方法文章

利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

DOI：

10.3791/59038

⸱

2019年3月14日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, 3Center for Plant Biology, Purdue University

本文内容

摘要

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蛋白质-蛋白质相互作用对生物系统至关重要，对结合动力学的研究有助于揭示蛋白质复合物的动态特性与功能。本文介绍一种利用荧光共振能量转移和停流技术来定量测定蛋白质复合物动力学参数的方法。 

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质是生物系统的主要执行者，通常通过与其他大分子或小分子相互作用来实现其生物学功能。这些相互作用往往具有高度动态性，即相互作用的亚基以特定速率持续地结合与解离。虽然利用定量免疫共沉淀等技术测定结合亲和力可揭示相互作用的强度，但研究结合动力学则能进一步阐明相互作用发生的快慢以及每个复合物可存续的时间。此外，在存在其他因子（如蛋白质交换因子或药物）的情况下测定相互作用的动力学，有助于揭示该因子对相互作用的调控机制，从而为生物与医学研究的进展提供重要信息。本文介绍了一种用于测定蛋白质复合物结合动力学的实验方案，该复合物具有较高的内在结合速率，并可被另一种蛋白质快速解离。该方法利用荧光共振能量转移（FRET）在体外报告蛋白质复合物的形成，并可在停流荧光光度计上实时监测复合物快速的结合与解离过程。通过该检测方法，可定量获得该蛋白质复合物的结合与解离速率常数。

引言

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生物学功能最终由蛋白质执行，其中大多数蛋白质需要与其他蛋白质相互作用才能发挥正常的生物学功能。通过计算方法估计，人类体内的蛋白质-蛋白质相互作用总数约为 650,000 个1，而这些相互作用的破坏通常会导致疾病2。由于蛋白质-蛋白质相互作用在调控细胞和有机体过程中的关键作用，目前已开发出多种研究方法，例如酵母双杂交、双分子荧光互补、分裂荧光素酶互补以及共免疫沉淀实验3。尽管这些方法在发现和验证蛋白质-蛋白质相互作用方面效果良好，但通常缺乏定量能力，因此难以提供有关相互作用蛋白对之间亲和力的详细信息。定量 pull-down 实验可用于测定结合亲和力（例如解离常数 Kd），但无法测量结合动力学，且当 Kd 值极低时，由于信噪比不足，该方法也不适用4。表面等离子共振（SPR）光谱技术可定量测定结合动力学，但需要将其中一种反应物固定在特定表面上，这一过程可能改变反应物的结合特性5。此外，SPR 难以准确测量快速的结合与解离速率5，也不适用于表征蛋白质复合物中蛋白亚基的交换过程。本文介绍一种可在毫秒时间尺度上测量蛋白质复合物组装与解离速率的方法。该方法对于确定Cu....

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方案

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1. 设计FRET实验。

  1. 从蛋白质数据库（PDB）下载Cul1•Cand1复合物的结构文件（文件编号1U6G）。
  2. 在PyMOL中查看Cul1•Cand1复合物的结构。
  3. 使用PyMOL中Wizard菜单下的Measurement功能，估算Cand1的第一个氨基酸与Cul1的最后一个氨基酸之间的距离（图1）。
  4. 加载在线光谱查看器（见材料表），同时查看7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）和FlAsH的激发光谱和发射光谱（图2）。请注意，AMC为FRET供体，FlAsH为FRET受体。

显示N端与C端测量及折叠模式的蛋白质结构示意图
图1：Cul1•Cand1的晶体结构及潜在标记位点间距离的测量。....

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结果

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为了检测 Cul1AMC 与 FlAsHCand1 之间的荧光共振能量转移（FRET），我们首先分别测定了 70 nM Cul1AMC（供体）和 70 nM FlAsHCand1（受体）的发射强度（图 3A-C，蓝色线条）。在每次分析中，仅出现一个发射峰，且 FlAsHCand1（受体）的发射信号较弱。当将 70 nM Cul1AMC 和 70 nM FlAsHCand1 混合以产生 FRET 时，发射光谱中出现两个发射峰，Cul1AMC 的峰强度降低，而 FlAsHCand1 的峰强度升高（图 3A-C，红色线条）。当使用全长 Cand1 进行 FRET 实验时，供体峰强度降低了 10%（<.......

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讨论

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FRET 是一种在研究和理解生物系统方面具有重要意义的物理现象19。本文提供了一种用于检测并利用 FRET 研究两种相互作用蛋白结合动力学的实验方案。在设计 FRET 实验时，我们考虑了三个主要因素：供体发射光谱与受体激发光谱之间的光谱重叠程度、两个荧光基团之间的距离，以及荧光基团的偶极取向28。为了选择适用于 FRET 的荧光基团，我们叠加了各荧光基团的激发和发射光谱，并寻找那些发射峰分离良好，同时供体的发射光谱与受体的激发光谱有显著重叠的荧光基团组合（图2）。为了优化荧光基团之间的距离和取向，我们借助了晶体结构进行分析，优先考虑将荧光基团连接至蛋白质的末端，主要是因为这样对蛋白质结构和活性的干扰风险较低。由于 Cand1 的 N 末端（Cand1NTD）与 Cul1 的 C 末端（Cul1CTD）之间的距离，比 Cand1 的 C 末端与 Cul1 的 N 末端之间的距离更短（图1

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢加州理工学院的 Shu-Ou Shan 对 FRET 实验开发的深入讨论。M.G.、Y.Z. 和 X.L. 的研究得到了普渡大学为 Y.Z. 和 X.L. 提供的启动资金支持。本工作部分由普渡大学植物生物学中心的种子基金资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阴离子交换层析柱GE Healthcare17505301HiTrap Q FF 阴离子交换层析柱
台式冷冻离心机Eppendorf2231000511
BL21 (DE3) 感受态细胞ThermoFisher ScientificC600003
氯化钙Fisher ScientificC78-500
阳离子交换层析柱GE Healthcare17505401HiTrap SP Sepharose FF
脱盐柱GE Healthcare17085101
落地式离心机（高速）Beckman CoulterJ2-MC
落地式离心机（低速）Beckman CoulterJ6-MI
荧光光谱查看器ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax 荧光分光光度计HORIBAFluoroMax-3
FPLCGE Healthcare29018224
GGGGAMC 肽New England Peptide定制合成
谷胱甘肽琼脂糖微珠GE Healthcare17075605
甘油Fisher ScientificG33-500
HEPESFisher ScientificBP310-100
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Fisher Scientific15-529-019
LB 培养基Fisher ScientificBP1426-500
Ni-NTA 琼脂糖Qiagen30210
卵清蛋白MilliporeSigmaA2512
pGEX-4T-2 载体GE Healthcare28954550
蛋白酶抑制剂混合物MilliporeSigma4693132001
还原型谷胱甘肽Fisher ScientificBP25211
冷冻摇床EppendorfM1282-0004
Rosetta 感受态细胞MilliporeSigma70953-3
凝胶过滤层析柱GE Healthcare28990944Superdex 200 10/300 GL 柱
氯化钠（NaCl）Fisher ScientificS271-500
停流荧光分光光度计Hi-Tech ScientificSF-61 DX2
TCEP·HClFisher ScientificPI20490
凝血酶MilliporeSigmaT4648
Tris 碱Fisher ScientificBP152-500
超滤膜MilliporeSigmaUFC903008Amicon Ultra-15 离心过滤装置，Ultra-15，30,000 NMWL

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
  2. Kuzmanov, U., Emili, A. Prot....

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FRET

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