利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要，对结合动力学的研究有助于揭示蛋白质复合物的动态特性与功能。本文介绍一种利用荧光共振能量转移和停流技术来定量测定蛋白质复合物动力学参数的方法。 

摘要

蛋白质是生物系统的主要执行者，通常通过与其他大分子或小分子相互作用来实现其生物学功能。这些相互作用往往具有高度动态性，即相互作用的亚基以特定速率持续地结合与解离。虽然利用定量免疫共沉淀等技术测定结合亲和力可揭示相互作用的强度，但研究结合动力学则能进一步阐明相互作用发生的快慢以及每个复合物可存续的时间。此外，在存在其他因子（如蛋白质交换因子或药物）的情况下测定相互作用的动力学，有助于揭示该因子对相互作用的调控机制，从而为生物与医学研究的进展提供重要信息。本文介绍了一种用于测定蛋白质复合物结合动力学的实验方案，该复合物具有较高的内在结合速率，并可被另一种蛋白质快速解离。该方法利用荧光共振能量转移（FRET）在体外报告蛋白质复合物的形成，并可在停流荧光光度计上实时监测复合物快速的结合与解离过程。通过该检测方法，可定量获得该蛋白质复合物的结合与解离速率常数。

引言

生物学功能最终由蛋白质执行，其中大多数蛋白质需要与其他蛋白质相互作用才能发挥正常的生物学功能。通过计算方法估计，人类体内的蛋白质-蛋白质相互作用总数约为 650,000 个¹，而这些相互作用的破坏通常会导致疾病²。由于蛋白质-蛋白质相互作用在调控细胞和有机体过程中的关键作用，目前已开发出多种研究方法，例如酵母双杂交、双分子荧光互补、分裂荧光素酶互补以及共免疫沉淀实验³。尽管这些方法在发现和验证蛋白质-蛋白质相互作用方面效果良好，但通常缺乏定量能力，因此难以提供有关相互作用蛋白对之间亲和力的详细信息。定量 pull-down 实验可用于测定结合亲和力（例如解离常数 K_d），但无法测量结合动力学，且当 K_d 值极低时，由于信噪比不足，该方法也不适用⁴。表面等离子共振（SPR）光谱技术可定量测定结合动力学，但需要将其中一种反应物固定在特定表面上，这一过程可能改变反应物的结合特性⁵。此外，SPR 难以准确测量快速的结合与解离速率⁵，也不适用于表征蛋白质复合物中蛋白亚基的交换过程。本文介绍一种可在毫秒时间尺度上测量蛋白质复合物组装与解离速率的方法。该方法对于确定Cullin-associated-Nedd8-dissociated protein 1（Cand1）作为 F-box 蛋白交换因子的作用至关重要^6,7。

Cand1 调控 Skp1•Cul1•F-box 蛋白（SCF）E3 连接酶的动态，这类酶属于 Cullin-RING 泛素连接酶这一大蛋白家族。SCF 复合物由骨架蛋白 Cul1 组成，Cul1 结合含有 RING 结构域的蛋白 Rbx1，同时通过适配蛋白 Skp1 结合并招募可更换的 F-box 蛋白，后者负责识别底物⁸。作为 E3 连接酶，SCF 催化泛素与其底物的共价连接，当 F-box 蛋白招募底物且 Cul1 被类泛素蛋白 Nedd8 修饰时，SCF 被激活⁹。Cand1 结合未修饰的 Cul1，其结合会破坏 Skp1•F-box 蛋白与 Cul1 的相互作用，同时抑制 Nedd8 与 Cul1 的共价连接^10,11,12,13。因此，在体外实验中 Cand1 似乎抑制 SCF 活性；然而，在生物体内缺失 Cand1 却导致功能缺陷，提示 Cand1 在体内对 SCF 活性具有正向调控作用^14,15,16,17。这一矛盾最终通过一项定量研究得以阐明，该研究揭示了 Cul1、Cand1 与 Skp1•F-box 蛋白之间动态的相互作用关系。研究人员利用荧光共振能量转移（FRET）检测技术，分别测量了 SCF 复合物和 Cul1•Cand1 复合物形成的结合与解离速率常数（分别为 k_on 和 k_off）。结果表明，Cand1 与 Skp1•F-box 蛋白均能与 Cul1 形成极为稳定的复合物，但 Cand1 显著提高 SCF 复合物的 k_off，而 Skp1•F-box 蛋白则显著提高 Cul1•Cand1 复合物的 k_off^6,7。这些结果为将 Cand1 定义为一种蛋白交换因子提供了最初的也是关键的证据，即 Cand1 通过将 Cul1 从旧的 SCF 复合物中回收，促进新的 SCF 复合物的形成。

本文介绍了开发和使用FRET检测方法研究Cul1•Cand1复合物动态过程的实验步骤⁷，该原理同样适用于研究多种生物分子的动态行为。当供体被适当波长的光激发，且在10–100 Å距离内存在激发光谱与供体发射光谱重叠的受体时，即发生荧光共振能量转移（FRET）。此时激发态能量转移至受体，导致供体荧光强度降低，同时受体荧光强度增强¹⁸。FRET效率（E）取决于弗斯特半径（R₀）以及供体与受体荧光团之间的距离（r），其定义为：E = R₀⁶/(R₀⁶ + r⁶)。弗斯特半径（R₀）受多种因素影响，包括偶极子角度取向、供体-受体对的光谱重叠程度以及所用溶液的性质¹⁹。为了在停流荧光仪上应用FRET检测技术——该仪器可实时监测供体发射光的变化，并实现对快速结合速率（k_on）和解离速率（k_off）的测量——必须建立高效的FRET效应，从而显著降低供体发射信号。因此，选择合适的荧光染料组合以及在目标蛋白上选择适当的染料标记位点，以设计高效的FRET体系，是本实验方案中的关键环节，将在下文详细讨论。

方案

1. 设计FRET实验。

1. 从蛋白质数据库（PDB）下载Cul1•Cand1复合物的结构文件（文件编号1U6G）。
2. 在PyMOL中查看Cul1•Cand1复合物的结构。
3. 使用PyMOL中Wizard菜单下的Measurement功能，估算Cand1的第一个氨基酸与Cul1的最后一个氨基酸之间的距离（图1）。
4. 加载在线光谱查看器（见材料表），同时查看7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）和FlAsH的激发光谱和发射光谱（图2）。请注意，AMC为FRET供体，FlAsH为FRET受体。

图1：Cul1•Cand1的晶体结构及潜在标记位点间距离的测量。 晶体结构文件从蛋白质数据库（PDB文件1U6G）下载，并在PyMOL中查看。所选原子之间的距离测量由PyMOL完成。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：用于 FRET 的荧光染料的激发和发射光谱。 显示了 AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）和 FlAsH 的光谱。虚线表示激发光谱，实线表示发射光谱。该图像最初由荧光光谱查看器生成，并经过修改以提高清晰度。请点击此处查看此图的放大版本。

2. FRET 供体蛋白 Cul1^AMC•Rbx1 的制备

1. 构建用于表达人源Cul1的质粒^sortase•Rbx1 在 大肠杆菌 细胞。请注意，这两种质粒共同表达人源 Cul1•Rbx1 E. coli 细胞的详细描述见先前的报告²⁰.
   1. 添加编码“LPETGGHHHHHH”（分选酶-His）的DNA序列₆ 通过标准的PCR和克隆方法将标签（tag）连接至Cul1编码序列的3’端^21,22.
   2. 对新质粒进行测序，以确认基因插入片段准确无误。
2. 共表达 Cul1^sortase•Rbx1 在 E. coli 细胞。该方法源自先前的一项报道²⁰.
   1. 将各100 ng的两种质粒与BL21 (DE3) 感受态细胞混合，采用热激法进行共转化²³在含有100 µg/mL氨苄青霉素和34 µg/mL氯霉素的LB琼脂平板中，37 °C过夜培养细胞。
   2. 接种50 mL LB培养基至新转化的菌落中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜，获得种子培养物。
   3. 接种6个锥形瓶，每个锥形瓶中加入1 L LB培养基，每瓶接种5 mL启动培养物，在37 °C、250 rpm振荡条件下培养，直至OD₆₀₀ 约为1.0。将培养物冷却至16 °C，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM。在16 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。
   4. 收获 E. coli 通过5,000 x g离心分离细胞 g 15 分钟后收集细胞沉淀至 50 mL 锥形管中。
      注意：细胞沉淀可用于蛋白质纯化，或在进行蛋白质纯化步骤前于 -80 °C 冻存。
3. Cul1 的纯化^sortase•Rbx1 复合物。该方法源自先前的报道²⁰.
   1. 向沉淀中加入50 mL裂解缓冲液（30 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，5 mM DTT，10%甘油，1片蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.6） E. coli 表达 Cul1 的细胞^sortase•Rbx1
   2. 在冰上使用超声处理裂解细胞，超声功率为50%。超声程序设置为开启1秒、关闭1秒，交替运行3分钟。
   3. 重复步骤 2.3.2 两到三次。
   4. 将细胞裂解液转移至50 mL离心管中，通过在25,000 x g下离心去除细胞碎片 g 45 分钟。
   5. 将澄清的细胞裂解液与5 mL谷胱甘肽珠在4 °C孵育2小时。
   6. 将珠子-裂解液混合物在1,500 x g下离心 g 4 °C下离心2分钟。弃去上清液。
   7. 用5 mL裂解缓冲液（不含蛋白酶抑制剂）洗涤磁珠，1,500 x g离心后弃去上清液 g 4 °C下持续2分钟。
   8. 重复步骤 2.3.7 两次。
   9. 向洗涤后的磁珠中加入 3 mL 裂解缓冲液，并将磁珠悬液转移至空柱中。
   10. 加入5 mL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，10 mM还原型谷胱甘肽，pH 8.0）至柱中。孵育10分钟，收集洗脱液。
   11. 重复步骤 2.3.10 三到四次。
   12. 加入200 µL 5 mg/mL凝血酶（见 材料表将）加入谷胱甘肽珠的洗脱液中，4 °C 下孵育过夜。
       注意：此处可暂停本实验方案。
   13. 用缓冲液A（25 mM HEPES，1 mM DTT，5%甘油，pH 6.5）将蛋白样品稀释三倍。
   14. 平衡阳离子交换层析柱（参见 材料表在FPLC系统中使用缓冲液A进行。
   15. 以0.5 mL/min的流速将蛋白质样品上样至已平衡的阳离子交换层析柱中。
   16. 以每分钟1 mL的流速，通过混合缓冲液A与0至50%的缓冲液B（25 mM HEPES，1 M NaCl，1 mM DTT，5%甘油，pH 6.5），在40 mL体积中进行NaCl梯度洗脱蛋白。
   17. 使用 SDS-PAGE 检测不同组分中洗脱的蛋白质²⁴.
       注意：此处可暂停本实验方案。
   18. 合并含有 Cul1 的洗脱组分^sortase•Rbx1
   19. 浓缩合并的Cul1^sortase•通过超滤膜（截留分子量30 kDa）将Rbx1样品浓缩至2.5 mL。
4. 通过分选酶介导的转肽作用将AMC添加到Cul1的C末端^21,22.
   1. 更换Cul1的缓冲液^分选酶•将Rbx1样品加入分选酶缓冲液（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂）中₂，pH 7.5）使用脱盐柱（见 材料表).
      1. 用 25 mL 分离酶缓冲液平衡脱盐柱。
      2. 加入 2.5 mL Cul1^sortase•将Rbx1样品加入柱中。弃去穿流液。
      3. 用 3.5 mL 分选酶缓冲液洗脱样品，收集流出液。
   2. 在900 µL的Cul1中^sortase•在分选酶缓冲液中的Rbx1溶液，加入100 µL浓度为600 µM的纯化分选酶A溶液和10 µL浓度为25 mM的GGGG^AMC 肽。将反应混合物在30 °C避光孵育过夜。注意，此步骤将生成Cul1^AMC•Rbx1
      注意：荧光染料对光敏感，因此在蛋白质和样品制备过程中应尽量避免暴露于环境光线下。
      注意：此处可暂停本实验方案。
   3. 加入50 µL Ni-NTA琼脂糖珠至反应混合物中，室温孵育30分钟。
   4. 通过5,000 x g离心沉淀Ni-NTA琼脂糖珠 g 孵育2分钟，收集上清液。
   5. 平衡尺寸排阻色谱柱（参见 材料表) 用缓冲液（30 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% 甘油）在FPLC系统上进行。
   6. 加载所有的 Cul1^AMC•Rbx1 样品上样至尺寸排阻层析柱，用 1.5 倍柱体积的缓冲液进行洗脱。
   7. 通过SDS-PAGE检测洗脱组分²⁴.
   8. 合并含有 Cul1 的洗脱组分^AMC•Rbx1
   9. 使用分光光度计在280 nm处测定蛋白质浓度。
   10. 分装蛋白质溶液，并于 -80 °C 保存。
       注意：此处可暂停本实验方案。

3. 准备^FlAsHCand1，即FRET受体蛋白

注意：本部分的大多数步骤与步骤 2 相同。不同的条件将在下文详细描述。

1. 构建用于表达人源蛋白的质粒 ^TetraCysCand1在 E. coli 细胞
   1. 在第15个密码子前添加编码“CCPGCCGSG”（四半胱氨酸/TetraCys标签）的DNA序列^th 通过常规PCR扩增Cand1的氨基酸²⁵ （引物序列：TGCTGTCCGGGCTGCTGCGGCAGCGGCATGACATCCAGCGACAAGGACTTTAG；CTAACTAGTGTCCATTGATTCCAAG）
   2. 将PCR产物插入pGEX-4T-2载体中。对质粒进行测序，以确认基因插入片段准确且阅读框正确。
2. 表达 ^TetraCysCand1in E. coli 与步骤2.2相同的方式处理细胞，但将质粒转化至Rosetta感受态细胞中。
3. 纯化 ^TetraCysCand1 来自 E. coli 细胞
   1. 裂解 E. coli 细胞沉淀与提取物 ^TetraCys使用谷胱甘肽磁珠进行Cand1实验。这些步骤与步骤2.3.1–2.3.12相同。
   2. 用缓冲液 C（50 mM Tris-HCl，1 mM DTT，5% 甘油，pH 7.5）将谷胱甘肽磁珠洗脱的蛋白溶液稀释三倍。平衡阴离子交换层析柱（见 材料表在FPLC系统中使用缓冲液C，并以0.5 mL/min的流速上样稀释后的蛋白质样品。
   3. 以40 mL NaCl梯度洗脱蛋白，通过混合缓冲液C与0至50%的缓冲液D（50 mM Tris-HCl，1 M NaCl，1 mM DTT，5%甘油，pH 7.5），流速为1 mL/min。使用SDS-PAGE检测不同洗脱组分中的蛋白。²⁴，并合并含有 ^TetraCysCand1。请注意 ^TetraCysCand1 的保留体积大于游离的 GST。
   4. 浓缩合并的样本 ^TetraCys使用超滤膜（截留分子量30 kDa）将缓冲液通过，对Cand1样品进行处理。
   5. 使用FPLC系统用标记缓冲液（20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM TCEP, 1 mM EDTA, 5% glycerol）平衡尺寸排阻色谱柱。上样 ^TetraCys每次取样Cand1样品500 µL，通过SDS-PAGE检测洗脱组分²⁴.
   6. 合并所有含有 ^TetraCys将蛋白溶液通过超滤膜（30 kDa截留分子量）浓缩至约40 µM。通过测定其在280 nm处的吸光度估算蛋白浓度。将蛋白分装为50 µL的等份，于-80 °C保存。
      注意：此处可暂停本实验方案。
4. 制备 ^FlAsHCand1
   1. 加入1 µL FlAsH溶液（参见 材料表) 至 50 µL ^TetraCysCand1 溶液
   2. 充分混匀，于室温避光孵育1-2小时，以获得 ^FlAsHCand1
      注意：此处可暂停本实验方案。

4. FRET 追踪蛋白 Cand1 的制备

注意：蛋白质制备步骤与步骤3类似，但需进行以下修改。

1. 将全长Cand1的编码序列插入pGEX-4T-2载体中。
2. 将3.3.5步骤中使用的缓冲液更换为含有30 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1 mM DTT和10%甘油的缓冲液。
3. 省略步骤3.3.7和3.3.8。

5. 测试并验证FRET实验

1. 配制含有 30 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、0.5 mM DTT、1 mg/mL 卵清蛋白、pH 7.6 的 FRET 缓冲液，并于室温下使用。
2. 在荧光分光光度计上检测 Cul1^AMC•Rbx1 与 ^FlAsHCand1 之间的荧光共振能量转移（FRET）。
   1. 在 300 µL FRET 缓冲液中加入 Cul1^AMC•Rbx1（FRET 供体），使其终浓度为 70 nM。将溶液转移至比色皿中。
   2. 将比色皿放入荧光分光光度计的样品槽中，用 350 nm 激发光激发样品，并以 1 nm 为步长扫描 400 nm 至 600 nm 范围内的发射信号。
   3. 重复步骤 5.2.1，但将 Cul1^AMC•Rbx1 替换为 ^FlAsHCand1（FRET 受体）。使用与步骤 5.2.2 相同的方法扫描 ^FlAsHCand1 样品。
   4. （可选）用 510 nm 激发光激发 ^FlAsHCand1，并扫描 500 nm 至 650 nm 范围内的发射信号。
   5. 在 300 µL FRET 缓冲液中同时加入 Cul1^AMC•Rbx1 和 ^FlAsHCand1，使其终浓度均为 70 nM。以与步骤 5.2.2 相同的方式分析样品。
3. 通过加入竞争蛋白（未标记的 Cand1）来验证 Cul1^AMC•Rbx1 与 ^FlAsHCand1 之间的 FRET（图 3C）。
   1. 在 300 µL FRET 缓冲液中加入 70 nM Cul1^AMC•Rbx1 和 700 nM Cand1。按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品的发射光谱。
   2. 在 300 µL FRET 缓冲液中加入 70 nM ^FlAsHCand1 和 700 nM Cand1。按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品的发射光谱。
   3. 在 300 µL FRET 缓冲液中加入 70 nM Cul1^AMC•Rbx1 和 70 nM ^FlAsHCand1，室温孵育 5 分钟。然后加入 700 nM Cand1，加样后立即按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品发射光谱。注意，此步骤与步骤 5.2.5 类似。
   4. 在 300 µL FRET 缓冲液中依次加入 70 nM Cul1^AMC•Rbx1、700 nM Cand1 和 70 nM ^FlAsHCand1。室温孵育 5 分钟后，按照步骤 5.2.2 的方法扫描样品发射光谱。注意，此为竞争对照样品（图 3C 中的绿色曲线）。

6. 测定 Cul1•Cand1 的结合速率常数（k_on）

注意：停流荧光仪的操作细节已在先前的报告中描述²⁶。

1. 准备停流荧光仪以进行测量。
   1. 根据制造商的说明打开停流荧光仪。
   2. 将激发光设置为 350 nm，并使用带通滤光片，允许 450 nm 发射光通过，同时阻断 500–650 nm 的发射光。
   3. 保持样品阀处于 FILL 位置，并连接一个装有水的 3 mL 注射器。通过多次上下移动样品注射器驱动装置，用水清洗两个样品注射器（A 和 B）。弃去此步骤中使用的所有水。
   4. 保持样品阀处于 FILL 位置，并连接一个装有 FRET 缓冲液的 3 mL 注射器。通过多次上下移动样品注射器驱动装置，用 FRET 缓冲液清洗两个样品注射器。弃去此步骤中使用的所有 FRET 缓冲液。
2. 进行对照测量（图 4C）。
   1. 连接一个 3 mL 注射器，并将注射器 A 装载含 100 nM Cul1^AMC•Rbx1 的 FRET 缓冲液。将样品阀转至 DRIVE 位置。
   2. 连接一个 3 mL 注射器，并将注射器 B 装载 FRET 缓冲液。将样品阀转至 DRIVE 位置。
   3. 在软件的 Acquire 下的 Control Panel 中操作，在停流荧光仪上进行五次进样（等体积混合注射器 A 和注射器 B 的样品），不记录结果。
   4. 打开软件中 Acquire 下的 Control Panel，设置程序以记录 Cul1^AMC 的发射信号，持续 60 秒，然后进行一次进样。
   5. 重复步骤 6.2.4 两次。
   6. 将样品阀转至 FILL 位置。排空注射器 B 并用 FRET 缓冲液清洗。
3. 测量 Cul1•Cand1 的表观结合速率常数（k_obs）（图 4B）。
   1. 保持注射器 A 中的样品与步骤 6.2.1 相同。
   2. 连接一个 3 mL 注射器，并将注射器 B 装载含 100 nM ^FlAsHCand1 的 FRET 缓冲液。将样品阀转至 DRIVE 位置。
   3. 在软件的 Acquire 下的 Control Panel 中操作，在停流荧光仪上进行五次进样，不记录结果。
   4. 打开软件中 Acquire 下的 Control Panel，设置程序以记录 Cul1^AMC 的发射信号，持续 60 秒，然后进行一次进样。
   5. 重复步骤 6.3.4 两次。
   6. 排空注射器 B 并用 FRET 缓冲液清洗。
   7. 重复步骤 6.3.1–6.3.6 多次，每次逐步提高 FRET 缓冲液中 ^FlAsHCand1 的浓度。
   8. 将每次进样测得的荧光信号随时间的变化（下降）拟合为单指数衰减曲线。由此可得到每次测量的 k_obs 值，单位为 s^-1。请注意，该计算方法的基础已在先前的报告中充分讨论²⁷。
4. 计算每种使用的 ^FlAsHCand1 浓度下 k_obs 的平均值和标准差。将平均 k_obs 对 Cand1 浓度作图（图 4D），所得直线的斜率即为 Cul1•Cand1 的 k_on，单位为 M^-1 s^-1。

7. 测定在 Skp1•F-box 蛋白存在条件下 Cul1•Cand1 的解离速率常数（k_off）。

注意：此步骤与步骤6类似，但需进行以下修改。

1. 在注射器 A 中，置于填充位置，加入含有 100 nM Cul1^AMC•Rbx1 和 100 nM ^FlAsHCand1 的 FRET 缓冲液溶液。将样品阀转至“驱动”位置。
2. 在注射器 B 中，置于填充位置，加入 Skp1•Skp2 溶液（按先前报道的方法制备²⁰）。将样品阀转至“驱动”位置。
3. 在软件中，打开采集下的控制面板，设置程序以记录 Cul1^AMC 的发射信号，持续 30 秒。然后进行单次采集。混合注射器 A 和注射器 B 中的溶液后，荧光信号随时间逐渐增强（图 5）。

结果

为了检测 Cul1^AMC 与 ^FlAsHCand1 之间的荧光共振能量转移（FRET），我们首先分别测定了 70 nM Cul1^AMC（供体）和 70 nM ^FlAsHCand1（受体）的发射强度（图 3A-C，蓝色线条）。在每次分析中，仅出现一个发射峰，且 ^FlAsHCand1（受体）的发射信号较弱。当将 70 nM Cul1^AMC 和 70 nM ^FlAsHCand1 混合以产生 FRET 时，发射光谱中出现两个发射峰，Cul1^AMC 的峰强度降低，而 ^FlAsHCand1 的峰强度升高（图 3A-C，红色线条）。当使用全长 Cand1 进行 FRET 实验时，供体峰强度降低了 10%（<...

讨论

FRET 是一种在研究和理解生物系统方面具有重要意义的物理现象¹⁹。本文提供了一种用于检测并利用 FRET 研究两种相互作用蛋白结合动力学的实验方案。在设计 FRET 实验时，我们考虑了三个主要因素：供体发射光谱与受体激发光谱之间的光谱重叠程度、两个荧光基团之间的距离，以及荧光基团的偶极取向²⁸。为了选择适用于 FRET 的荧光基团，我们叠加了各荧光基团的激发和发射光谱，并寻找那些发射峰分离良好，同时供体的发射光谱与受体的激发光谱有显著重叠的荧光基团组合（图2）。为了优化荧光基团之间的距离和取向，我们借助了晶体结构进行分析，优先考虑将荧光基团连接至蛋白质的末端，主要是因为这样对蛋白质结构和活性的干扰风险较低。由于 Cand1 的 N 末端（Cand1^NTD）与 Cul1 的 C 末端（Cul1^CTD）之间的距离，比 Cand1 的 C 末端与 Cul1 的 N 末端之间的距离更短（图1

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阴离子交换层析柱	GE Healthcare	17505301	HiTrap Q FF 阴离子交换层析柱
台式冷冻离心机	Eppendorf	2231000511
BL21 (DE3) 感受态细胞	ThermoFisher Scientific	C600003
氯化钙	Fisher Scientific	C78-500
阳离子交换层析柱	GE Healthcare	17505401	HiTrap SP Sepharose FF
脱盐柱	GE Healthcare	17085101
落地式离心机（高速）	Beckman Coulter	J2-MC
落地式离心机（低速）	Beckman Coulter	J6-MI
荧光光谱查看器	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax 荧光分光光度计	HORIBA	FluoroMax-3
FPLC	GE Healthcare	29018224
GGGGAMC 肽	New England Peptide	定制合成
谷胱甘肽琼脂糖微珠	GE Healthcare	17075605
甘油	Fisher Scientific	G33-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-100
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Fisher Scientific	15-529-019
LB 培养基	Fisher Scientific	BP1426-500
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	30210
卵清蛋白	MilliporeSigma	A2512
pGEX-4T-2 载体	GE Healthcare	28954550
蛋白酶抑制剂混合物	MilliporeSigma	4693132001
还原型谷胱甘肽	Fisher Scientific	BP25211
冷冻摇床	Eppendorf	M1282-0004
Rosetta 感受态细胞	MilliporeSigma	70953-3
凝胶过滤层析柱	GE Healthcare	28990944	Superdex 200 10/300 GL 柱
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-500
停流荧光分光光度计	Hi-Tech Scientific	SF-61 DX2
TCEP·HCl	Fisher Scientific	PI20490
凝血酶	MilliporeSigma	T4648
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-500
超滤膜	MilliporeSigma	UFC903008	Amicon Ultra-15 离心过滤装置，Ultra-15，30,000 NMWL