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通过纵向荧光显微镜监测神经元存活

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DOI：

10.3791/59036

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2019年1月19日

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Michigan School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, University of Michigan School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在单细胞水平上监测细胞存活率并鉴定显著预测细胞死亡变量的实验方案。

摘要

传统的细胞毒性检测方法需要在多个时间点收集裂解物或固定细胞，其灵敏度有限，且难以评估影响神经元命运的因素。这类检测依赖于在离散时间点观察不同的细胞群体，因此无法对单个细胞进行长期动态追踪，严重限制了研究者判断亚细胞事件（如点状结构形成或蛋白质错位）究竟是疾病的致病驱动因素、稳态代偿反应，还是仅仅是伴随现象的能力。单细胞纵向显微成像技术克服了这些局限，使研究者能够更灵敏地确定不同细胞群体间的存活差异，并建立因果关系。本视频指南将介绍一种用于检测表达荧光蛋白标记的大鼠原代皮层神经元单细胞存活情况的代表性实验流程。观众将学习如何实现高效转染，如何采集和处理图像以实现对单个细胞的前瞻性追踪，以及如何通过Cox比例风险模型分析来比较不同神经元群体的相对存活率。

引言

异常细胞死亡是多种疾病的驱动因素，包括癌症、神经退行性疾病和中风1。稳健且灵敏的细胞死亡检测方法对于这些疾病的表征以及开发延长或减少细胞存活的治疗策略至关重要。目前已有数十种技术可用于直接测量细胞死亡，或通过替代标志物进行间接评估2。例如，可通过活体染料对死亡或存活细胞进行选择性染色，从而在显微镜下观察评估细胞死亡情况3，或通过监测质膜上特定磷脂的出现来判断4,5,6。此外，也可通过检测细胞裂解后释放到培养基中的细胞内成分或细胞代谢物，作为细胞死亡的间接指标7,8。另一种方法是通过评估细胞的代谢活性来近似反映细胞活力9,10。尽管这些方法能够快速评估细胞存活情况，但均存在一定的局限性。每种技术都将细胞群体视为一个整体，因而无法区分单个细胞及其各自不同的存活速率。此外，这类基于群体的检测方法无法测量可能影响细胞死亡的重要因素，如细胞形态、蛋白质表达或定位。在许多情况下，这些检测仅限于离散的时间点，无法实现对细胞随时间的连续动态观察。

 相比之下，纵向荧光显微镜技术是一种高度灵活的方法，可直接并连续地在单细胞水平上监测死亡风险11。简而言之，该技术能够在长时间内定期追踪数千个单个细胞，从而精确定位细胞死亡的发生及其增强或抑制因素。该方法的基本原理是通过瞬时转染或转导将编码荧光蛋白的载体导入细胞。随后建立一个独特的参考标记点，每个转染细胞相对于该标记点的位置使研究者能够在数小时、数天甚至数周内对单个细胞进行成像和追踪。当这些图像按时间顺序播放时，细胞死亡表现为荧光信号、细胞形态以及细胞体碎裂的特征性变化，从而可为每个细胞确定其死亡时间。通过风险函数计算出的死亡速率，可在不同条件下进行定量比较，或通过单变量或多变量Cox比例风险分析与特定的细胞特征相关联12。综上所述，这些方法能够准确且客观地区分不同细胞群体间的死亡速率，并识别出显著预测细胞死亡和/或存活的变量（图1）。

尽管该方法可用于在多种铺板格式中监测任意终末分化细胞类型的存活情况，但本实验方案将描述在96孔板中培养的大鼠皮层神经元的转染与成像条件。

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方案

所有脊椎动物实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会批准（方案编号：PRO00007096）。实验经过周密规划，以尽量减少牺牲动物的数量。妊娠雌性野生型（WT）、非转基因Long Evans大鼠（Rattus norvegicus）单独饲养于配备环境丰富化设施的笼具中，并由密歇根大学实验室动物医学部（ULAM）负责照护，照护方式符合美国国立卫生研究院（NIH）支持的《实验动物照护与使用指南》的要求。所有大鼠在实施安乐死前均尽可能缩短常规饲养时间，此做法符合美国兽医协会《安乐死指南》以及密歇根大学按物种划分的安乐死方法指南的建议。

1. 材料准备

  1. 从胚胎第19–20天的大鼠幼崽中分离皮层神经元，并将大鼠皮层神经元以0.5 x 10⁵密度进行培养6 每毫升细胞接种于多聚-D-赖氨酸包被的培养板中，培养4天 体外，如先前所述13,14,15,16,17,18,19.
  2. 按照无内毒素质粒DNA提取试剂盒说明书中的步骤制备目标质粒DNA（参见 材料表使用分光光度计对所得DNA进行定量。
  3. 在体外培养第4天（DIV4），分装、滤器除菌并置于37 °C孵育以下培养基：6 mL低血清培养基（RSM；例如.，OptiMEM），25 mL 神经元基础培养基（NBM），40 mL NBKY（NBM + 1 mM kynurenic acid + 10 mM MgCl2，调节pH至7.4），10 mL NBC（NBM + 1×神经元细胞培养添加剂 + 1×L-谷氨酰胺添加剂 + 1×青霉素-链霉素）。
    注意： 所列体积足以用于转染一块96孔板。请参考 材料表 针对特定试剂。

2. 大鼠皮层神经元的转染

  1. 修改所提供的 转染示例记录表 （参见 补充文件 1通过调整板类型、板图、DNA数量、DNA浓度和孔数（绿色框）来实现。
    注意： 总DNA量为每孔0.2 µg，无论使用一种（例如.，将单个（例如，DNA A）或多个人工构建的DNA（例如，DNA B和C）加入每个孔中。
  2. 根据电子表格中的数据，将适量的RSM和DNA加入同一管中。另取一管，将适量的RSM与转染试剂（例如Lipofectamine）混合。
  3. 室温（RT）孵育5分钟。
  4. 将DNA与转染试剂RSM混合物混合，在室温下孵育20分钟。
  5. 在此孵育步骤中，使用多通道移液器和无菌塑料槽，每孔加入100 µL无血清培养基（NBM）洗涤细胞两次。保留条件培养基（CM），并在37 °C下保存。在此步骤及后续操作中，注意尽量减少神经元暴露于空气中的时间。
  6. 吸除NBM培养基，每孔加入100 µL NBKY。
  7. 20分钟后，将50 µL转染试剂/DNA混合物逐滴加入每个孔中。
  8. 将细胞与转染试剂/DNA复合物在37 °C孵育20分钟。
  9. 用NBKY洗涤2次，每孔加入100 µL CM和100 µL NBC。
  10. 转染成功的细胞应在转染后16–24小时内通过荧光显微镜可见。为评估转染效率，可在37 °C过夜培养后，使用荧光显微镜检查转染效果。
    注意： 该技术的总体转染效率为5%至10%。

3. 成像

  1. 将培养板放置在带有电动载物台的荧光显微镜上，并建立一个基准标记（例如，在培养板底部的标记），以便每次成像时都能对齐培养板。保存该基准标记的图像以供参考。
  2. 导航至目标视野，并记录相对于该基准标记的 x-y 坐标。
  3. 聚焦于表达荧光标记的转染细胞。
  4. 在适当的通道中手动或自动采集荧光图像（例如，红色荧光蛋白 [RFP]、绿色荧光蛋白 [GFP]、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）。通过以规则间隔采集多幅图像，可在图像处理过程中拼接成完整的孔内图像（见步骤 4）。
    注意：图像间距取决于多个因素，包括放大倍数、显微镜光学系统和探测器尺寸。通常情况下，相邻图像之间的光学间距应为单个图像尺寸的 90–95%，以允许少量图像重叠和特征对齐。
  5. 根据需要重复此过程，每次均需与原始基准标记对齐。对于存活分析，成像频率为每 6–24 小时一次，具体取决于细胞类型和实验目的。

4. 图像处理

注意：在完成图像采集后，进行图像分析之前需要执行一系列处理步骤。这些步骤包括但不限于拼接、堆叠和背景扣除（图1）。这些处理步骤的目标是生成一个图像堆栈或时间序列，在其中细胞与其背景之间具有清晰的可辨性，并能够在多个时间点上被轻松追踪。一个专用的FIJI宏（Image_Processing.ijm，见补充文件2）可执行基本的拼接、堆叠和背景扣除操作。讨论部分提供了对每个处理步骤及其参数设置的详细说明。

  1. 调整原始数据或输入目录，使其格式与图2所示一致。
  2. 如果时间点不连续（例如 T1、T2、T3），请重命名这些文件夹以使其连续。此步骤至关重要，可确保Image_Processing宏在堆叠过程中不会崩溃。
  3. 双击 Fiji 图标以启动程序，然后单击并拖动Image_Processing宏至 Fiji 工具栏。这将在 Fiji 中打开该宏。
  4. 修改Image_Processing宏的第2–7行，指定包含图像的输入目录、拼接和堆叠后图像的输出目录、成像时间点数量、荧光通道数量以及孔板格式。
  5. 确定图像的采集顺序。为测试此顺序，可在 FIJI 中通过导航至插件下拉菜单 | 拼接 | 网格/集合拼接 手动拼接一组图像。调整下拉菜单中的类型和顺序设置，直至生成准确拼接的图像。
  6. 根据上述设置，在Image_Processing宏的第8行和第9行中调整GRID_TYPE和STITCH_ORDER变量，使其与之匹配。
  7. 通过修改Image_Processing宏的第10行，指定每个孔中的图像数量。
    注意：对于 2 × 2 的图像拼接，该行应设置为 DIM = 2。
  8. 如果需要背景减除，请将Image_Processing宏的第14行修改为 BGSUB = true。
  9. 通过修改Image_Processing宏的第15行，设置滚动球半径。
    注意：为获得最佳效果，应将半径设置为至少等于图像中最大前景物体的直径。
  10. 点击运行以启动Image_Processing宏。启动后，Image_Processing将自动完成图像拼接、堆叠及背景减除。

5. 细胞死亡评分

注意：有关细胞死亡评分和数据删失的更多信息，请参见讨论部分。

  1. 找到由 Image_Processing 脚本生成的图像堆栈，并在 FIJI 中打开这些文件。
  2. 在 FIJI 中使用点工具，为每个细胞单独标记一个编号。每次放置点后按下t键，可将该细胞标识符添加到 ROI（感兴趣区域）管理器中。
    注意：可在 ROI 管理器中勾选标签和显示全部复选框，以可视化这些标识符。
  3. 逐个浏览每个图像堆栈中的时间点，并在文件 Survival_spreadsheet.csv 中记录每个细胞死亡或需要删失的时间点（参见补充文件 3）。
    1. 表格中每一行对应一个细胞，每个细胞的唯一标识符（ID）由其所在的孔和该孔内的 ROI 编号组成。tp_death 表示观察到细胞存活的最后时间点，time_death 则表示以小时为单位的实际死亡时间。请为每个细胞输入上述数据。为确保后续使用 survival.R 进行分析的正确性（参见补充文件 4），必须严格保持此结构。
      注意：判断细胞死亡的标准至关重要，且可能因细胞类型而异。鉴定神经元死亡主要依据三个标准11,20（图 3）：荧光强度减弱（例如，神经元 1 在 69 小时）、胞体变圆（例如，神经元 2 在 188 小时）以及神经突完整性丧失或出芽（例如，神经元 2 在 188 小时）。
  4. 在最后一列中记录细胞的删失状态。
    注意：由于 R 处理删失数据的方式特殊，删失细胞用0标记，未删失细胞用1标记。请注意，所有存活至最后一个时间点的细胞均被视为删失，因此标记为0。

6. 执行Cox比例风险分析并可视化结果

  1. 如有需要，请在 https://cran.r-project.org/mirrors.html 下载 R Studio。
  2. 打开 R Studio，双击 survival.R 脚本的图标。
  3. 将光标置于 survival.R 的第 2 行，然后点击 R Studio 主窗口中的 run 按钮，以加载 survival 程序包。
  4. 修改 survival.R 脚本的第 5 行，使其指向文件 Survival_spreadsheet.csv 的存储位置。点击 run 按钮，将生存数据作为数据框加载。
  5. 选中第 8 和第 9 行，然后点击 R Studio 控制台窗口中的 run 按钮，以执行 Cox 比例风险分析。结果和输出统计量将显示在 R Studio 的控制台窗口中。
  6. 选中 survival.R 的第 12 至 16 行，点击 run 按钮，生成死亡累积风险图，该图将在 R Studio 的绘图标签页中显示。可通过点击图表上方的 export 按钮保存该文件。
  7. 若需将生存数据以 Kaplan-Meier 曲线形式绘图，请选中 survival.R 的第 19 至 24 行，然后点击 run 按钮。

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结果

采用此处所述的转染方法，将编码荧光蛋白 mApple 的质粒转染至体外培养 4 天的大鼠皮层神经元中。转染后 24 小时开始，连续 10 天每天通过荧光显微镜对细胞进行成像。所获得的图像按图 2所示方式进行排列，随后进行图像拼接、堆叠，并对细胞死亡情况进行评分（图 1）。图 3展示了 3 个代表性神经元的时间序列，其中两个神经元在实验过程中死亡（神经元 1 和神经元 2），另一个则存活（神经元 3）。

采用提供的 R 脚本（survival.R）分析生存数据，结果汇总于图4。运行 survival.R 代码的第 7 和第 8 行生成的表格提供了 Cox 比例风险分析的总结。表中四个...

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讨论

本文介绍了一种直接在单细胞水平上监测神经元存活的方法。与传统的细胞死亡检测方法仅限于离散时间点和整个细胞群体的分析不同，该方法能够连续评估多种因素，如细胞形态、蛋白质表达或定位，并可前瞻性地确定每个因素如何影响细胞存活。

该方法可根据多种实验需求进行调整。成像的频率和持续时间可轻松调节，并且任何目的蛋白均可与荧光标记物共转染，以模拟疾病状态或研究蛋白功能13,14,15,16,17,18,19。尽管本文描述的是转染大鼠皮层神经元的最佳操作流程，但该实验方案也可应用于任何终末分化细胞类型。然而，最佳转染条件可能需要根据不同细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Steve Finkbeiner 及 Finkbeiner 实验室成员在机器人显微技术方面的开创性工作。我们还感谢 Dan Peisach 开发了用于图像处理和自动化存活率分析的初始软件。本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）R01-NS097542 项目、密歇根大学蛋白质折叠疾病倡议项目以及 Ann Arbor Active Against ALS 组织资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Neurobasal 培养基GIBCO21103-049
Opti-MEMGIBCO31985-070
CompactPrep 质粒大提试剂盒Qiagen12863
六水合氯化镁SigmaM9272
犬尿酸水合物TCIH0303
聚-D-赖氨酸MilliporeA-003-E
GlutamaxGIBCO35050-061
Lipofectamine 2000Invitrogen52887
B27 添加剂Thermo FisherA3582801
青霉素/链霉素GIBCO15140122
96 孔板TPP0876

参考文献

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Cox Fiji Kaplan Meier

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