本方案描述了一种高效合成油酸-铂(II)配合物纳米乳液的方法，该纳米乳液由赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（KYF）三肽稳定。在温和的合成条件下，KYF与该配合物通过自组装形成纳米乳液。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种制备纳米乳液的方法，该纳米乳液由油酸-Pt(II)内核和赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（KYF）包覆层组成（简称KYF-Pt-NE）。KYF-Pt-NE可封装10 wt. %的Pt(II)，粒径为107 ± 27 nm，表面带负电荷。该纳米乳液在水和血清中均稳定，并具有生物活性。将荧光染料与KYF偶联，可制备适用于生物成像的荧光纳米乳液。纳米乳液的合成在水相环境中进行，通过短肽KYF与油酸-铂(II)偶联物的自组装形成KYF-Pt-NE。自组装过程依赖于溶液温度、底物的摩尔比以及底物添加的流速。关键步骤包括：在合成过程中维持最佳搅拌速率，确保自组装有足够的时间完成，以及在离心浓缩仪中逐步对纳米乳液进行预浓缩。
引言
近年来，人们对纳米颗粒在药物递送和生物成像等生物医学领域中的工程化应用兴趣日益增长1,2,3,4。基于纳米颗粒的多功能系统通常需要在一个配方中整合多种组分。基于脂质或聚合物的构建单元在理化性质、生物相容性和生物可降解性方面往往存在差异，这些差异最终可能影响纳米结构的功能1,5,6。生物来源的材料（如蛋白质和多肽）因其序列可调性，长期以来被视为构建多功能纳米结构的有前景的组分7,8。多肽可自组装形成高度有序的超分子结构，如螺旋带状结构9,10、纤维支架11,12等，从而为采用自下而上的方法构建基于生物分子的杂化纳米结构提供了可能
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 油酸-铂(II)缀合物的合成
- 顺铂的活化
- 将50 mg（0.167 mmol）顺铂溶于4 mL水（例如纳米纯水）中，于60 °C下悬浮。
- 在搅拌下，将55.2 mg（0.325 mmol）AgNO3溶于0.5 mL水中，并逐滴加入顺铂溶液中，于60 °C下继续搅拌反应至少2小时。反应过程中会形成白色AgCl沉淀，表明反应正在进行。
- 为判断活化反应是否完成，可用10% HCl检测溶液中是否存在游离的Ag+离子。检测结果应为阴性（无额外AgCl沉淀生成）。
- 将反应混合物在3,220 × g下离心10分钟，去除白色AgCl沉淀。
- 收集上清液，并通过0.2 μm注射器滤膜过滤。通过Pasteur移液管取2–3滴上清液滴加至SnCl2晶体上，检测铂的存在。若锡与铂形成的配位化合物呈现深黄色或橙色，则检测结果为阳性。
- 将含有活化Pt(II)的上清液用于下一步反应。
- 油酸与活化Pt(II)的反应
- 将94.2 mg油酸（0.333 mmol）溶于3 mL水中，于60 °C下悬浮。
- 将13.3 mg（0.333 mmol）NaOH溶于1 mL水中，随后与步骤1.1中所得的活化Pt(II)溶液混合。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
使用本方案制备的 KYF-Pt-NE 的代表性透射电镜（TEM）图像如图 2A所示。KYF-Pt-NE 呈球形形貌，分散性良好，粒径均一。通过三张 TEM 图像直接测量（每张图像至少测量 200 个颗粒）得到的 KYF-Pt-NE 核心直径为 107 ± 27 nm。采用动态光散射（DLS）分析测得 KYF-Pt-NE 的流体动力学直径为 240 nm，多分散系数为 0.156。在三次独立合成样品中测定 KYF-Pt-NE 在水中的 Zeta 电位，其平均值为 -60.1 mV。该电位的高绝对值表明该制剂具有良好的胶体稳定性，其负表面电荷归因于油酸电离产生的 COO- 表面基团。KYF 的等电点为 8.59，因此在中性 pH 条件下带正电荷。
采用荧光标记的 FITC-KYF-Pt-NE 和卵巢癌细胞系，检测了纳米乳剂穿越细胞膜的能力。结果如
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
纳米乳液合成的关键步骤包括调整底物的摩尔比，在油酸–Pt(II) 加入过程中控制温度和流速，提供足够的自组装时间，以及使用离心浓缩柱对产物进行纯化。这些参数会影响 KYF-Pt-NE 的粒径和形貌，因此尤其重要的是保持适当的摩尔比，并正确调整合成条件。
在纳米乳液合成过程中（步骤3），底物的比例对于自组装过程至关重要，并决定了最终产物的尺寸。KYF与油酸-Pt(II)的摩尔比为1:3，KYF三肽在水中的最佳浓度为0.2 mM。此外，在步骤3.1中用于溶解油酸-Pt(II)偶联物的有机溶剂必须能够与水混溶，兼容过滤系统，并且在室温下易于挥发。
其中一个关键步骤是将油酸-Pt(II)缀合物逐滴加入KYF溶液中（步骤3.4）。滴加速率不应低于0.1 mL/min，也不应高于0.2 mL/min，因为非最佳速度可能导致纳米乳液沉淀。此外，应在37 °C下将油酸-Pt(II)缀合物加入KYF溶液中，同时在搅拌板上以600 rpm的速度搅拌混合物。当全部油酸-Pt(II)加入完毕后，应将溶液保持在室温，并将搅拌速度降低至150 rpm。步.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢美国国家癌症研究所提供的资助（项目编号：SC2CA206194）。未声明任何竞争性经济利益。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓 四氟硼酸盐（TBTU） | ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
| 4孔共聚焦培养皿 | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | 用于成像 |
| 6-溴己酸 | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | 肽的点击修饰 |
| A2780 | 由西奈山医院的John Martignetti教授慷慨提供 | 卵巢癌细胞系 | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | 水过滤系统 |
| BUCHI旋转蒸发仪 R-3 | Buchi | Z568090 | 用于溶剂去除和样品干燥 |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | 用于铂配合物分离 |
| 顺式-二氯二氨合铂(II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | 体外测试 |
| CP70 | 由西奈山医院的John Martignetti教授慷慨提供 | 卵巢癌细胞系 | |
| 数字水浴锅 | VWR | 97025-134 | 用于细胞培养基预热 |
| 动态光散射（DLS） | Brookhaven Instrument Corporation | 用于纳米颗粒尺寸测量 | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | 卵巢癌细胞系 |
| Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-苯丙氨酸 4-烷氧基苄醇树脂 (0.382 meq/g) | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-L-酪氨酸(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2培养箱 | Thermo Scientific Fisher | 培养箱 | |
| 高压注射泵 | New Era | 1010-US | 用于纳米颗粒合成中铂配合物的添加 |
| 加热板/搅拌器 | VWR | 12365-382 | 用于样品搅拌和加热 |
| LAMP-1抗体（偶联Alexa Fluor 647） | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | 用于成像 |
| N,N-二异丙基乙胺（DIPEA） | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| 茚三酮 99% | Alfa Aesar | A10409 | 凯撒试验 |
| 油酸 | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | 用于铂配合物合成 |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | 卵巢癌细胞系 |
| PBS | Corning | 21-031-CV | 用于细胞洗涤 |
| Permount封片介质 | Fisher Chemical | SP15-100 | 用于成像 |
| 苯酚 | Fisher Chemical | A92500 | 凯撒试验 |
| 磷钨酸 | Fisher Chemical | A248-25 | 透射电镜负染色 |
| 哌啶 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| 铂原子吸收标准溶液 | Alfa Aesar | 88086 | 1000 µg/mL，用于标准曲线绘制 |
| 丙炔基溴 97% | Alfa Aesar | L10595 | 用于荧光素的炔基修饰 |
| 科学级生物安全柜 | Thermo Scientific Fisher | 1385 | 细胞培养用生物安全罩 |
| 自清洁真空系统 | Welch | 2028 | 旋转蒸发仪用真空泵 |
| 硝酸银 | Acros Organics | 19768-0250 | 顺铂活化 |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | 卵巢癌细胞系 |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | S313-1 | 用于铂配合物合成 |
| 氯化亚锡（II） | Sigma Aldrich | 208256 | 铂存在的检测 |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | 卵巢癌细胞系 |
| 三氟乙酸 99%（TFA） | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| 三异丙基硅烷（TIPS） | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | 用于成像 |
| 荧光素钠粉末 40% | Fisher Scientific | S25328A | 用于荧光素的炔基修饰 |
| Vivaspin 20（10000 MWCO） | Sartorious | VS2001 | 用于纳米颗粒洗涤和浓缩 |
| VWR倒置显微镜 | VWR | 89404-462 | 用于细胞培养监测 |
参考文献
- Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
- Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translat....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
