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方法文章

一种由三肽稳定的油酸纳米乳液

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⸱

DOI：

10.3791/59034

⸱

2019年2月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

本文内容

摘要

本方案描述了一种高效合成油酸-铂(II)配合物纳米乳液的方法，该纳米乳液由赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（KYF）三肽稳定。在温和的合成条件下，KYF与该配合物通过自组装形成纳米乳液。

摘要

我们描述了一种制备纳米乳液的方法，该纳米乳液由油酸-Pt(II)内核和赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸（KYF）包覆层组成（简称KYF-Pt-NE）。KYF-Pt-NE可封装10 wt. %的Pt(II)，粒径为107 ± 27 nm，表面带负电荷。该纳米乳液在水和血清中均稳定，并具有生物活性。将荧光染料与KYF偶联，可制备适用于生物成像的荧光纳米乳液。纳米乳液的合成在水相环境中进行，通过短肽KYF与油酸-铂(II)偶联物的自组装形成KYF-Pt-NE。自组装过程依赖于溶液温度、底物的摩尔比以及底物添加的流速。关键步骤包括：在合成过程中维持最佳搅拌速率，确保自组装有足够的时间完成，以及在离心浓缩仪中逐步对纳米乳液进行预浓缩。

引言

近年来，人们对纳米颗粒在药物递送和生物成像等生物医学领域中的工程化应用兴趣日益增长1,2,3,4。基于纳米颗粒的多功能系统通常需要在一个配方中整合多种组分。基于脂质或聚合物的构建单元在理化性质、生物相容性和生物可降解性方面往往存在差异，这些差异最终可能影响纳米结构的功能1,5,6。生物来源的材料（如蛋白质和多肽）因其序列可调性，长期以来被视为构建多功能纳米结构的有前景的组分7,8。多肽可自组装形成高度有序的超分子结构，如螺旋带状结构9,10、纤维支架11,12等，从而为采用自下而上的方法构建基于生物分子的杂化纳米结构提供了可能13。

多肽已被广泛探索用于医学和生物技术领域，特别是在抗癌治疗14和心血管疾病15方面的应用，以及抗生素开发16,17、代谢紊乱18和感染性疾病19等方面。目前有超过一百种小分子多肽药物正处于临床试验阶段20。多肽易于修饰，且可在低成本下快速合成。此外，它们具有生物可降解性，这极大地促进了其在生物学和药物学中的应用21,22。将多肽用作结构组分的研究包括构建响应性多肽基纳米颗粒和用于可控释放的水凝胶储库23,24,25,26,27、多肽基生物传感器28,29,30,31，以及生物电子器件32,33,34。重要的是，即使是由两个或三个氨基酸残基组成且包含苯丙氨酸的短肽，也被发现能够引导自组装过程35,36,37并形成稳定的乳液38。

基于铂的药物由于具有高效性，被广泛用于多种癌症治疗方案中，可单独使用，也可与其他药物联合使用39,40。铂类化合物通过形成单加合物以及链内或链间交联，诱导DNA损伤。细胞机制可识别Pt-DNA损伤，若未能修复，则导致细胞凋亡。Pt(II)诱导癌细胞死亡的最重要机制是抑制DNA转录41,42。然而，Pt(II)的系统性毒性会引发严重副作用，从而限制了铂类治疗的益处。这导致Pt(II)的临床用药剂量降低43，常常使得到达DNA的铂浓度低于治疗所需水平。因此，随之发生的DNA修复有助于癌细胞存活，并导致Pt(II)耐药性的产生。铂类化疗耐药是抗癌治疗中的主要难题，也是治疗失败的主要原因44,45。

我们开发了一种稳定的纳米系统，可将Pt(II)药物包裹其中，从而在全身循环中提供屏蔽效应，并减少Pt(II)引起的副作用。该系统基于油酸-Pt(II)核心，通过KYF三肽稳定形成纳米乳液（KYF-Pt-NE）46。KYF-Pt-NE的组成成分，包括三肽中的氨基酸和油酸，均被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为“一般认为安全”（GRAS）。KYF-Pt-NE采用纳米沉淀法制备47。简而言之，将油酸-Pt(II)偶联物溶解于有机溶剂中，然后在37 °C下逐滴加入水相KYF溶液中（图1）。溶液搅拌数小时以促进KYF-Pt-NE的自组装。随后使用10 kDa离心浓缩器对纳米乳液进行浓缩，并用水洗涤三次。通过对KYF标记荧光染料，可合成适用于生物医学成像的荧光FITC-KYF-Pt-NE。

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方案

1. 油酸-铂(II)缀合物的合成

  1. 顺铂的活化
    1. 将50 mg（0.167 mmol）顺铂溶于4 mL水（例如纳米纯水）中，于60 °C下悬浮。
    2. 在搅拌下，将55.2 mg（0.325 mmol）AgNO3溶于0.5 mL水中，并逐滴加入顺铂溶液中，于60 °C下继续搅拌反应至少2小时。反应过程中会形成白色AgCl沉淀，表明反应正在进行。
    3. 为判断活化反应是否完成，可用10% HCl检测溶液中是否存在游离的Ag+离子。检测结果应为阴性（无额外AgCl沉淀生成）。
    4. 将反应混合物在3,220 × g下离心10分钟，去除白色AgCl沉淀。
    5. 收集上清液，并通过0.2 μm注射器滤膜过滤。通过Pasteur移液管取2–3滴上清液滴加至SnCl2晶体上，检测铂的存在。若锡与铂形成的配位化合物呈现深黄色或橙色，则检测结果为阳性。
    6. 将含有活化Pt(II)的上清液用于下一步反应。
  2. 油酸与活化Pt(II)的反应
    1. 将94.2 mg油酸（0.333 mmol）溶于3 mL水中，于60 °C下悬浮。
    2. 将13.3 mg（0.333 mmol）NaOH溶于1 mL水中，随后与步骤1.1中所得的活化Pt(II)溶液混合。
    3. 于60 °C下搅拌反应2小时，随后在室温下继续搅拌过夜。粗产物为棕黄色油状沉淀。
    4. 将反应混合物在3,220 × g下离心10分钟，弃去上清液。在25 °C下使用旋转蒸发仪干燥粗产物。通过多次乙腈洗涤纯化产物。纯化的油酸–Pt(II)偶联物最终呈淡黄色。

2. KYF-Pt-NE 的合成及 FITC 标记的纳米乳液 FITC-KYF-Pt-NE

  1. KYF三肽及荧光标记三肽FITC-KYF的合成
    1. 使用标准固相肽化学方法合成 KYF。每个氨基酸的偶联采用以下标准条件：Wang 树脂（2.19 mmol）、Fmoc 保护的氨基酸（4.38 mmol）、2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐（TBTU）（4.38 mmol）和二异丙基乙胺（DIPEA）（8.76 mmol）。将氨基酸与 TBTU 溶于二甲基甲酰胺（DMF）和 DIPEA 中。
    2. 将5.7 g Fmoc-L-Phe 4-烷氧基苄醇树脂（0.382 meq/g）溶于25 mL DMF中，浸泡1小时后使用。
    3. 用15 mL 20%哌啶/DMF溶液脱除L-苯丙氨酸氨基酸的氨基保护基，反应5 min，弃去溶剂，再用相同溶液洗涤一次，反应20 min。
    4. 用以下溶剂依次洗涤树脂，每次洗涤1分钟：DMF、异丙醇（IPA）、DMF、IPA、DMF、IPA、DMF、DMF。每次洗涤后弃去溶剂。
    5. 进行凯氏试验以检测游离氨基的存在2 若树脂上的基团检测为阳性（树脂珠呈紫色），则加入Fmoc-L-酪氨酸氨基酸，并过夜进行偶联反应。
      1. 在不同的瓶子中分别配制Kaiser测试溶液。
      2. 将5 g 茚三酮溶解于100 mL 乙醇中。
      3. 将80 g苯酚溶解于20 mL乙醇中。
      4. 将 2 mL 0.001 M 的氰化钾水溶液与
        98 mL 吡啶。
      5. 向样品中加入2-3滴每种凯撒试验试剂，在沸水中加热5分钟。
    6. 第二步氨基酸成功偶联后，进行凯撒试验，若结果为阴性，则继续进行脱保护操作（步骤2.1.3至2.1.5）。随后使用Fmoc-苯丙氨酸氨基酸重复上述过程。
      1. 所有氨基酸偶联完成后，依次用5 mL DMF、异丙醇、DMF、甲醇、二氯甲烷和乙醚各洗涤树脂1分钟，每次洗涤后弃去溶剂。保留树脂用于后续操作。
      2. 使用一半的树脂进行后续步骤（2.1.7–2.1.9），以将FITC修饰到肽上。若要获得未修饰的KYF三肽，请从2.1.10步骤开始进行操作。
    7. 修饰 KYF 的 N 末端氨基酸为 KYF-N3 用6-叠氮己酸。具体操作如下：将1 g（0.382 mmol）KYF Wang树脂、120.1 mg（0.764 mmol）6-azidohexanoic acid、245.2 mg（0.764 mmol）TBTU和197.1 mg（1.528 mmol）DIPEA溶于30 mL DMF中，混合均匀。室温下搅拌反应过夜。
    8. 通过 KYF-N 的合成获得 KYF-FITC3 通过点击反应与丙炔基荧光素连接。为此，将253 mg（0.097 mmol）的KYF-N混合3 将3.78 mg（0.019 mmol）CuI固体、71.9 mg（0.193 mmol）丙炔基荧光素和2.24 mg（0.017 mmol）DIPEA加入Wang树脂中。反应液颜色应由绿色变为棕色。
    9. 24小时后，依次用5 mL DMF和异丙醇交替洗涤树脂5次，甲醇和水洗涤3次，DMF和水洗涤3次，二氯甲烷和乙醚洗涤3次，每次洗涤后弃去溶剂。
    10. 用三氟乙酸（TFA）/三异丙基硅烷（TIPS）/H 的混合溶液从树脂上切割 KYF-FITC 或 KYF 肽2O₂ 以 95/2.5/2.5 的比例持续 3 小时。
    11. 将粗肽在冷的乙醚中沉淀，用冷乙醚洗涤三次，然后在真空下干燥。
  2. FITC-KYF稳定化含Pt(II)纳米乳剂（FITC-KYF-Pt-NE）与KYF-Pt-NE的合成
    1. 将10 mg（0.0126 mmol）油酸–Pt(II)偶联物溶解于1.5 mL异丙醇中，并转移至5 mL注射器中。
    2. 将装有油酸-Pt(II)缀合物的注射器放入注射泵中，并将流速设定为0.1 mL/min。
    3. 为合成 FITC-KYF-Pt-NE，将 1 mg（0.00105 mmol）FITC-KYF 和 1 mg（0.00219 mmol）KYF（FITC-KYF 与 KYF 的摩尔比为 1:2）溶解于 20 mL 水中，并将溶液温度调节至 37 °C。用铝箔包裹容器壁，以避免 FITC 荧光团发生光漂白。为合成 KYF-Pt-NE，将 2 mg（0.0044 mmol）KYF 三肽溶解于 20 mL 水中，并将溶液温度调节至 37 °C。
    4. 将油酸-Pt(II) 缀合物逐滴加入 FITC-KYF/KYF 或 KYF 三肽溶液中。此步骤需在通风橱内进行。
    5. 在室温下搅拌溶液过夜，以蒸发有机溶剂，并促进FITC-KYF-Pt-NE或KYF-Pt-NE的自组装。
    6. 使用离心浓缩器（10k MWCO）浓缩FITC-KYF-Pt-NE或KYF-Pt-NE，并用4 mL超纯水洗涤三次。
    7. 将 KYF-Pt-NE 和 FITC-KYF-Pt-NE 的水溶液于 4 °C 保存。
    8. 使用原子吸收光谱法（AAS）按照制造商说明书分析铂含量48.
      1. 在10% HCl溶液中配制铂标准品，用于绘制校准曲线（原子吸收光谱法的有效检测范围为100至1,200 ppb（十亿分之一））。
      2. 将步骤2.2中获得的50 µL KYF-Pt-NE溶液溶解于100 µL王水（浓盐酸与浓硝酸按3:1比例混合）中，室温下静置过夜。加入850 µL水，使样品终体积达到1 mL。使用原子吸收光谱法（AAS）分析样品。所有待分析样品的终酸浓度应为10%。
      3. 记录铂（Pt）浓度的ppb读数，并计算样品中铂的最终含量（需考虑样品稀释倍数和纳米乳剂的初始体积）。

3. FITC-KYF-Pt-NE 细胞摄取的共聚焦成像

  1. 将6种卵巢癌细胞系（A2780、CP70、SKOV3、OV90、TOV21G和ES2）以每孔4.7 × 104个细胞的密度接种于4孔共聚焦培养皿中，并在37 °C条件下预培养过夜。
  2. 24小时后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，并在细胞培养基中加入FITC-KYF-Pt-NE（具体细胞系信息见步骤6.1），于37 °C孵育15分钟。
  3. 孵育结束后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞三次。
  4. 用预冷的甲醇在-20 °C固定细胞5分钟，随后用1 mL PBS洗涤三次。
  5. 用1 mL 0.1% Triton-X在室温下对细胞进行通透处理10分钟，再用1 mL PBS洗涤三次。
  6. 在室温下用1:50稀释于PBS中的Alexa Fluor 647标记的LAMP1抗体（1 mL）孵育细胞90分钟，随后用PBS洗涤三次。
  7. 将DAPI储存液（1 mg/mL）用PBS稀释至1 μg/mL，然后向每个孔中加入1 mL稀释后的溶液，在室温下孵育15分钟，再用PBS洗涤细胞三次。
  8. 使用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。
  9. 使用活细胞共聚焦显微镜对细胞成像，激发波长分别为405 nm、488 nm和633 nm。检测参数设置如下：激光功率为0.2%至不超过1%，Pinhole为1 Airy单位，增益主值为650–750，数字偏移为0。
  10. 在图像分析软件中打开图像，在图像下方选择图形，然后选择插入比例尺，将比例尺添加至图像中。

4. 药物释放研究

  1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行药物释放研究。将三种PBS缓冲液的pH值分别调节至7.4、6.8和5.0。
  2. 取5 μL KYF-Pt-NE溶于180 μL相应pH值的PBS缓冲液中，转移至3.5 kDa截留分子量的微型透析杯中，并在37 °C的PBS中孵育。
  3. 在2、4、6、24、48和140小时时，分别从三个微型透析管中取出缓冲液，采用原子吸收光谱法（AAS）测定铂浓度。所有样品均按步骤2.2.8进行制备，但将样品最终体积调整为500 µL。

5. 细胞培养方法

  1. 在添加了10%（A2780、CP70、SKOV-3、ES-2）或15%（TOV-21G、OV-90）胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的细胞培养基（DMEM）中培养A2780、CP70、SKOV-3、OV-90、TOV-21G、ES-2细胞系。所有细胞均在37 °C、5% CO2、水饱和环境条件下培养。
  2. 将3 × 105个细胞接种至每块96孔板中，于体外孵育实验前过夜预培养。用纯水配制KYF-Pt-NE、顺铂和卡铂溶液，并调节KYF-Pt-NE中Pt(II)的浓度，使其与各细胞系所用卡铂和顺铂的浓度一致。在37 °C下孵育72小时。
  3. 孵育结束后，采用比色法（MTT细胞增殖检测试剂盒）评估细胞活力。简要步骤：吸除培养基，向各孔加入110 μL含10% MTT的培养基，37 °C孵育2小时；随后向每孔加入100 μL裂解液，37 °C继续孵育5小时。
  4. 使用酶标仪在570 nm波长处检测吸光度。采用Z检验和P检验进行统计学分析。

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结果

使用本方案制备的 KYF-Pt-NE 的代表性透射电镜（TEM）图像如图 2A所示。KYF-Pt-NE 呈球形形貌，分散性良好，粒径均一。通过三张 TEM 图像直接测量（每张图像至少测量 200 个颗粒）得到的 KYF-Pt-NE 核心直径为 107 ± 27 nm。采用动态光散射（DLS）分析测得 KYF-Pt-NE 的流体动力学直径为 240 nm，多分散系数为 0.156。在三次独立合成样品中测定 KYF-Pt-NE 在水中的 Zeta 电位，其平均值为 -60.1 mV。该电位的高绝对值表明该制剂具有良好的胶体稳定性，其负表面电荷归因于油酸电离产生的 COO- 表面基团。KYF 的等电点为 8.59，因此在中性 pH 条件下带正电荷。

采用荧光标记的 FITC-KYF-Pt-NE 和卵巢癌细胞系，检测了纳米乳剂穿越细胞膜的能力。结果如

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讨论

纳米乳液合成的关键步骤包括调整底物的摩尔比，在油酸–Pt(II) 加入过程中控制温度和流速，提供足够的自组装时间，以及使用离心浓缩柱对产物进行纯化。这些参数会影响 KYF-Pt-NE 的粒径和形貌，因此尤其重要的是保持适当的摩尔比，并正确调整合成条件。

在纳米乳液合成过程中（步骤3），底物的比例对于自组装过程至关重要，并决定了最终产物的尺寸。KYF与油酸-Pt(II)的摩尔比为1:3，KYF三肽在水中的最佳浓度为0.2 mM。此外，在步骤3.1中用于溶解油酸-Pt(II)偶联物的有机溶剂必须能够与水混溶，兼容过滤系统，并且在室温下易于挥发。

其中一个关键步骤是将油酸-Pt(II)缀合物逐滴加入KYF溶液中（步骤3.4）。滴加速率不应低于0.1 mL/min，也不应高于0.2 mL/min，因为非最佳速度可能导致纳米乳液沉淀。此外，应在37 °C下将油酸-Pt(II)缀合物加入KYF溶液中，同时在搅拌板上以600 rpm的速度搅拌混合物。当全部油酸-Pt(II)加入完毕后，应将溶液保持在室温，并将搅拌速度降低至150 rpm。步...

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披露

作者无利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢美国国家癌症研究所提供的资助（项目编号：SC2CA206194）。未声明任何竞争性经济利益。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓
四氟硼酸盐（TBTU）		ANASPEC INC.:AS-20376SPPS
4孔共聚焦培养皿Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526用于成像
6-溴己酸Chem-Impex INT’L INC.24477肽的点击修饰
A2780由西奈山医院的John Martignetti教授慷慨提供卵巢癌细胞系
Barnstead NanopureThermo FisherD11901水过滤系统
BUCHI旋转蒸发仪 R-3BuchiZ568090用于溶剂去除和样品干燥
Centrifuge 5810 Reppendorf5811F用于铂配合物分离
顺式-二氯二氨合铂(II) 99%Acros Organics19376-0050体外测试
CP70由西奈山医院的John Martignetti教授慷慨提供卵巢癌细胞系
数字水浴锅VWR97025-134用于细胞培养基预热
动态光散射（DLS）Brookhaven Instrument Corporation用于纳米颗粒尺寸测量
ES-2ATCCCRL-1978卵巢癌细胞系
Fmoc-L-赖氨酸(Boc)-OH 99.79%Chem-Impex INT’L INC.00493SPPS
Fmoc-L-苯丙氨酸 4-烷氧基苄醇树脂 (0.382 meq/g)Chem-Impex INT’L INC.01914SPPS
Fmoc-L-酪氨酸(tBu)-OH 98%Alfa AesarH59730SPPS
HERACELL 150i CO2培养箱Thermo Scientific Fisher培养箱
高压注射泵New Era1010-US用于纳米颗粒合成中铂配合物的添加
加热板/搅拌器VWR12365-382用于样品搅拌和加热
LAMP-1抗体（偶联Alexa Fluor 647）Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647用于成像
N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）Oakwood Chemical005027SPPS
茚三酮 99%Alfa AesarA10409凯撒试验
油酸Chem-Impex INT’L INC.01421用于铂配合物合成
OV90ATCCCRL-11732卵巢癌细胞系
PBSCorning21-031-CV用于细胞洗涤
Permount封片介质Fisher ChemicalSP15-100用于成像
苯酚Fisher ChemicalA92500凯撒试验
磷钨酸Fisher ChemicalA248-25透射电镜负染色
哌啶 99%BTC219260-2.5LSPPS
铂原子吸收标准溶液Alfa Aesar880861000 µg/mL，用于标准曲线绘制
丙炔基溴 97%Alfa AesarL10595用于荧光素的炔基修饰
科学级生物安全柜Thermo Scientific Fisher1385细胞培养用生物安全罩
自清洁真空系统Welch2028旋转蒸发仪用真空泵
硝酸银Acros Organics19768-0250顺铂活化
SKOV3ATCCHTB-77卵巢癌细胞系
氢氧化钠Fisher ScientificS313-1用于铂配合物合成
氯化亚锡（II）Sigma Aldrich208256铂存在的检测
TOV21GATCCCRL-11730卵巢癌细胞系
三氟乙酸 99%（TFA）Alfa AesarL06374SPPS
三异丙基硅烷（TIPS）Chem-Impex INT’L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100ML用于成像
荧光素钠粉末 40%Fisher ScientificS25328A用于荧光素的炔基修饰
Vivaspin 20（10000 MWCO）SartoriousVS2001用于纳米颗粒洗涤和浓缩
VWR倒置显微镜VWR89404-462用于细胞培养监测

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