本文介绍了一种在单细胞水平上监测细胞存活率并鉴定显著预测细胞死亡变量的实验方案。
本文介绍了一种在单细胞水平上监测细胞存活率并鉴定显著预测细胞死亡变量的实验方案。
传统的细胞毒性检测方法需要在多个时间点收集裂解物或固定细胞，其灵敏度有限，且难以评估影响神经元命运的因素。这类检测依赖于在离散时间点观察不同的细胞群体，因此无法对单个细胞进行长期动态追踪，严重限制了研究者判断亚细胞事件（如点状结构形成或蛋白质错位）究竟是疾病的致病驱动因素、稳态代偿反应，还是仅仅是伴随现象的能力。单细胞纵向显微成像技术克服了这些局限，使研究者能够更灵敏地确定不同细胞群体间的存活差异，并建立因果关系。本视频指南将介绍一种用于检测表达荧光蛋白标记的大鼠原代皮层神经元单细胞存活情况的代表性实验流程。观众将学习如何实现高效转染，如何采集和处理图像以实现对单个细胞的前瞻性追踪，以及如何通过Cox比例风险模型分析来比较不同神经元群体的相对存活率。
异常细胞死亡是多种疾病的驱动因素，包括癌症、神经退行性疾病和中风1。稳健且灵敏的细胞死亡检测方法对于这些疾病的表征以及开发延长或减少细胞存活的治疗策略至关重要。目前已有数十种技术可用于直接测量细胞死亡，或通过替代标志物进行间接评估2。例如，可通过活体染料对死亡或存活细胞进行选择性染色，从而在显微镜下观察评估细胞死亡情况3，或通过监测质膜上特定磷脂的出现来判断4,5,6。此外，也可通过检测细胞裂解后释放到培养基中的细胞内成分或细胞代谢物，作为细胞死亡的间接指标7,8。另一种方法是通过评估细胞的代谢活性来近似反映细胞活力9,10。尽管这些方法能够快速评估细胞存活情况，但均存在一定的局限性。每种技术都将细胞群体视为一个整体，因而无法区分单个细胞及其各自不同的存活速率。此外，这类基于群体的检测方法无法测量可能影响细胞死亡的重要因素，如细胞形态、蛋白质表达或定位。在许多情况下，这些检....
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所有脊椎动物实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会批准（方案编号：PRO00007096）。实验经过周密规划，以尽量减少牺牲动物的数量。妊娠雌性野生型（WT）、非转基因Long Evans大鼠（Rattus norvegicus）单独饲养于配备环境丰富化设施的笼具中，并由密歇根大学实验室动物医学部（ULAM）负责照护，照护方式符合美国国立卫生研究院（NIH）支持的《实验动物照护与使用指南》的要求。所有大鼠在实施安乐死前均尽可能缩短常规饲养时间，此做法符合美国兽医协会《安乐死指南》以及密歇根大学按物种划分的安乐死方法指南的建议。
1. 材料准备
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采用此处所述的转染方法，将编码荧光蛋白 mApple 的质粒转染至体外培养 4 天的大鼠皮层神经元中。转染后 24 小时开始，连续 10 天每天通过荧光显微镜对细胞进行成像。所获得的图像按图 2所示方式进行排列，随后进行图像拼接、堆叠，并对细胞死亡情况进行评分（图 1）。图 3展示了 3 个代表性神经元的时间序列，其中两个神经元在实验过程中死亡（神经元 1 和神经元 2），另一个则存活（神经元 3）。
采用提供的 R 脚本（survival.R）分析生存数据，结果汇总于图4。运行 survival.R 代码的第 7 和第 8 行生成的表格提供了 Cox 比例风险分析的总结。表中四个.......
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本文介绍了一种直接在单细胞水平上监测神经元存活的方法。与传统的细胞死亡检测方法仅限于离散时间点和整个细胞群体的分析不同，该方法能够连续评估多种因素，如细胞形态、蛋白质表达或定位，并可前瞻性地确定每个因素如何影响细胞存活。
该方法可根据多种实验需求进行调整。成像的频率和持续时间可轻松调节，并且任何目的蛋白均可与荧光标记物共转染，以模拟疾病状态或研究蛋白功能13,14,15,16,17,18,19。尽管本文描述的是转染大鼠皮层神经元的最佳操作流程，但该实验方案也可应用于任何终末分化细胞类型。然而，最佳转染条件可能需要根据不同细.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢 Steve Finkbeiner 及 Finkbeiner 实验室成员在机器人显微技术方面的开创性工作。我们还感谢 Dan Peisach 开发了用于图像处理和自动化存活率分析的初始软件。本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）R01-NS097542 项目、密歇根大学蛋白质折叠疾病倡议项目以及 Ann Arbor Active Against ALS 组织资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal 培养基 | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12863 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma | M9272 | |
| 犬尿酸水合物 | TCI | H0303 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 添加剂 | Thermo Fisher | A3582801 | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | 15140122 | |
| 96 孔板 | TPP | 0876 |
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