使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

摘要

本方案描述了一种集成化方法，可在单一平台上实时研究癌细胞的迁移与侵袭，为细胞运动性及形态学研究提供了一种易于重复且高效省时的选择。

摘要

癌细胞的移动性对于转移的启动至关重要。因此，研究细胞的运动能力及侵袭能力具有重要意义。迁移实验可提供细胞在二维水平运动的基本信息，而侵袭实验则更具生理相关性，能够模拟体内癌细胞从原发部位脱落并穿透细胞外基质的过程。本实验方案提供了一套统一的迁移与侵袭实验操作流程。结合集成的自动化显微成像系统以获取实时高清图像，以及内置的分析模块，为研究人员提供了一种省时、简便且可重复的实验选择。本方案还包含了耗材的替代选项及多种可选的分析方法，供用户根据需要进行选择。

引言

细胞迁移和侵袭是人体内重要的生物学过程，可实现多种正常生理功能，如伤口闭合、胎盘侵入子宫以及乳腺的形态发生^1,2,3。人体对这些生物学事件具有精确而严格的调控；然而，也存在一些例外情况。例如，恶性肿瘤能够逃逸这种保护机制，表现出异常增殖并侵入邻近组织，这一过程称为转移。转移是癌症相关死亡的主要原因⁴。

乳腺癌是女性中最常见的癌症，也是全球发达国家女性中癌症相关死亡的第二大原因⁵。乳腺癌起源于由一层或多层上皮细胞构成的导管或小叶。在正常乳腺组织中，上皮细胞通过膜蛋白（如E-钙黏蛋白和整合素）相互黏附，并与基底膜相连⁶。然而，侵袭性乳腺癌细胞失去了极性和细胞间黏附能力，通常经历上皮-间质转化（EMT），并获得移动能力。在穿出血管后，这些细胞穿过细胞外基质（ECM），进入血管或淋巴系统，随后发生内渗并形成转移性生长⁷。了解这一过程的发生机制具有重要意义，因为转移是癌症相关死亡最常见的原因，且与癌细胞的迁移/侵袭密切相关。为了观察癌细胞的运动，迁移实验和侵袭实验分别是研究二维和三维细胞运动的理想模型。迁移直接评估细胞的运动能力，而侵袭则涉及与微环境的相互作用以及降解生物屏障的能力。这两个过程并非完全独立，因为迁移是侵袭的前提条件。

已开发出多种方法用于研究细胞迁移和侵袭。如Kramer等人综述所述，迁移实验（如伤口愈合实验、栅栏实验和微载体实验）通过产生无细胞区域，使细胞进入该区域，从而评估面积变化；而transwell实验和毛细管实验则基于向趋化因子移动的细胞数量进行评估⁸。对于侵袭实验，需建立细胞外基质（ECM）环境，例如使用ECM凝胶或胶原蛋白，通过监测侵袭面积、距离和细胞数量来评估三维运动（如transwell实验、platypus实验）⁸。另一类侵袭实验是将侵袭性细胞与非侵袭性细胞共培养，观察侵袭性细胞的行为（如球体实验）。上述方法各有优缺点，在实验设计中，更倾向于采用操作简便、易于重复，并能在相似实验流程中同时整合迁移和侵袭实验的方法。

本方案描述了使用活细胞成像仪检测细胞迁移和侵袭的方法。该系统是一种安装在标准细胞培养孵育箱内的实时细胞监测系统，可根据设定的扫描间隔和测量参数，对细胞或荧光标记目标应用适当的掩膜，获取高清图像。迁移/侵袭检测模块包含一种96针划痕工具，适用于在96孔板的细胞单层上制造均一的划痕伤口。该方法基于体外伤口愈合实验，用于监测细胞在塑料表面或包被表面的二维运动。此外，还可评估细胞穿过划痕区域中额外细胞外基质（ECM）的侵袭能力或三维运动。简要的工作流程见图1所示。

方案

注意： 两种细胞系应分别处理。以下步骤如无特别说明，应针对单一细胞系进行。

1. 划痕前优化细胞密度

1. 在无酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，添加10%胎牛血清（FBS）、200 mM L-谷氨酰胺和2 µg/mL胰岛素，于37 °C、5% CO₂条件下（大多数癌细胞系的标准培养条件，具体培养配方依细胞系而定），将贴壁细胞在T75 cm²培养瓶中培养至约80%融合度。
2. 用移液器将培养基吸出并弃入废液容器。加入2 mL预热的0.1%胰蛋白酶-EDTA溶液，短暂冲洗细胞单层后吸除。再加入2 mL 0.1%胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶置于37 °C标准培养条件下孵育5分钟。
3. 轻轻敲击培养瓶以确保细胞完全脱落，随后加入10 mL预热的培养基以终止蛋白水解反应。
4. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温（RT）下以200 × g 离心5分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并用另10 mL预热的培养基重悬细胞。

2. 使用自动细胞计数器（或任何计数方法）进行细胞数量计数

1. 在1.5 mL离心管中，将200 µL重悬的细胞悬液与800 µL的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）混合稀释。
2. 将60 µm细胞计数传感器连接至细胞计数仪，按住开关，将吸头插入细胞悬液中。缓慢松开开关，使细胞悬液被顺利吸入传感器内。细胞浓度将以细胞/mL显示。
3. 计算10 mL细胞悬液中的细胞总数。

3. 细胞铺板

1. 在96孔板中，以不同细胞密度（40,000–90,000 个细胞/孔）接种细胞，每种条件设三个重复孔。
2. 将培养板放入活细胞成像仪中，并设置每2小时扫描一次，持续24小时。
   1. 在软件中，从任务列表中点击设置扫描计划。在抽屉设置面板中确定培养板的位置，点击添加容器并选择培养板类型。在扫描设置面板中，根据实验用培养板的布局选择或编辑扫描模式，并将扫描类型设为标准模式。
   2. 在时间轴上右键单击，选择设置时间间隔。将每隔设为2小时，总时程为24小时。点击应用。

4. 确定迁移实验的最佳细胞接种密度

1. 24 小时后停止扫描，对自动采集的高倍率相差图像应用汇合度处理分析工具，并生成细胞增殖随时间变化的曲线。
   1. 选择 3 至 6 张具有代表性的图像，并将其放入新的 图像集 中。
   2. 确定合适的掩膜作为 处理定义。
   3. 启动分析任务。
   4. 根据随时间变化的汇合度确定最佳细胞密度（通常在迁移实验开始后的 6–18 小时内达到约 100% 汇合度）。
      注意：细胞生长至汇合所需的时间取决于接种稀释度。

5. 第1天和第2天：迁移与侵袭实验的准备工作

1. 第1天，包被用于侵袭实验的培养板。
   注意：ECM胶始终需在冰上操作，并使用已在冰箱中放置过夜的枪头。
   1. 用预冷的培养基将ECM胶稀释至100 µg/mL，向指定孔中加入50 µL稀释后的ECM胶/培养基混合液。
   2. 将培养板置于标准培养条件下过夜。
2. 第2天，轻柔吸除多余培养基。在傍晚时段，按照第1-3节所述条件，将细胞以优化后的密度接种至两块96孔板中，分别用于迁移实验（未包被）和侵袭实验（已包被），每组设三个复孔（在本实验方案中，ZR75-1和MDA-MB-231细胞的优化接种密度分别为90,000/孔和50,000/孔）。
3. 将培养板置于标准培养条件下过夜。

6. 第3天：划痕损伤

1. 在将划痕工具和2个清洗槽放入生物安全柜之前，先用70%乙醇喷洒并擦拭。分别向清洗槽1和2中准确加入45 mL无菌（高压灭菌）蒸馏水和70%乙醇。
2. 为进行灭菌，将划痕工具的针块（上部）依次放入清洗槽1和清洗槽2中各5分钟。
3. 首先进行迁移实验板的操作。
   1. 将含有细胞的培养板从培养箱中取出，确保各孔无干燥，以避免划痕工具受损。移除培养板盖，将其插入划痕工具底座的板架中，并通过导向销小心地将上部放置到底部上。按住黑色杠杆，同时小心提起针块。每个孔中的划痕通常肉眼及显微镜下可见。
   2. 迅速将针浸入水中；如果侵袭实验板的设置相同，此步骤足以在划伤侵袭实验板前清洁划痕工具。否则，需重复灭菌步骤：先用无菌蒸馏水处理5分钟，再用70%乙醇处理5分钟。
4. 用预热的培养基清洗培养板1至2次，以防止脱落的细胞或细胞片重新附着到孔壁上。
5. 向指定孔中加入100 µL新鲜温热培养基，可含或不含处理因素。
6. 侵袭实验的附加步骤。
   1. 将侵袭实验板置于4 °C环境中5分钟以平衡温度，然后小心吸除冷培养基。
   2. 用冰上预冷的培养基将ECM凝胶稀释至5 mg/mL，向指定孔中加入50 µL稀释后的ECM凝胶，并在标准条件下孵育30分钟。
   3. 加入100 µL预热的培养基，可含或不含待测化合物。
7. 将培养板放入活细胞成像仪中，平衡5分钟。选择容器类型为imagelock板。设置扫描类型为划痕伤口，根据实验板设置（每孔1张图像，宽视野模式）选择或编辑扫描模式，并设定每1–2小时重复扫描一次，持续72小时，直至伤口愈合。
8. 清洁划痕工具时，将上部针块依次放入以下溶液（各45 mL，置于清洗槽中）各5分钟：0.5%去污剂1（见材料表）、1%去污剂2（见材料表）、无菌蒸馏水和70%乙醇。将划痕工具放回其底板上，并存放于无尘环境中。

7. 数据分析

1. 当所有伤口愈合后，通过在Drawer Setup中选择实验板并点击Remove Vessel，停止对指定板的扫描。
2. 采集3-6张具有代表性的图像，涵盖不同汇合度百分比的情况，包括划痕刚形成后、伤口闭合10%和50%时的图像。
3. 为确定合适的处理定义，使用Segmentation Adjustment、Cleanup和Filters功能，应用适当的Scratch Wound Mask和Confluence Mask；使用Preview current/all预览掩膜的准确性。
4. 启动分析任务。
5. 数据可在软件内直接分析，或导出进行进一步分析。软件提供的三个指标可用于评估高密度阶段（HD-phase）图像：伤口宽度（µm）、伤口汇合度（%）和相对伤口密度（%）。比较分析将在下一部分中讨论。

结果

该迁移/侵袭实验基于划痕愈合实验，通过96针划痕工具创建无细胞区域，以评估细胞进入该区域的速率。迁移实验与侵袭实验的区别在于：迁移实验检测细胞在组织培养处理的塑料表面的移动，而侵袭实验检测细胞穿过细胞外基质（ECM）凝胶的移动能力。

划痕工具旨在在指定的培养板上制造一致的划痕伤口，而活细胞成像仪则用于实时获取高分辨率图像，并确保划痕伤口位于图像中央。本实验方案中使用的两种乳腺癌细胞系为ZR75-1和MDA-MB-231，分别归类为管腔B型和三阴性亚型⁹。由96针划痕工具产生的划痕伤口通常宽度在700–900 µm之间，但可能因不同细胞系而有所差异（图2）。

在迁移实验中，提供三个指标：（1）伤口宽度（µm），指伤口两侧细胞层之...

讨论

迁移和侵袭是评估癌细胞运动能力的重要参数。利用96针划痕工具，可同时进行二维和三维的伤口愈合实验。除了能够实现自动扫描、提供稳定且干扰最小的细胞培养环境外，使用96针划痕工具进行的划痕实验还能产生一致的划痕伤口，从而使实验更具稳健性和可重复性。96孔板的格式还提供了更多选择，可增加细胞系数量或设置不同的药物处理条件。此外，还可记录细胞形态变化和动态运动过程，用于后续分析。

迁移/侵袭实验的设计易于应用，仅需满足少量前提条件。划痕前获得融合的单层细胞至关重要，以确保细胞向空白区域进行定向移动。因此，强烈建议优化细胞接种密度，培养时间范围为6-18 h 通常情况下，这一时间范围较为理想。实验细胞贴附于表面的能力及其增殖速率将影响所需时间。过长的孵育时间可能导致细胞间黏附增强，并因细胞片层的移除而产生弯曲的双侧细胞前沿。对于黏附性较差的细胞系，使用生物基质包被有助于缩短等待时间。划痕前可对细胞进行血清饥饿处理。饥饿处理的时间点与划痕时间相似，即当细胞融合度接近100%时进行，所用饥饿培养基及处理时长依细胞类型而定。细胞也可在划痕前进行转染，但需根据转染过程所需的孵育时间，提前确...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（10倍浓缩液）	ThermoFisher Scientific	30028-02	用 DPBS 稀释至 2 倍浓度
Countess II FL 全自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	全自动细胞计数仪
清洗剂 1（Alconox）	Sigma-Aldrich	242985	工作浓度为 0.5%
清洗剂 2（Virkon S）	VetProduct DIRECT		工作浓度为 1%
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基，无酚红	ThermoFisher Scientific	21063-045	添加 10% 胎牛血清、200 mM L-谷氨酰胺、2 μg/ml 胰岛素
ECM 凝胶（Matrigel）	Sigma-Aldrich	E6909	生长因子减除型，无酚红
Essen ImageLock 96 孔板，平底	Essen	4379
EVE 细胞计数载玻片	BioTools	EVS-50
胎牛血清（FBS）	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96 孔划痕伤口细胞侵袭配件	Essen	4444	包含 CoolBox、2 个 CoolSink
IncuCyte 细胞迁移试剂盒	Essen	4493	包含 96 孔针板、2 个清洗槽及软件
IncuCyte ZOOM	Essen		活细胞分析系统
人胰岛素溶液	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-谷氨酰胺溶液（100 倍浓缩液）	ThermoFisher Scientific	25030-091
组织培养瓶，75 cm2 生长面积	Greiner Bio-One	658175