利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学

生物活动最终是由蛋白质进行的, 其中大部分蛋白质与其他蛋白质相互作用, 以获得适当的生物功能。使用计算方法, 人类蛋白质相互作用的总量估计为约 650, 000^,1, 而这些相互作用的中断往往导致疾病²。由于其在控制细胞和组织过程中的重要作用, 研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法已被开发出来, 如酵母-双杂交, 双分子荧光互补, 分裂荧光酶互补, 联合免疫沉淀检测³。虽然这些方法善于发现和确认蛋白质-蛋白质相互作用, 但它们通常是非定量的, 因此提供的相互作用的蛋白质伙伴之间的亲和力有限。定量拉下可以用来测量结合亲和力 (例如, 离解常数kd), 但它不测量结合的动力学, 也不能在 k _{d 由于}不足而非常低的情况下应用信噪比⁴。表面等离子体共振 (spr) 光谱量化了结合动力学, 但它需要一个特定的表面和在表面的一个反应物的固定, 这可能会改变反应物⁵的结合性能。此外, spr 很难测量快速关联和离解率⁵, 使用 spr 来表征蛋白质复合体中交换蛋白质亚基的事件是不合适的。在这里, 我们描述了一种方法, 允许测量在毫秒时间尺度上的蛋白质复杂组装和拆卸速率。该方法对于确定 c ullin-a ssociated-edd8-d 同体蛋白 1 (cand1) 作为 f- 盒蛋白交换因子^6,7的作用至关重要.

cand1 调节 Skp1•Cul1•F 盒蛋白 (scf) e3 脂类的动态, e3 配体属于库林-岭泛素脂质的大家族。scfs 由结合 ing 域蛋白 rbx1 的 cullin cullin 和一种可互换的 f-箱蛋白组成, 后者通过适配器蛋白 skp1^{8 招募}基质并将 cullin 结合。作为 e3 连接酶, scf 催化泛素与底物的结合, 当底物被 f-盒蛋白吸收, 当 cul1 被泛素样蛋白 nedd8^{9 修饰}时, 它就会被激活。cand1 结合未经修饰的 cul1, 在结合时, 它破坏了 Skp1•F 盒蛋白与 cul1 的联系, 以及 ned8 与 cul1^{、11、12、13}的结合。因此, cand1 似乎是体外 scf 活性的抑制剂, 但体内的 cand1 缺乏引起了缺陷, 表明 cand1 在调节体内 scf 活性方面发挥了积极作用 14^{、15、16,17}. 这一悖论最终通过一项定量研究得到了解释, 该研究揭示了 cul1、cand1 和 Skp1•F 盒蛋白之间的动态相互作用。利用荧光共振能量传递 (fret) 检测 scf 和 Cul1•Cand1 配合物的形成, 分别检测出关联和离解速率常数 (分别为 k_on 和k₎。单独测量。测量结果表明, cand1 和 Skp1•F 盒蛋白与 cul1 的复合体极其紧密, 但 scf 的k_含量因 cand1 而急剧增加, Cul1•Cand1 的k_含量大幅增加由 Skp1•F 盒蛋白^6,7。这些结果为定义 cand1 作为蛋白质交换因子的作用提供了初步和关键的支持, 该因子通过从旧的 scf 复合物中回收 cul1 来催化新的 scf 复合物的形成。

本文介绍了利用 fret 法研究 Cul1•Cand1 复合物⁷动力学的方法, 并将同样的原理应用于各种生物分子的动力学研究。当供体被适当的波长激发, 而具有激发谱重叠供体发射光谱的受体存在于10-100 的距离内时, 就会发生 fret。激发态转移到受体, 从而降低供体强度, 增加受体强度¹⁸。fret (e) 的效率取决于 förster 半径 (r₀) 和供体与受体荧光 (r) 之间的距离, 定义为: e = r0 6/(r₀ )⁶ + r⁶)。förster 半径 (r₀) 取决于几个因素, 包括偶极子角方向、供体受体对的光谱重叠和使用的解 19.为了将 fret 检测应用于停止流式荧光仪上, 该方法实时监测供体排放的变化, 并能够测量快速k_开和关_,有必要建立高效的 fret, 以实现从而显著减少了捐助方的排放。因此, 通过选择合适的对荧光染料和在目标蛋白上的位点来连接染料来设计高效的 fret 是非常重要的, 将在本方案中进行讨论。

1. 设计 fret 检测。

1. 从蛋白质数据库 (文件 1u6g) 下载 Cul1•Cand1 复合体的结构文件。
2. 查看 pymol 中 Cul1•Cand1 复合体的结构。
3. 使用 pymol 向导菜单下的测量功能来估计 cand1 的第一个氨基酸和 cul1 的最后一个氨基酸之间的距离 (图 1)。
4. 加载在线光谱查看器 (见材料表), 同时查看 7-氨基-4-甲基香豆素 (amc) 和 flash 的激发和发射光谱 (图 2)。请注意, amc 是 fret 供体, flash 是 fret 受体。

图 1: Cul1•Cand1 的晶体结构和测量潜在标记位点之间的距离.晶体结构文件是从蛋白质数据库 (文件 1u6g) 下载的, 并在 pymol 中查看。选定原子之间的测量是用 pymol 进行的。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: fret 用荧光染料的激发和发射光谱.显示了 amc (7-氨基-4-甲基香豆素) 和 flash 的光谱。虚线表示激发谱, 实线表示发射光谱。该图像最初是由荧光光谱查看器生成的, 并进行了修改以提高清晰度。请点击这里查看此图的较大版本.

2. camc·rbx1 培养细胞的制备, fret 供体蛋白

1. 构建质粒, 表达大肠杆菌细胞中^的人的能力1山梨·rbx1。请注意, 在大肠杆菌细胞中共同表达人类 Cul1•Rbx1 的两个质粒在上一份报告²⁰中进行了详细描述。
   1. 通过标准 pcr 和克隆方法 21, 22, 在 cul1 编码序列的 3 ' 结尾添加 dna 序列编码 "lpetghhhhhhh" (sorase-he-^他的_6个标记)。
   2. 序列新的质粒, 以确认基因插入是准确的。
2. 大肠杆菌细胞中^的聚合酶1 肌胶酶· rbx1. 该方法来自以前的报告²⁰。
   1. 使用热冲击法23将两种质粒中的每一种混合 100 ng 与 bl21 (de3) 化学辅助细胞进行共转化。在37°c 隔夜生长在 lb 琼脂板上, 含有100μgml 氨匹西林和34μgml 氯霉素。
   2. 用新鲜转化的菌落接种50毫升, 在37°c 下生长, 每分钟晃动250转。这就给了一个首发文化。
   3. 接种6个烧瓶, 每个瓶有1升 lb 介质, 每个5毫升发酵剂培养, 在37°c 生长, 250 转分晃动, 直到 od₆₀₀是 ~ 1.0。将培养物冷却至 16°c, 并将异丙基β-d-硫代唑酮苷 (iptg) 添加至 0.4 mm。保持培养在16°c 过夜, 每小时250转。
   4. 通过离心收集大肠杆菌细胞, 以 5, 000 x 克的速度 15分钟, 并在50毫升锥形管中收集细胞颗粒。
      注: 细胞颗粒可以进行蛋白质纯化加工, 也可以在-80°c 下冷冻, 然后再进入蛋白质纯化步骤。
3. 纯化培养 1^的肌酸酶·rbx1 复合物。此方法来自以前的报告²⁰。
   1. 在表达 cle1 肌酶的大肠杆菌细胞颗粒中加入50毫升的裂解缓冲液 (30 mm Tris-HCl、200 mm nocl、5 mL sortase、10% 甘油、1片蛋白酶抑制剂鸡尾酒、ph 7.6 ).
   2. 将细胞在冰上以50% 的振幅进行超声检查。在1秒开到1秒关闭之间交替, 运行3分钟。
   3. 重复步骤 2.3.2 2-3x。
   4. 将细胞裂解液转移到50毫升的离心管中, 以 25, 000 x 克的离心去除细胞碎片, 时间为45分钟。
   5. 在4°c 条件下, 用5毫升谷胱甘肽珠培养透明细胞裂解液2小时。
   6. 在4°c 条件下, 以 1, 500 x 克离心珠状裂解混合物2分钟。取出上清液。
   7. 用5毫升的裂解缓冲液 (无蛋白酶抑制剂) 清洗珠子, 在4°c 离心后在 1, 500 x 克下取出上清液2分钟。
   8. 重复步骤 2.3.7 2x。
   9. 在洗涤的珠子中加入3毫升的裂解缓冲液, 并将珠子浆料转移到空柱中。
   10. 在色谱柱中加入5毫升洗脱缓冲液 (50 mm Tris-HCl, 200 mm ncl, 10 mm 还原谷胱甘肽, ph 8.0)。孵化 10分钟, 收集洗脱液。
   11. 重复步骤 2.3.10 3-4 x。
   12. 在谷胱甘肽珠的洗脱液中加入200μl 的 5 mgml 凝血酶 (见材料表), 并在4°c 下孵育过夜。
       注: 协议可以在此处暂停。
   13. 用缓冲液 a 稀释蛋白质样品 (25 mm hepes, 1 mm dtt, 5% 甘油, ph 6.5) 三倍。
   14. 在带有缓冲区 a 的 fplc 系统上建立阳离子交换色谱柱 (见材料表)。
   15. 以 0.5 mL/min 的流速将蛋白质样品加载到平衡的阳离子交换色谱柱上。
   16. 在 40 ml 中, 通过混合缓冲液 a 和0至50% 缓冲 b (25 mm hepes, 1 m ncl, 1 mL dtt, 5% 甘油, ph 6.5), 以 1 ml/min 的流速排出氯化钠梯度的蛋白质。
   17. 使用 sds-page²⁴检查不同组分的洗脱蛋白。
       注: 协议可以在此处暂停。
   18. 将含有 cul1^{山梨酸甲的}洗脱分数池。
   19. 通过超滤膜 (30 kda 截止) 将浓缩的^{cul1 山梨糖层}酶·rbx1 样品浓缩至 2.5 ml。
4. 通过排序酶介导的转位 21^,22,^将amc 添加到 cl-终止物^中。
   1. 使用脱盐柱将 c4:rbx1^样品中的缓冲液改为色氨酸酶缓冲液 (50 mm Tris-HCl、150 mm nacl、10 mm cacl₂、ph 7.5) (见材料表)。
      1. 平衡具有25毫升的沙质酶缓冲液的脱盐柱。
      2. 将2.5 毫升的^{cul1 肌}酸酶·rbx1 样品加载到色谱柱中。放弃流通。
      3. 用3.5 毫升的山梨酶缓冲液对样品进行洗脱。收集流经。
   2. 在100μl 的^{cul1 山梨酶}中, 在酶缓冲液中加入100μl 的600μm 纯化山梨酶 a 溶液和10μl 的 25mm gggggggac 肽.在黑暗中隔夜将反应混合物在30°c 下培养。请注意, 此步骤将生成 cul1 amc·rbx1.
      注意: 荧光染料对光敏感, 因此在蛋白质和样品制备过程中, 避免将其暴露在环境光中。
      注: 协议可以在此处暂停。
   3. 在反应混合物中加入50μl 的 ni-nta 琼脂糖珠, 在室温下孵育30分钟。
   4. 将 ni-nta 琼脂糖珠颗粒在 5, 000 x 克离心 2分钟, 并收集上清液。
   5. 在 fplc 系统上平衡带有缓冲液 (30 mm tris-hcl, 100 mm 氯化萘, 1 mm dtt, 10% 甘油) 的尺寸排除色谱柱 (见材料表)。
   6. 将所有 cul1 amc·rbx1 样品加载到尺寸排除色谱柱上.具有1.5倍柱体积的缓冲液。
   7. 用 sds-page²⁴检查洗脱分数。
   8. 将包含 cul1amc·rbx1 的洗脱分数集中起来.
   9. 用分光光度计测量蛋白质浓度, 使用其在280纳米的吸收率。
   10. 在-80°c 下, 将蛋白质溶液倾斜。
       注: 协议可以在此处暂停。

3. ^flashcand1 的制备, fret 受体蛋白

注: 此部分中的大多数步骤与步骤2相同。下面将详细介绍不同的条件。

1. 构建质粒, 表达大肠杆菌^{细胞中的人的四联坎托}1。
   1. 通过常规 pcr²⁵ (引物序列) 在 cand1^{的第15氨基酸}之前添加编码为 "ccpgccggsg" (四胞氨酸标记) 的 dna 序列: tgtggctgcgcgcagcacacacaccaccagttag;(ccatgtccattgattccag)。
   2. 将 pcr 产物插入 pgex-4t-2 载体中。序列质粒, 以确认基因插入是准确的, 在框架内。
2. 以与步骤2.2 相同的方式表达四^氯化器cand1 e. e. e. e. e. e. e. e. e。
3. 从大肠杆菌细胞中纯化^四氯化萘蜡烛1。
   1. 用谷胱甘肽珠裂解大肠杆菌和提取^四氯化枝蜡烛。这些步骤与 2.3.1 2.3.12 的步骤相同。
   2. 用缓冲液 c (50 mm tris-hcl, 1 mm dtt, 5% 甘油, ph 7.5) 稀释谷胱甘肽珠中的蛋白质洗脱。在带有缓冲区 c 的 fplc 系统上平衡阴离子交换色谱柱 (见材料表), 并以 0.5 mL/min 流速加载稀释的蛋白质样品。
   3. 通过混合缓冲液 c 和0至50% 缓冲 d (50 mm Tris-HCl, 1 m 氯化碳, 1 mL dtt, 5% 甘油, ph 7.5), 以 1 mlmin 流量在 40 ml 中使用氯化碳梯度 (50 mm Tris-HCl, 1 mm 氯化萘, 1% dtt, 5% 甘油, ph 7.5), 以氯化钠梯度排出蛋白。使用 sds-page²⁴检查不同分数中的洗脱蛋白, 并将含有^ttrecyscand1 的组分相列。请注意,^{与免费商品}及服务税相比, 电话产品的保留量更大。
   4. 通过超滤膜 (30 kda 截止) 传递缓冲液, 将浓缩的^四氯化萘cand1 样品。
   5. 在 fplc 系统上平衡带有标记缓冲液 (20 mm tris-hcl、100 mm 氯化钠、2 mm tcep、1 mm edta、5% 甘油) 的尺寸排除色谱柱。加载^四氯化萘蜡烛1样品 (每次 500μl), 并通过 sds-page²⁴检查洗脱分数。
   6. 通过超滤膜 (30 kda 截止) 将含有^{t龙奇坎德}1 的所有组分集中在 ~ 40μm 中。使用其吸收度为280纳米来估计蛋白质浓度。将蛋白质作为50μl 的脂肪储存在-80°c。
      注: 协议可以在此处暂停。
4. ^flashcand1 的制备。
   1. 在50μl 条约蜡烛1溶液中加入 1μl^{的 flash}溶液 (见材料表)。
   2. 在室温下在室温下混合, 孵育 1-2小时, 得到^flashcand1。
      注: 协议可以在此处暂停。

4. 蜡烛1的制备, fret 追逐蛋白

注: 蛋白质制备协议类似于步骤 3, 但有以下修改。

1. 将全长 cand1 的编码序列插入 pgex-4t-2 矢量。
2. 将步骤3.3.5 中使用的缓冲液改为含有 30 mm Tris-HCl、100 mm 氯化钠、1毫米 dtt、10% 甘油的缓冲液。
3. 消除3.3.7 和3.3.8 的步骤。

5. 测试并确认 fret 检测

1. 制备含有 30 mm Tris-HCl、100 mm 氯化钠、0.5 mm dtt、1 mg/ml 卵白蛋白、ph 7.6 的 fret 缓冲液, 并在室温下使用。
2. 在荧光仪上测试 camc·rbx1 和^flashcand1 之间的 fret.
   1. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 将camc·rbx1 (fret 供体) 添加到最终浓度为 70 nm 的浓度中。将解决方案转换为 cuvette。
   2. 将立方体放入荧光灯的样品支架中。用350纳米激发光激发样品, 并以1纳米增量扫描400纳米至 600 nm 的发射信号。
   3. 重复步骤 5.2.1^,但将 camc·rbx1 改为^flashcand1 (fret 受体)。使用与步骤5.2.2 相同的方法扫描 flash cand1 样本。
   4. (可选)用 510 nm 激发^{光激发 flash}cand1, 并扫描从500纳米到 650 nm 的发射信号。
   5. 在 300μl fret 缓冲液中, 将 cul1 amc·rbx1 和^flashcand1 添加到 70 nm 的最终浓度中.以与步骤5.2.2 相同的方式分析示例。
3. 通过添加追逐 (未标记的cand1) 蛋白质 (图 3c), 确认 camc·rbx1 和^flashcand1 之间的 fret。
   1. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 加入 70 nm^cul1amc·rbx1 和 700 nm cand1。扫描样品发射, 如步骤5.2.2。
   2. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 加入 70 nm flash cand1 和 700 nm cand1。扫描样品发射, 如步骤5.2.2。
   3. 在300μl 的 fret 缓冲液中, 加入 70 nmcul1 amc·rbx1 和 70 nm ^flashcand1, 并在室温下孵育样品5分钟。然后添加 700 nm cand1, 并在添加后立即扫描样品发射, 如步骤 5.2.2)。请注意, 此步骤类似于步骤5.2.5。
   4. 在 300μl fret 缓冲液中, 依次添加 70 nm cul1 amc·rbx1、700 nm cand1 和 70 nm ^{flash cand1}.在室温下对样品进行5分钟的孵化, 并按照5.2.2 的步骤扫描样品的排放。请注意, 这是追逐示例 (图 3c中的绿线)。

6. 测量 Cul1•Cand1 的关联速率常数 (k_打开)

注: 操作停止流式荧光灯的详细信息已在上一份报告²⁶中说明。

1. 准备用于测量的塞流荧光灯。
   1. 根据制造商的说明打开停止流荧光灯。
   2. 将激发光设置为 350 nm, 并使用带通滤波器, 允许 450 nm 发射光通过, 并阻止 500-650 nm 发射光。
   3. 将样品阀放在填充位置, 并连接装满水的3毫升注射器。用水清洗两个样品注射器 (a 和 b), 方法是将样品注射器驱动器上下移动几次。丢弃此步骤中使用的所有水。
   4. 将样品阀保持在填充位置, 并连接装有 fret 缓冲器的3毫升注射器。用 fret 缓冲液清洗两个样品注射器, 方法是多次上下移动样品注射器驱动器。放弃此步骤中使用的所有 fret 缓冲区。
2. 进行控制测量 (图 4c)。
   1. 连接3毫升注射器, 并在 fret 缓冲液中加载带有 100 nm^cul1amc·rbx1 的注射器 a。将样品阀转到驱动位置。
   2. 连接3毫升注射器, 并使用 fret 缓冲液加载注射器 b。将样品阀转到驱动位置。
   3. 使用 "在软件中获取" 下的 "控制面板" 在停止流荧光仪上拍摄五张照片 (混合相同数量的注射器 a 和注射器 b 样本), 而无需记录结果。
   4. 打开 "在软件中获取" 下的 "控制面板", 并通过程序记录6零60秒以上的 c法1 amc 排放量.然后打一枪。
   5. 重复步骤 6.2.4 2x。
   6. 将样品阀转到填充位置。清空注射器 b, 用 fret 缓冲液清洗。
3. 测量观察到的 Cul1•Cand1 关联速率常数 (k_bs) (图 4b)。
   1. 将注射器 a 中的样品保持在步骤6.2.1 相同的地方。
   2. 连接一个3毫升注射器, 并加载注射器 b^与100 nm flash cand1 在 fret 缓冲液。将样品阀转到驱动位置。
   3. 使用 "在软件中获取" 下的"控制面板" 拍摄五张照片, 而无需记录结果。
   4. 打开 "在软件中获取" 下的 "控制面板", 并通过程序记录6零60秒以上的 c法1 amc 排放量.然后打一枪。
   5. 重复步骤 6.3.4 2x。
   6. 清空注射器 b, 用 fret 缓冲液清洗。
   7. 重复步骤 6.3.1-6.3.6 几次, 在 fret 缓冲液中^{的 flash}cand1 浓度不断增加。
   8. 将随着时间的推移, 从每次拍摄测量到的荧光信号的变化 (减少) 调整为一个指数曲线。这将在每次测量中给出_{k 点}, 并且单位为^s-1。请注意, 上一份报告27已很好地讨论了这一计算的基础。
4. 计算所使用的每个^flashcand1 浓度的 k _形的平均值和标准偏差。绘制平均k_个小块对cand1 浓度 (图 4d), 线的斜率表示 Cul1•Cand1 的k_, 单位为^{m-1 s-1}。

7. 在存在 Skp1•F 盒蛋白的情况下测量 Cul1•Cand1 的离解率常数 (k_关)。

注: 此步骤类似于步骤 6, 但进行了以下修改。

1. 在注射器 a 中, 在填充位置下, 在 fret 缓冲区中加载 100 nm cul1amc·rbx1 和 100 nm ^{flash cand1}的解决方案。将样品阀转到 "驱动" 位置。
2. 在注射器 b 中, 在"填充"位置下加载 Skp1•Skp2 的解决方案 (在上一次报告²⁰之后准备)。将样品阀转到 "驱动" 位置。
3. 打开 "在软件中获取" 下的 "控制面板", 并通过程序记录 cal1 amc 超过30秒的排放.然后打一枪。混合注射器 a 和注射器 b 溶液后, 荧光信号会随着时间的推移而增加 (图 5)。

为了测试 cul1amc 和 flashcand1 之间的 fret, 我们首先分别确定了 70 nm cul1 amc (供体) 和 70 nm flashcand1 (受体) 的排放强度 (图 3a-c, 蓝线)。在每次分析中, 只存在一个发射峰值,而 flashcand1 (受体) 的排放量较低。当每个 cul1amc 和 flashcand1 混合 70 nm 生成 fret 时, 发射光谱中存在两个发射峰, cul1 amc 峰变低, flash cand1峰升高 ( 图 3 a) -c, 红线)。当使用全长 cand1 用于 fret 时, 供体峰值的强度降低了 10% (图 3 a, 红线), 当使用第一螺旋截断的 cand1 时, 供体峰值强度的降低增加到 30% (图 3A)-d, 红线), 建议更高的 fret 效率。为了确认信号的变化是由 cul1amc 和 flashcand1 之间的 fret 引起的, 70 nm cul1amc (供体) 与 700 nm 未标记的 cand1 (追逐) 和 70 nm flash cand1 (受体) 混合在一起. 结果, 供体峰完全恢复, 受体峰减少 (图 3c, 绿线), 这证实观察到的 fret取决于cul1 amc·ffash cand1 复合物的形成.在 70 nm cul1 amc·ffashcand1中添加 700 nm Skp1•Skp2 也完全恢复了供体峰值 (图 3d, 绿线), 这表明 Cul1•Cand1 复合体完全被 Skp1•Skp2 平衡所破坏。

图 3: Cul1•Cand1 复杂地层的代表性 fret 分析.fret 缓冲液 (30 mm Tris-HCl, 100 mm 氯化碳, 0.5 mm dtt, 1 mgml 卵白蛋白, ph 7.6) 中的样品在350纳米激发, 并从 400 nm 到 650 nm 扫描排放。(a) 70 nm cul1 amc、70 nm flashcand1 (全) 的发射光谱, 以及两者的混合物 (fret)。cand1 (完整) 代表全长 cand1。(b) 70 nm cul1 amc、70 nm flashcand1 的发射光谱和两者的混合物 (fret)。cand1 与它的第一个螺旋被删除在这个实验中使用, 然后。(c) 70 nmcul1 amc、70 nm flashcand1 的发射光谱, 两者的混合物 (fret), 以及 fret (chase) 的追逐控制。追逐样本中含有 70 nm cul1amc、700 nm cand1 和 70 nm flashcand1。(d) 70 nm cul1amc 的发射光谱, 由 70 nm cul1 amc 和 70 nm flash cand1(fret) 的混合物和 700 nm Skp1•Skp2 添加到 70 nm cul1 amc·ffash cand1 复合体中.在每个图中, 发射信号被归化为 450 nm 的 70 nmcul1 amc的发射。请点击这里查看此图的较大版本.

为了利用建立的 fret 检测方法, 通过监测停止流荧光仪上供体信号随时间的减少情况, 首先测试并确定了所使用的蛋白质浓度。当每个c法1 amc 和 flashcand1 的 5 nm 被使用时, 观察到的信号变化很小 (图 4a), 而当每个蛋白质的浓度增加到 50 nm 时, 信号随时间的推移会被观察到减少 (如果添加了没有flashcand1 的缓冲区, 则废除了此更改 (图 4B)。因此, 采用 50 nmcul1 amc 进行进一步分析, 并通过将 50 nm cul1 amc 与不断增加的 flashcand1浓度混合, 测量了一系列观测到的关联速率常数 (kobs)。通过将点拟合到单个指数曲线来计算每个实验的k形 , 并对从相同flashcand1 浓度获得的k形于进行了平均计算。通过绘制具有 cand1 浓度的平均kbos 并执行线性回归 (图 4d),确定了 k上的 7, 27。

图 4: 关联速率常数的代表性度量。(a)在加入 5 nm flash cand1后, 用停止流荧光仪对 5 nm cul1 amc 的荧光进行了一段时间的监测。(b)在添加 50 nm flash cand1后, 用停止流荧光仪对 50 nm cul1 amc 的荧光进行了一段时间的监测。(c)加入 fret 缓冲液后, 用停止流荧光仪对 50 nmcul1 amc的荧光进行了一段时间的监测。(d) 对 c培养1的蜡烛1进行绑定。绘制不同浓度的cand1 的 Cul1•Cand1. 线性斜率给出 k为 1.8 x 10 7m-1.误差条表示± sem; 错误条表示± sem。n = 4。所有样品均在 fret 缓冲液中制备, 并在350纳米处激发。采用带通滤波器从 amc 收集信号, 并排除来自 flash 的信号。未对数据进行规范化。请点击这里查看此图的较大版本.

与kon的测量类似, 我们通过监测停止流荧光仪上的供体信号随时间的增加 (恢复) 来测量 Cul1•Cand1 的观测离解率常数。首先将 cul1amc和flashcand1 混合, 然后在停止流动的荧光仪上加入 Skp1•Skp2.捐献者的信号迅速增加, 它揭示了一个 0.4秒-1的k b s ( 图 5)。相反, 当缓冲添加到预装的 camc·ffashcand1 中时, 没有观察到信号增加, 这表明 Skp1•Skp2 引发了 Cul1•Cand1 的快速离解.

图 5: 离解率常数的代表性测量.在将 150 nm Skp1•Skp2 或 fret 缓冲液添加到 50 nm cul1amc·ffash cand1 复合物后, 测量了供体荧光随时间的变化。信号变化适合于单个指数曲线, 并给出观察到的离解速率常数为 0.4s-1。实验条件与图 4中描述的条件相似。请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。