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一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法

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DOI：

10.3791/59033

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2019年11月12日

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1ACEA Biosciences, Inc, 2ProMab Biotechnologies. Inc, 3ACEA Therapeutics

本文内容

摘要

我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在治疗难治性和复发性血液系统恶性肿瘤（如儿童急性淋巴细胞白血病）方面已取得显著的临床疗效。目前，研究人员正致力于将这一有前景的疗法拓展至实体瘤以及其他血液系统肿瘤。本文描述了靶向在实体瘤和液体肿瘤细胞上特异性或优先表达抗原的高效CAR T细胞的开发与生产过程。随后，采用高灵敏度的基于阻抗的xCELLigence检测技术，实时评估这些CAR T细胞的体外活性。具体而言，本研究考察了不同共刺激信号结构域（如糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（TNFR）相关蛋白（GITR））对CAR T细胞体外活性的影响。本报告包含以下实验方案：利用慢病毒基因转导技术生成用于临床前研究的CAR T细胞、扩增CAR T细胞、验证CAR表达，以及运行和分析xCELLigence活性检测。

引言

近年来，CAR T细胞疗法已成为治疗复发性和难治性造血系统恶性肿瘤的癌症免疫治疗领域中最显著的突破之一。随着美国食品药品监督管理局（FDA）近期批准靶向CD19的CAR T细胞用于急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤，并将靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR T细胞疗法认定为多发性骨髓瘤的突破性疗法，该技术在科学界引起了广泛关注，并推动了全球范围内大量基础、应用及临床研究1,2,3,4,5。截至2019年1月，临床试验数据库（clinicaltrials.gov）中注册的CAR T相关临床试验已超过700项，其中约450项试验即将启动或正处于积极招募患者阶段。大多数临床试验集中于血液系统恶性肿瘤，同时也有大量正在进行的试验探索靶向CD20、CD22及BCMA（除CD19外）的CAR T细胞治疗6,7。尽管多数试验采用自体CAR T细胞疗法，但仍有相当数量的研究正在探索异体CAR T细胞的应用价值8,9,10。尽管在血液系统恶性肿瘤中已取得令人鼓舞的疗效，但由于多种原因，CAR T细胞在实体瘤治疗中的临床应用仍面临更大挑战，这些原因包括但不限于缺乏仅在肿瘤中特异性表达的理想靶点、实体瘤的异质性及肿瘤"逃逸"现象，以及CAR T细胞难以有效进入肿瘤微环境等11,12,13,14,15。目前迫切需要开发能够克服这些疗效障碍并解决"靶向肿瘤但损伤正常组织"毒性的实体瘤特异性CAR T细胞。尽管在CAR T细胞的设计与测试过程中需要多种体外和体内研究方法，但建立一种稳健且具有预测性的体外效价检测方法尤为重要16,17。

为了评估CAR T细胞的效力，已开发出多种体外方法。通常，这些效力检测可根据其是否（i）直接测量CAR T细胞对靶肿瘤细胞的细胞毒活性，或（ii）测量CAR T细胞在杀伤靶细胞过程中释放的细胞因子等替代性标志物，分为两大类。直接测量细胞毒活性的技术包括铬-51释放实验（CRA）18、基于成像的检测方法（利用荧光探针测量靶细胞的凋亡）19,20，以及通过流式细胞术检测凋亡靶细胞的实验方法21。在这些实验中，通常将CAR T细胞与预先标记了放射性或荧光探针的靶细胞共培养，随后进行相应检测。尽管由于其高灵敏度，CRA长期以来被视为该领域的金标准，但仍存在一些缺点：首先，它是一种终点检测，无法提供动力学信息；其次，靶细胞需标记铬-51，而该同位素容易从细胞中渗出，显著增加背景噪声22；最后，该方法需要采取适当的防护措施并妥善处理放射性废物。另一类替代性检测方法通过测量CAR T细胞与靶细胞相互作用产生的副产物来评估其效力，包括利用基于流式细胞术的方法或酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测CAR T细胞释放的多种细胞因子。然而，这些方法同样属于终点检测，仅测量特定时间点细胞因子的累积释放量，因此未必能真实反映CAR T细胞的实际细胞毒活性。

在开发效价检测方法时，特别是用于定义基于细胞的治疗产品（如CAR T细胞）放行标准的检测方法，至关重要的是应尽量减少操作步骤和人工干预时间，因为每一次操作都会引入需要考虑的额外变量，可能降低检测的整体稳健性和一致性。此外，CAR T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用是一个动态过程，获取有关这些动态相互作用的信息（例如细胞溶解速率）对于效价评估具有首要意义。基于上述要求，我们开发了一种无标记、基于动力学的CAR T细胞效价检测方法，并利用xCELLigence实时细胞分析（RTCA）平台实现。xCELLigence平台采用特殊的微孔板（E-Plate），其每个孔底部嵌有金制生物传感器。无论是贴壁生长的实体瘤细胞，还是通过特异性抗体固定的悬浮癌细胞，这些生物传感器均可实时监测CAR T细胞诱导的靶细胞数量、细胞大小、细胞与基质黏附强度以及细胞间相互作用（即屏障功能）的变化17,23,24,25,26,27,28。该实验流程简单，仅需将靶细胞接种至E-Plate孔中，随后以不同的效应细胞与靶细胞比例加入CAR T细胞（图1）。此后，生物传感器将持续监测靶细胞的存活状态，数据将被自动实时显示。

在过去的15年中，xCELLigence检测已被验证可用于评估自然杀伤（NK）细胞、T细胞、CAR-T细胞、检查点抑制剂、双特异性抗体、溶瘤病毒以及某些联合疗法的效力17,29,30,31,32,33,34。最近，xCELLigence效力检测已被用于评估T细胞受体（TCR）工程化T细胞的生产过程35。本文报道了采用RTCA系统评估靶向实体瘤和液体瘤的CAR-T细胞在临床治疗中体外效力的应用。

方案

1. 生成编码CAR的慢病毒

注意：一旦完成特定的CAR T细胞质粒构建（CD47及其他），即可按照标准流程使用293 FT细胞、慢病毒包装混合物和转染试剂（参见材料表）生成慢病毒CAR，具体方法如文献29所述。随后，使用定量反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒和热循环仪（参见材料表），根据制造商说明书通过测定慢病毒RNA含量来确定病毒滴度。所有慢病毒操作必须严格遵守安全规范进行。

  1. 在150 mm培养皿中，将15 × 106个HEK293FT细胞接种于Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
  2. 准备两个15 mL离心管用于转染复合物的配制。第一个管中加入慢病毒载体质粒DNA（5 µg）和慢病毒包装混合物（22.5 µg），溶于2.5 mL转染稀释液中；第二个管中加入82.5 µL转染试剂，溶于2.5 mL转染稀释液中（参见材料表）。
  3. 将第一管中的内容物用移液器转移至第二管中，室温孵育15分钟。
  4. 将混合液逐滴加入HEK293FT细胞培养皿中，于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中继续过夜培养。
  5. 次日，弃去原有培养基，更换为19 mL新鲜DMEM培养基，并在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中继续过夜培养。
  6. 将培养皿中的培养基转移至50 mL离心管中，将含有病毒的培养基管置于冰箱中保存。
  7. 重复上述操作，加入新鲜DMEM培养基，1天后再次收集。
  8. 将两次收集的培养基合并至同一离心管中，在4 °C条件下以2,000 × g离心30分钟。
  9. 将大部分含慢病毒的上清液转移至超净离心管中，保留约1 mL的最小体积上清液，以避免扰动可能含有细胞和/或碎片的沉淀物。
  10. 将上述澄清后的上清液在4 °C条件下以110,000 × g超速离心100分钟。
  11. 小心弃去上清液，轻柔地向离心管底部的病毒沉淀中加入100 µL DMEM培养基，将离心管置于冰上15分钟。轻柔混匀后，将慢病毒溶液分装至预冷的无菌离心管中，将病毒原液储存于-80 °C冰箱中。
  12. 使用定量RT-PCR试剂盒，按照制造商说明书提取并检测慢病毒RNA，以确定慢病毒滴度。

2. CAR T 细胞的制备与扩增

  1. 在1 mL CAR T细胞培养基中激活先前冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs，约1 × 106 至 2 × 106 个细胞），加入等数量的CD3/CD28包被微珠（参见材料表），于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育24小时。
  2. 将一份慢病毒原液置于冰上解冻。
  3. 向含细胞的孔中加入1 µL转导增强剂，并混匀。
  4. 以感染复数（MOI）5:1的比例将慢病毒加入细胞中，轻轻混匀。次日重复此步骤（即首次转导后24小时）。
  5. 每2至3天监测T细胞生长情况，添加新鲜CAR T细胞培养基，使细胞密度维持在1 × 106 至 2 × 106 个细胞/mL。
  6. 使用冻存液（参见材料表）按照标准程序冻存CAR T细胞。
  7. 采用标准方法解冻CAR T细胞，并在进行检测前，于CAR T细胞培养基中预培养约2至4小时，同时加入IL-2（300单位/mL）。

3. 通过流式细胞术检测CAR表达

  1. 将3 × 105个CAR T细胞和非转导T细胞分别转移至两个1.5 mL微量离心管中。
  2. 在300 × g条件下离心2分钟，并用含有1%人血清的荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液将细胞重悬于200 µL中。
  3. 用移液器将100 µL细胞悬液加入两个5 mL聚苯乙烯FACS管中，并将管子置于冰上孵育5分钟。
  4. 向每种细胞类型的其中一管中加入1 µL生物素标记的山羊抗小鼠F(ab')2抗体；向另一种管中加入2 µL PE标记的抗标签抗体（见材料表）。充分混匀后，冰上孵育30分钟。
  5. 每管中加入3 mL FACS缓冲液洗涤细胞，在300 × g条件下离心5分钟；弃去上清液，短暂涡旋或轻轻振荡管子，使细胞在残留液体中重悬。
  6. 向每管中加入2 µL APC标记的抗CD3抗体和2 µL 7-AAD抗体溶液（见材料表）；对于已用抗F(ab')2抗体染色的细胞管，额外加入1 µL PE标记的链霉亲和素。短暂混匀后，继续冰上孵育30分钟。
  7. 按照步骤3.5所述方法，使用FACS缓冲液再次洗涤细胞，并向每管中额外加入200 µL FACS缓冲液。
  8. 通过流式细胞术分析细胞：首先在前向散射光与侧向散射光图中圈选T细胞，然后在CD3与7-AAD图中圈选活细胞（7-AAD阴性）。最后一步是在抗标签、抗ScFv或抗F(ab')2与CD3图中进行分析。

4. 实时细胞溶解效力检测

注意：根据制造商推荐的条件进行RTCA检测。简言之，首先将靶细胞接种于E-板的孔中，次日加入CAR T细胞。CAR T细胞对靶细胞的裂解活性通过实时监测获得。T细胞和模拟转导的T细胞（Mock CAR T细胞）用作阴性效应细胞对照。以下方案描述了针对贴壁肿瘤细胞系的体外实时裂解效力检测方法。

  1. 向 xCELLigence E-Plate 的每个孔中加入 100 µL 目标细胞培养基，将该板放入 xCELLigence 仪器中，获取背景读数。然后将 E-Plate 转移至组织培养罩内，用于接种细胞。
  2. 采用标准方案用胰蛋白酶消化从培养装置中收获目标癌细胞。随后将细胞转移至 15 mL 离心管中，并加入新鲜培养基至 15 mL。在 200 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，加入 5 mL 新鲜培养基，使用血清移液管轻轻重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板和显微镜计数活细胞密度。
  3. 适当调整细胞密度后，向 E-Plate 的每个孔中加入 100 µL 细胞悬液。通常情况下，贴壁细胞系（如 BxPC3、Hela-CD19 和 SKOV3）的目标细胞数约为 10,000 个/孔，悬浮细胞（如 Raji）则为 30,000 个/孔（有关使用抗体预包被孔以固定液体癌细胞的详细信息，请参见下文）。
  4. 将 E-Plate 在室温下平衡 30 分钟，使细胞均匀沉降到孔底（此步骤至关重要，请勿跳过）。
  5. 将 E-Plate 放入细胞培养孵育箱内的 xCELLigence 仪器中，开始自动每 15 分钟测量一次阻抗，以细胞指数（Cell Index）随时间变化的形式显示。
  6. 次日，准备效应 CAR T 细胞。务必提前准备好适当的对照组（例如 Mock CAR T 细胞、未转导的对照 T 细胞和/或无关 CAR T 细胞），以确保所有细胞同时准备就绪。将效应细胞和对照细胞调整至合适的密度，并进行系列稀释，以确保在第 9 步向每孔加入 100 µL 效应细胞悬液时达到所需的效靶比（E:T 比）。
  7. 暂停 xCELLigence 数据采集，将 E-Plate 从孵育箱转移至细胞培养罩内。
  8. 从每个孔中移除 100 µL 培养基。此时每孔中残留的培养基体积为 100 µL。
  9. 向各孔中加入 100 µL 系列稀释的效应 CAR T 细胞或其他对照细胞（例如 Mock CAR T 细胞），以达到所需的效靶比（E:T 比）。
  10. 将 E-Plate 在室温下平衡 30 分钟，使效应细胞沉降，然后将 E-Plate 放回 xCELLigence 仪器中，恢复数据采集。
  11. 如需要，可在关键时间点暂停 xCELLigence 数据采集，并将板取出，以便采集少量样品用于正交检测分析（例如通过 ELISA 或流式细胞术检测细胞因子产生情况）。
  12. 在 EGFR-GITR-CD3 CAR T 细胞实验中，使用 ELISA 试剂盒检测 INFγ 产量（遵循制造商说明书；参见材料表）。
    关于液体肿瘤应用的说明：在检测非贴壁性血液系统癌细胞时，需在接种细胞前先用特异性识别癌细胞表面抗原的抗体包被 E-Plate 的孔。对于 Raji B 细胞系，使用基于抗 CD40 的固定试剂（参见材料表中的液体肿瘤杀伤检测试剂盒）。以下是包被操作步骤：
  13. 用固定缓冲液将固定试剂（抗 CD40）稀释至浓度为 4 µg/mL。
  14. 在组织培养罩内操作，向 E-Plate 的每个孔中加入 50 µL 稀释后的固定试剂。将 E-Plate 置于室温或 37 °C 培养箱中孵育 3 小时。
  15. 移除固定试剂，并用洗涤缓冲液至少洗涤 E-Plate 2 次。此时 E-Plate 即可用于接种 Raji 靶细胞（30,000 个/孔）。
  16. 继续执行上述第 4.1 步，完成后续操作流程。

结果

CAR 慢病毒制备及 CAR T 细胞生成与效力评估
根据制造商说明书，使用定量 RT-PCR 试剂盒（见材料表）测定 CAR 慢病毒制剂的滴度。滴定流程首先提取病毒 RNA，然后测定慢病毒 RNA 拷贝数，以反映感染性病毒颗粒的数量。采用上述方法从一个 150 mm 培养皿中产生的病毒滴度通常在 109–1010 拷贝/mL 之间。图 2A 显示了代表性定量 PCR 结果中 RT-PCR 循环数与信号强度的关系。当病毒质量达标，即滴度高于 1 × 108 pfu/mL 时，即可将其冷冻保存，用于后续 T 细胞转导。CAR T 细胞经慢病毒感染后，继续培养 12–14 天，维持细胞密度在约 1 × 106 至 2 × 106 个细胞/mL。随后，在进行下游应用或冻存前，使用抗 ScFv 特异性抗体通过流式细胞仪检测 CAR T 细胞。一个典型的批次结果如图 2B 所示。使用抗 ScFv 抗体检测，约 50% 的 CAR T 细胞呈阳性染色（Q2 区为 50.6%，对照 T 细胞为 1%），表明约 50% 的 T 细胞表达了 CAR。随后，在每批 CAR T 细胞冻存并准备用于后续实验前，进行 RTCA 效力检测以评估其细胞溶解能力。完成一轮 CAR T 细胞的设计、制备与评估流程约需 1 个月。

CD22-CAR T 细胞对 Raji 淋巴瘤 B 细胞的杀伤作用
使用抗 CD40 液体肿瘤固定试剂盒（见材料表），以 4 µg/mL 的浓度在 37 °C 下包被 E-Plate 3 小时。用固定缓冲液洗涤孔板后，将 B 细胞淋巴瘤细胞以每孔 30,000 个细胞的密度加入 E-Plate 中。让细胞沉降 30 分钟后，将 E-Plate 放回 xCELLigence 仪器中，并立即开始阻抗检测，以监测细胞的贴壁和增殖情况。次日，加入 CD22-CAR T 细胞、Mock CAR T 细胞或未转导的 T 细胞。在图 3中，所有细胞类型的效靶比（E:T）均为 10:1。与阴性对照组（未转导的 T 细胞和 Mock CAR T 细胞）相比，CD22 阳性的 Raji 细胞经 CD22-CAR T 细胞处理后显示出显著的杀伤效应（绿色曲线）。

CD47-CAR T 细胞有效杀伤胰腺癌细胞
CD47 是免疫球蛋白超家族的一种跨膜表面糖蛋白。作为一种与整合素相关的蛋白，它在血液系统肿瘤（如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤）以及实体瘤（如卵巢癌、小细胞肺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤）等多种癌症中均呈高表达36,37。CD47 也被称为巨噬细胞的“别吃我”信号，因此已成为某些癌症潜在的治疗靶点。研究人员制备了 CD47-CAR T 细胞，并在高表达 CD47 的 BxPC3 胰腺癌细胞上进行测试38,39。在第 1 天，将 BxPC3 细胞以每孔 10,000 个细胞的密度接种至 E-Plate 中。实时监测显示，这些细胞在 16 小时后达到汇合状态。此时，以效靶比 10:1 加入 CAR T 细胞（图 4A）。同时加入非转导 T 细胞和 Mock CAR T 细胞作为对照效应细胞。结果明确显示，CD47-CAR T 细胞可选择性杀伤靶向的 BxPC3 细胞29。此外，图 4B 显示，当将 CD47-CAR T 细胞加入空孔时，其阻抗信号显著低于靶向 BxPC3 细胞所产生的阻抗信号。仅含 CD47-CAR T 细胞的孔的细胞指数（Cell Index）值最高仅为 0.14，略高于仅含培养基的信号（0.02）。这表明，在该异源杀伤实验中，阻抗信号几乎完全来源于靶向癌细胞。

由GITR结构域对CAR T细胞的共刺激作用
既往研究报道，在EGFR-GITR-CD3 CAR中表达时，GITR共刺激结构域能够增强对EGFR阳性SKOV3癌细胞的杀伤作用，但对EGFR阴性MCF-7癌细胞无此效应30。为了更明确地阐明GITR结构域的作用，研究人员构建了包含全长GITR结构域、或其缺失突变体及重排变体的CAR，并检测其共激活CAR T细胞的能力（图5A）。xCELLigence检测结果显示（图5B,C），与缺乏GITR结构域的原始CAR构建体相比，含有GITR共刺激结构域的CAR能够更有效地促进CAR T细胞对EGFR阳性靶细胞的杀伤。此外，从GITR结构域中删除10个氨基酸（氨基酸184-193）会完全消除这种刺激活性。相比之下，将GITR结构域在CAR结构中的相对位置进行重排对其刺激功能的影响较小。通过终点检测数据，以IFNγ的产生作为T细胞活化的替代指标，也证实了GITR结构域具有刺激活性（图5B）。与仅提供“快照式”信息的终点数据不同，xCELLigence仪器连续监测的阻抗曲线能够清晰揭示不同处理组间杀伤动力学的细微差异（图5C）。本研究获得的结果与一项体内研究的结果一致30。

细胞增殖分析；微电极；细胞指数；时间曲线图；实验示意图；数据结果。
图 1：xCELLigence 实时细胞分析（RTCA）系统检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用。 测定CAR-T效应细胞对靶肿瘤细胞杀伤活性主要包括三个概念性步骤。步骤1：将靶细胞（即肿瘤细胞）接种至E-板的孔中。细胞附着于金质生物传感器微电极表面，阻碍电极之间的电流流动。该阻抗值被测量并以无量纲参数“细胞指数”（Cell Index）形式绘制成图。随着细胞生长，细胞指数逐渐升高，当细胞接近汇合状态时达到平台期。步骤2：随后加入效应细胞——即非贴壁的免疫细胞。由于这些细胞不附着于金质微电极，因此不会直接引起阻抗变化。步骤3：若效应细胞攻击靶肿瘤细胞，则肿瘤细胞的破坏将表现为细胞指数随时间下降。效应细胞的这种细胞溶解活性，或其杀伤效力，可被灵敏且精确地监测。xCELLigence系统持续采集阻抗数据，从而能够同时对多种实验条件进行实时杀伤动力学分析。请点击此处查看该图的放大版本。

Delta Rn 与循环次数关系图；T 细胞，CD19-CAR-T 流式细胞术；抗体分析；数据图表。
图 2：慢病毒滴度测定及 CAR T 细胞的流式细胞术分析。（A）慢病毒滴度测定。不同颜色的曲线代表循环次数与 delta Rn 的样本示例。较低的循环次数表明样品中存在相对较高量的病毒 RNA 模板。（B）转导后，CAR T 细胞被培养并维持在密度低于 2 x 106 个细胞/mL 的条件下，随后进行流式分析。y 轴反映 T 细胞染色情况，阳性信号显示在 Q1 和 Q2 区域。两个样本的 T 细胞均为 100% 阳性。CAR scFv 的表达通过 scFv 特异性抗体进行检测（x 轴）。结果显示，在 CD22-CAR T 细胞中，超过 50% 的 T 细胞为 scFv 阳性。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞生长动力学曲线图；归一化细胞指数与时间关系；比较研究；折线图。
图3：CD22-CAR T细胞对Raji Burkitt淋巴瘤细胞的杀伤动力学。 红色曲线代表单独培养的Raji细胞，绿色曲线代表经CD22-CAR T细胞处理的Raji细胞。粉红色和蓝色曲线分别代表Mock CAR T细胞处理和非转导T细胞处理。效靶比（E:T）为10:1。误差线表示标准差。时间轴以每2小时为间隔设置，以便于展示，尽管实际数据点更为密集。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞指数与时间关系图；CAR-T细胞对BxPC3的影响；肿瘤细胞相互作用分析；实验。
图4：CD47-CAR T细胞对胰腺实体瘤细胞的杀伤效果。（A）粉色代表仅含靶细胞BxPC3，红色代表BxPC3细胞与CD47-CAR T细胞共培养，绿色代表BxPC3细胞与非转导T细胞共培养，蓝色代表BxPC3细胞与Mock CAR T细胞共培养。效靶比（E:T）为10:1。（B）在相同实验条件下，红色代表仅含CD47-CAR T细胞的空孔（无靶细胞）对照组，绿色代表仅含培养基的对照组。误差线表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

CAR-T细胞工程过程示意图；显示EGFR-GITR效应的细胞毒性和细胞指数图。
图5：GITR结构域增强CAR T细胞对EGFR阳性肿瘤细胞系的细胞毒活性。（A）不同的CAR结构。（B）不同CAR结构在4小时（左）和24小时（中）的细胞裂解百分比柱状图。右侧显示24小时的IFNγ产生量。（C）所有结构的持续杀伤评估。黑色曲线为仅BxPC3卵巢癌细胞的生长曲线，绿色曲线为目标细胞仅用T细胞处理，蓝色曲线为目标细胞用Mock CAR T细胞处理，红色曲线为目标细胞用EGFR-GITR-CD3-CAR T细胞处理，粉红色曲线为目标细胞用EGFR-ΔGITR-CD3-CAR T细胞处理，棕色曲线为目标细胞用EGFR-CD3-GITR-CAR T细胞处理。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

嵌合抗原受体是由胞外单链可变区片段（scFv区）、铰链区、跨膜区以及由TCR信号域和来自CD28、OX40等受体的共刺激域组成的胞内区构成的多结构域蛋白11,40。为了设计出安全、特异且高效的CAR，必须通过体外效力检测，并最终借助动物模型，对CAR设计中的各种组合进行充分测试。在本研究中，我们提供了一套用于实时体外效力检测的实验方案和工作流程，以指导高效CAR的设计。

在设计任何类型的效价检测方法时，特别是用于生产目的，检测方法必须具有高灵敏度、稳健性、一致性，并尽可能接近作用机制16,17,41。本文所述的实时效价检测方法旨在直接测量CAR-T细胞的细胞溶解活性，而非使用细胞因子释放等替代标志物。重要的是，该检测无需任何额外组分，除检测板（E-Plate）和推荐的细胞维持培养基外，无需染料或其他试剂。此外，与基于标记物的其他检测方法相比，该检测具有极高的灵敏度，并能提供高度可重复的数据42,43,44。此外，xCELLigence检测适用于极低的效应细胞与靶细胞比例，非常适合特异性细胞溶解的评估。

为了展示xCELLigence系统的灵活性和实用性，我们重点研究了两种肿瘤类型，即血液系统来源的肿瘤和实体瘤。为了评估靶向CD22的CAR T细胞的杀伤效力，我们使用抗CD40抗体将Raji细胞（即一种B细胞淋巴瘤细胞系）固定在E-Plate上。Raji细胞与E-Plate底部的结合会产生阻抗信号，该信号反映了孔中Raji细胞的存活状态和数量。在加入CD22-CAR T细胞后，Raji细胞以时间和效应细胞依赖的方式被特异性杀伤，最终表现为阻抗信号随时间逐渐下降。阻抗的降低表明Raji细胞发生了细胞溶解或失去活力17。这种利用抗体进行特异性固定的策略可推广至其他液体肿瘤细胞系。另一种替代策略是使用稳定表达肿瘤抗原（如HeLa细胞中表达的CD19）的贴壁癌细胞。该方法的优势在于亲本HeLa细胞易于获得，并可作为特异性检测的阴性对照。此类方法已在CHO-CD22与CHO细胞、CHO-BCMA与CHO细胞的对比实验中得到验证29。通过上述不同策略，可便捷地测试CAR T细胞的设计与功效。xCELLigence检测本身具有高度灵活性，可根据需要调整实验条件，以最大程度地模拟生理状态。

我们在此描述的效价检测方法的一个主要优势在于，它是一种简单的功能性检测，可与基因工程技术结合使用，以高通量方式设计出最优且高效的CAR。正如本研究中针对靶向EGFR阳性癌细胞的CAR T细胞所展示的那样，该检测可用于评估不同CAR结构体或突变体的相对活性。例如，我们发现当GITR结构域位于CD3结构域上游时，其细胞溶解活性显著强于位于CD3结构域下游时的情况。

尽管体外细胞因子释放与体内CAR T细胞活性并不完全相关，但历史上一直将其用作评估CAR T细胞效力的指标。虽然此处所述基于xCELLigence的效力检测方法可用于在生产过程中或临床应用前评估细胞治疗产品，但这些结果与体内疗效的相关性尚未确立。体内疗效取决于多种因素和变量，而这些因素和变量可能无法在体外检测中完全重现。此类变量包括：CAR T细胞向肿瘤部位的归巢能力、CAR T细胞的刺激与活化及其在患者体内的持续存留能力，以及肿瘤微环境的影响。随着进一步优化，xCELLigence检测方法或许能够在体外模拟其中部分复杂过程。

本方案适用于大多数贴壁肿瘤细胞系以及部分悬浮肿瘤细胞系。然而，由于肿瘤类型和阶段的复杂性，临床样本（如原代肿瘤细胞）需要进一步测试和优化。值得注意的是，此处描述的体外效价检测系统仅使用肿瘤细胞系来反映CAR T细胞的潜在活性。人体内真实的肿瘤情况要复杂得多，尤其是当靶向实体瘤时，由于肿瘤微环境的动态变化及其发展过程，体外结果可能无法很好地预测所测试CAR T细胞的临床疗效。

综上所述，本文介绍的基于阻抗的xCELLigence平台能够对细胞杀伤效应进行长期无标记监测，最长可达10天。这种在长时间尺度上持续收集数据的能力使该技术区别于目前常用的其他检测方法——后者通常需要为不同时间点设置多个实验重复，并涉及繁琐的样本操作。此外，效应免疫细胞对信号的干扰极小，从而简化了数据分析过程。该系统软件可自动处理数据，并生成诸如细胞溶解百分率、KT50等有用参数。该技术已展现出高灵敏度（效应细胞与靶细胞比例低至1:20）和宽动态范围（效应细胞与靶细胞比例从20:1到1:20），而这些性能在其他检测方法中难以实现。总体而言，该技术的应用将能够在更高通量的水平上实现更精确的数据分析，从而促进CAR T细胞试剂的开发，显著加快该领域的发展进程。

披露

作者从事CAR T细胞开发及相关效力检测的研究，这些研究分别属于ProMab Biotechnologies和ACEA Biosciences的商业利益范畴。然而，这并不影响作者遵循JoVE促进科学知识传播的宗旨。本出版物的条款已根据相关研究政策，经ProMab Biotechnologies和ACEA Biosciences审核并批准。

致谢

作者感谢ProMab Biotechnologies和ACEA Biosciences为本研究提供了所使用的试剂和仪器。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7-AADBiolegend420404
抗CD40液态肿瘤杀伤检测试剂盒ACEA Biosciences8100005
抗人F(ab')2Jackson Immunoresearch Laboratories109-116-088
APC抗CD3Biolegend317318
检测用RPMI1640培养基Life Technologies Corp11875-093
CAR-T细胞冻存液Cryostor CS10Stemcell Technologies#07930
ProMab提供的CAR-T细胞培养基AIM-V + 300 IFU/ml IL-212055-091
CD3/CD28包被微珠（Dynabeads）Thermo Fisher11131D
DMEMGE Lifesciences.comSH30243.02
FACS缓冲液Promab制备
FBSLonza.com14-503F
HEK293FTThermo FisherR70007
IFNγ ELISA试剂盒Thermo Fisher
慢病毒包装混合物System BiosciencesVP100
Lenti-X 定量RT-PCR滴度测定试剂盒（Clontech）Takara631235
靶细胞用Promab培养基随细胞系而异
实时细胞分析仪ACEA Biosciences
热循环仪Thermo Fisher
转导增强剂，病毒转导增强剂（Alstem）Transplus, AlstemV020
转染稀释液Opti-MEMThermo Fisher
转染试剂NanoFectAlstemNF100

参考文献

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