定义参数，可针对具体研究体系定制特定工作流程中的各个步骤，从而进一步优化实验的成功率。

综上所述，现有工作流程的可靠性、用户对光束线的直接访问（用户可通过日历自行安排实验时间，见上文）以及 MASSIF-1 的全自动化操作，为传统的手动晶体学实验提供了一种严谨、高通量且节省时间的替代方案，并具备将更复杂的实验程序和应用整合到自动工作流程中的潜力。在不久的将来，将引入三维晶体图谱技术19以提高X射线中心定位的准确性，同时更复杂的实验协议（如晶体脱水实验20）也将实现自动化。人们期望完全自主的数据采集最终能成为MX领域的标准方法，为小分子片段筛选提供高质量数据，优化大量衍射能力较差晶体的筛选过程，并自动提供相位信息以从头解析晶体结构。结合晶体自动化 harvesting 技术的发展21，蛋白质晶体结构解析作为一项自动化服务有望成为现实。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢欧洲同步辐射装置（ESRF）提供的光束时间。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
光束线 MASSIF-1ESRF
BL21DE3New England BiolabsC2527I
氯霉素罗斯3886.1
浓缩器：Amicon Ultra-4 Ultracel-30K默克密理博UFC803024
透析膜Spectrumlabs132655
DMSOSigma-AldrichD8418
Dnase罗氏11284932001
DTTEuromedexEU0006-B
无EDTA蛋白酶抑制剂罗氏4,693,159,001
甘油VWR Chemicals Prolabo14388.29T
His-trap HPGE 医疗17-5247-01
咪唑Sigma-Aldrich56750-500G
IPTGEuromedexEU0008-B
LB培养基Sigma-AldrichL3022
硫辛酸Sigma-AldrichT5625
环Hampton ResearchHR8-124
溶菌酶罗氏10 837 059 001
MonoQ 5/50 GLGE 医疗17-5166-01
NaClFisher ChemicalS/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15SONICS
SPINE 载样座MiTeGen货号：M-CSM003-0001A
Tris 碱Euromedex26-128-3094-B
甲酸钠Sigma-Aldrich1064430500
GCSH 纯化缓冲液20 mM TRIS pH 8，200 mM NaCl
GCSH 冷冻保护缓冲液0.25 M 甲酸钠 pH 4，30% 甘油
<强>项目：
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