基于光片显微镜的过敏性炎症活体实验模型中肺归巢人淋巴细胞的高级成像

摘要

本文介绍的实验方案可在体内炎症条件下表征人原代淋巴细胞的肺部归巢能力。在过敏性炎症小鼠模型中，通过化学透明化处理肺组织后，利用光片荧光显微镜对过继转移的人免疫细胞在肺部的浸润情况进行成像并定量分析。

摘要

高度活化的免疫细胞在组织中大量积聚是多种慢性炎症性疾病的显著特征，也成为临床治疗相关患者时一个极具吸引力的治疗靶点。为了进一步优化旨在调控促炎性免疫细胞病理性失衡组织浸润的治疗策略，深入理解外周淋巴细胞在不同疾病和器官中的特异性归巢特性显得尤为重要。本文所述实验方案可用于监测荧光标记并过继转移的人淋巴细胞在木瓜蛋白酶诱导的肺部炎症模型中向肺组织的积聚情况。与常用于分析免疫细胞迁移和趋化作用的标准体外实验相比，本研究所引入的体内模型能够充分考虑肺组织特有的结构特征以及活体小鼠体内复杂炎症环境的影响。此外，三维断层光片荧光显微成像不仅可提供关于浸润免疫细胞的定量数据，还能清晰展示免疫细胞在炎症肺组织内的空间定位模式。总体而言，我们介绍了一种在慢性炎症性肺疾病免疫学研究领域具有重要价值的创新技术，研究者可依据所提供的分步操作指南轻松实施该方法。

引言

肺部经典的炎症性疾病，如过敏性哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD），已知主要由活化的淋巴细胞向肺组织异常募集所驱动^1,2。淋巴细胞释放的细胞因子（例如 IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IFN-γ 和 TNF-α）可进一步促进先天性和适应性免疫细胞的趋化作用，诱导气道纤维化重塑，或直接损伤肺实质²。迄今为止，导致淋巴细胞在肺组织中病理性积聚的潜在机制尚未完全阐明。类似于肠道和皮肤归巢中所描述的组织特异性T细胞印记现象，肺树突状细胞（DCs）显然能够启动外周T细胞，使其优先浸润肺组织，至少部分通过诱导淋巴细胞表面表达CCR4实现³。除CCR4外，浸润气道的T细胞与外周血中的T细胞相比，还表现出CCR5和CXCR3趋化因子受体的显著上调^1,4,5。总体而言，现有数据支持这一观点：在生理或炎症条件下，T淋巴细胞向肺组织归巢涉及多种不同的趋化因子受体及其相应配体，因而高度依赖于先天性与适应性免疫细胞之间精密协调的协作¹。尤其在病原体或过敏原暴露的初始阶段，先天免疫系统细胞会响应TLR刺激或I....

方案

涉及动物的实验均依照德国埃尔兰根当地相关主管部门（下弗兰肯行政区，维尔茨堡）批准的方案进行。小鼠饲养于特定病原体阴性环境中。人血样本的采集经埃尔兰根-纽伦堡大学当地伦理委员会及机构审查委员会批准，每位患者均签署书面知情同意书。

1. 在小鼠中诱导过敏性肺部炎症

注意：如先前研究²⁷所述，以下实验步骤可用于在小鼠中诱导过敏性气道炎症，从而引发先天性和适应性免疫细胞在支气管肺泡灌洗液（BAL）中的聚集。本方案已在C57BL/6J小鼠中建立，但也可适用于其他标准近交品系。

参见图1A以了解体内实验流程的概要。

1. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠。
   注意： 仅使用6周龄以上、体重至少为16 g的C57BL/6J小鼠。
   1. 在PBS中配制氯胺酮/赛拉嗪溶液（氯胺酮12 mg/mL；赛拉嗪1.6 mg/mL），并准确测定小鼠的体重。
   2. 按8 µL/g体重剂量向第一只小鼠腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪溶液，并在进行步骤1.3前通过足垫夹捏反射消失确认深度麻醉状态。
   ....

结果

本方案描述了一种实验性小鼠模型，可通过光片荧光显微镜监测并定量过继转移的人源T淋巴细胞在肺组织中的聚集情况。图1A展示了实验流程中体内步骤的示意图。为确保结果可靠，至关重要的是获得高质量的分离后并经荧光标记的人源CD4⁺ T细胞，这些细胞随后将被转移至小鼠体内。如图1B,C代表性所示，基于微珠的细胞富集及后续荧光标记操作通常可获得流式细胞术检测下CD4⁺ T细胞纯度＞95%，且所有CD4⁺ T细胞均实现有效荧光标记。光片荧光显微镜成像的质量和穿透深度在很大程度上依赖于适当的组织透明化程度。如图1D所示，本研究采用的基于ECi的组织透明化方案能够实现较高的器官透明度，表明折射率匹配成功。最后，图2B,C,D

讨论

本文所述的实验设置提供了在体内炎症条件下监测原代人免疫细胞肺部归巢能力的机会，从而显著补充了传统体外黏附和趋化实验。为充分考虑肺部特有的解剖学器官特征、免疫细胞归巢的关键环节（包括趋化作用及细胞在靶器官内的分布）、以及所获数据的临床相关性和可转化性，我们采用了三项关键技术特征：（1）在活体小鼠体内分析原代人免疫细胞；（2）通过木瓜蛋白酶诱导肺部炎症；（3）对透明化肺组织进行光片荧光显微成像。

尽管由于人与小鼠之间受体-配体相互作用可能存在显著的不兼容性，导致在活体小鼠体内对过继转移的人免疫细胞进行功能研究在某些方面受到一定限制，但人源化小鼠模型这一总体概念在过去几十年中已成功建立，成为转化医学领域重要的实验工具^24,32,33,34,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖 NEEO Ultra	卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄	2267.4
AlexaFluor594 抗人 CD45 抗体	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥	304060
氯化铵	卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄	K2981
21 G 套管针	Becton, Dickinson and Company，美国富兰克林湖	301300
细胞增殖染料 eflour670	eBioscience Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥	65-0840-85
CD4 微珠，人	Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-045-101
EDTA（乙二胺四乙酸）	卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄	8043.1
9 mL 钾-EDTA 血液采集管	Sarstedt AG & Co., Nü德国马尔堡	21066001
肉桂酸乙酯（ECi）	Sigma-Aldrich，德国斯泰因海姆	112372-100G
乙醇 ≥ 99.5%（乙醇）	卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄	5054.3
FBS（胎牛血清）Good Forte	PAN-Biotech GmbH，艾登巴赫，德国	P40-47500
过滤 100 µm	VWR International Germany GmbH，德国达姆施塔特	732-2758
Imaris 图像分析软件 9.0.2	Bitplane AG，苏黎世，瑞士	未提供
ImspectorPro 软件	Abberior Instruments GmbH, Gö德国蒂宾根	未提供
氯胺酮	德国弗赖堡 Inresa Arzneimittel GmbH公司	3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II	LaVision BioTec GmbH，比勒费尔德，德国	未提供
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-042-303
Multifly 针头 20 G	Sarstedt AG & Co., Nü德国马尔布雷希特	851638035
30 G 针头	德国黑森州美因茨的B. Braun Melsungen AG公司	9161502
血细胞计数板	neoLab Migge GmbH，德国海德堡	C-1003
Pattex 胶水	Henkel AG & Co, Dü德国杜塞尔多夫	PSK1C
LS 柱	Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-042-401
淋巴细胞分离液（密度 1.077 g/mL）	anprotec	AC-AF-0018
木瓜蛋白酶	默克	1,071,440,025
PBS Dulbecco（磷酸盐缓冲液）	Biochrom GmbH，柏林，德国	L182-10
PerCP/Cy5.5 抗人 CD4	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥	317428
PerCP/Cy5.5 小鼠 IgG2b κ 同型对照	BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥	400337
PFA（多聚甲醛）	卡尔罗斯特有限责任公司，德国卡尔斯鲁厄	0335.1
碳酸氢钾	卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄	P7481
10 mL 血清移液管	Sarstedt AG & Co., Nü德国马尔布雷希特	86.1254.001
1 mL 注射器	德国黑森州美因河畔美尔松根，B. Braun Melsungen AG	9166017V
5 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company，美国富兰克林湖	260067
20 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company，美国富兰克林湖	260069
1.5 mL 离心管	Sarstedt AG & Co., Nü德国马尔堡	72,706,400
2 mL 离心管	Sarstedt AG & Co., Nü德国马尔布雷希特	72.695.400
2 mL 管，棕色	Sarstedt AG & Co., Nü德国马布雷希特	72,695,001
15 mL 离心管	Sarstedt AG & Co., Nü德国马布雷希特	62.554.502
50 mL 离心管	Sarstedt AG & Co., Nü德国马尔布雷希特	62.547.254
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotech GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫	130-090-976
赛拉嗪（Rompun 2%）	Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森	KPOBD32