左全肺切除联合野百合碱或Sugen建立大鼠肺动脉高压模型

摘要

啮齿类动物左肺切除术是肺动脉高压研究中一种有价值的技术。本文介绍了一种大鼠肺切除术的操作方案及术后护理方法，以确保最低的发病率和死亡率。

摘要

在本实验方案中，我们详细阐述了成功实施大鼠左侧肺叶切除术并联合使用野百合碱（MCT）或SU5416（Sugen）诱导肺动脉高压（PAH）的正确操作步骤及必要注意事项。我们还比较了这两种模型与目前研究中常用的其他PAH动物模型之间的差异。近年来，动物PAH模型的研究重点已转向探讨丛状病变中血管增殖的机制，其中肺血流量增加被认为是导致严重肺血管重构的重要触发因素。在模拟肺血流量增加的啮齿类动物模型中，最具前景的方法之一是单侧左肺叶切除术联合MCT或Sugen的“二次打击”策略。切除左肺后，导致右肺血流增加且呈湍流状态，从而引发肺血管重构。目前尚无关于大鼠肺叶切除术的详细操作流程。本文提供了在雄性Sprague-Dawley大鼠中进行肺叶切除手术及术后护理的逐步操作指南。简要而言，首先对动物实施麻醉并开胸，暴露左肺动脉、肺静脉和支气管后予以结扎，并完整切除左肺；随后关闭胸腔，使动物恢复。血液被迫仅通过右肺循环，由此增加的血管压力将逐步引起小肺动脉的重构与闭塞。术后一周给予MCT或Sugen作为“二次打击”，以诱导内皮功能障碍。肺血流量增加与内皮功能障碍的联合作用可导致严重的PAH。该方法的主要局限性在于需要具备基本的外科手术技能。

引言

肺动脉高压（PAH）是一种进行性且致命的疾病，其特征是肺血流增加、血管阻力升高、炎症以及小肺血管的重构¹。这种重构通常导致血管病变，使小肺动脉发生阻塞和闭塞，引起血管收缩并增加右心室后负荷²。目前针对PAH的有效药物治疗手段较少，因此与PAH相关的死亡率仍然较高。近年来，肺动脉高压发病机制的研究重点已转向血管增殖机制，其中肺血流增加被认为是诱发肺血管重构的重要启动因素^3,4。

肺动脉高压的动物模型提供了关键的见解，有助于解释该疾病的病理生理学机制，并为药物、细胞、基因和蛋白质递送提供了研究平台。传统上，慢性缺氧诱导的肺动脉高压模型和MCT肺损伤模型是研究肺动脉高压（PAH）病理生理学的主要模型⁵。然而，与人类患者中所描述的改变相比，这些模型在产生肺血流量增加和新生内膜样血管重构方面并不充分。啮齿类动物的慢性缺氧模型会导致血管壁增厚和低氧性血管收缩，但不会引起小肺血管的闭塞性血管病变⁶。此外，缺氧状态是可逆的。因此，该缺氧模型也无法产生严重的肺动脉高压。MCT肺损伤模型虽可引发一定程度的内皮功能障碍，但在大鼠中并不会形成人类严重原发性肺动脉高压所特有的复杂闭塞性血管病变²。此外，经MCT处理的大鼠通常死于MCT诱导的肺毒性、静脉闭塞性肝病和心肌炎，而非肺动脉高压本身²。最后，单侧肺切除术本身在短期内不足以在小肺血管中诱导新生内膜样病变。肺切除术后，肺动脉压力仅有轻微升高⁷。而在人类中，当对侧肺功能正常时，肺切除术通常耐受良好⁷。

然而，左肺切除术联合MCT或Sugen的方法具有优势，因其可模拟肺血流量增加，并导致与严重临床肺动脉高压（PAH）相当的肺血管重构。肺切除术选择仅有一个肺叶的左肺，而非具有四个肺叶的右肺。若切除右肺，动物将无法代偿由此引起的呼吸功能不全。在肺切除-MCT模型中，超过90%的手术动物会出现新内膜型血管重构⁷。类似地，Sugen联合肺切除术可导致严重的PAH，其特征为闭塞性血管病变、细胞增殖、凋亡以及右心室功能障碍⁸。相较于其他诱导PAH的手术方法，左肺切除术也更具优势。既往在大鼠中用于增加肺血流量的模型包括主动脉-腔静脉分流术或锁骨下动脉-肺动脉吻合术。这些模型技术极为复杂^7,9,10,11。实施主动脉-腔静脉分流术需打开动物腹腔，分流装置置于腹主动脉，导致血流增加遍及所有腹腔器官而不仅限于肺部，因此PAH的发展过程更为缓慢。此外，难以准确评估分流道内的血流量，而肺切除术后剩余肺组织的血流量可明确增加一倍。锁骨下动脉-肺动脉吻合术同样存在多种并发症。动脉血流入静脉可能导致吻合口血栓形成和出血。与主动脉-腔静脉分流术类似，也难以确定通过吻合口的血流量。此外，该技术成本高、操作困难，且需要熟练的血管外科技术。单侧左肺切除术使对侧肺的血流量和剪切应力加倍，结合MCT或Sugen处理后，可引发PAH典型的血流动力学和组织病理学改变，即内皮细胞损伤^8,12。

本论文的创新之处在于提供了大鼠左侧肺叶切除术极为详尽且全面的外科手术方案，并讨论了这些模型在技术和生理方面的挑战。由于目前尚无此类方案可供参考，许多研究人员认为该模型难以应用。曾实施过左侧肺叶切除术的研究者常面临较高的动物死亡率和并发症发生率，导致实验动物不必要的损失，从而影响科学评估的准确性。因此，许多研究人员转而采用经典模型，如MCT注射、慢性低氧暴露，或仅进行肺叶切除术来建立肺动脉高压（PAH）模型。然而，这些模型的效果远不如MCT或Sugen联合左侧肺叶切除术的组合方案。本文的主要目的是提供首个针对大鼠单侧左侧肺叶切除术的详细且可重复的外科手术方案，以建立最优的PAH外科动物模型。将本左侧单侧肺叶切除术方案与MCT或SU5416相结合，将使研究人员能够构建出更为高效且具有临床相关性的重度PAH模型，用于深入研究这一致命性疾病的发生机制。

方案

以下所述操作程序已获得西奈山伊坎医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。所有大鼠均得到人道照护，符合西奈山《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 手术准备

1. 高压灭菌Cooley-Mayo弯剪（大剪刀）、直型Iris剪（小剪刀）、McPherson-Vannas Iris剪（后部剪刀）、Wangensteen组织镊（无创镊）、Gerald组织镊、普通金属眼睑撑开器（自持式拉钩）、小血管电凝器、纱布、双头探针、细血管针持、Micro-Jacobson蚊式止血钳（蚊式钳）。

2. 大鼠的准备与插管

1. 在手术前30分钟，对6至8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.1 mg/kg）。
2. 将大鼠单独放入麻醉舱内，给予4%异氟烷和氧气（1 L/min），持续3–4分钟，直至大鼠完全麻醉（即意识丧失、呼吸缓慢，且对触碰或声音无反应）。
3. 大鼠插管术
   1. 将大鼠从容器中取出，用胶带将其固定在板上，使大鼠仰卧，口部位于板的边缘。用绳子绑住大鼠的两颗门牙，以保持颈部平直。
   2. 将光纤鹅颈光源置于喉部上方，用手指抬起并固定舌头，上抬会厌以暴露声带。气管应位于声带后方并被明亮照亮；调整光源位置，直至气管清晰明亮。
   3. 在60秒内将16 G导管插入大鼠喉部进行插管 在大鼠苏醒前将其从腔室中移出，因为它们苏醒迅速。如果大鼠在成功插管前苏醒，应立即将其放回并重复操作。 
   4. 立即连接大鼠至呼吸机，以恢复异氟烷和氧气的输送。使用冷镜确认插管，观察导管中呼出气体的湿度在冷镜表面形成的冷凝现象。通过观察胸部的扩张情况，确保动物仍在呼吸。
4. 将大鼠连接至呼吸机。设置氧气流速为1 L/min。设置通气频率为70次/分钟，潮气量为0.35–0.45 mL。设置呼气末正压（PEEP）为2–4 cm H₂O。₂O. 将异氟烷浓度降低至2–3%。
5. 将大鼠置于37 °C加热垫上，取右侧卧位，并将其置于显微镜下。用胶带固定前肢。使用电动剃毛器剃除左侧胸部自前肢后方至肋骨末端区域的毛发。用纱布蘸取10%聚维酮碘溶液清洁手术区域，随后用70%乙醇擦拭三次。
6. 将脉搏血氧仪置于大鼠足部，并在手术全程监测心率和血氧饱和度。心率应维持在200–500次/分钟之间，血氧饱和度应 >95%.

3. 无菌环境的准备

1. 在显微镜下观察手术区域。此步骤必须首先进行，因为在环境达到无菌状态后，显微镜将无法再进行调整。
2. 戴上无菌外科手套。除已灭菌的器械、手术巾和大鼠身体的手术区域外，不得触碰任何其他物品。
3. 将无菌巾覆盖在大鼠身体及器械托盘上，以建立无菌环境。
4. 戴上无菌手套后，将无菌器械放置于无菌器械托盘上。

4. 左侧肺叶切除术手术步骤

1. 使用库利-梅奥剪刀和杰拉尔德组织镊在手术单上剪开一个小孔。孔的直径应约为 2–3 cm，以充分暴露切口，但不宜过大，确保仅暴露已消毒的皮肤。
2. 使用手术刀在左侧胸壁做一条长约 2 cm 的侧向切口。使用纱布和电凝笔控制出血并维持止血。使用库利-梅奥剪刀逐层剪开组织，直至暴露肋骨和肋间肌。
3. 进入肋间间隙
   1. 使用蚊式钳在第三肋间肌处穿出一个小孔。
   2. 使用双头探针将肺组织推开，以暴露肺动脉。若肺动脉难以接近，研究者可选择进入其他肋间间隙。
   3. 使用虹膜剪和麦克弗森-范纳斯虹膜剪（后剪）将肋间肌剪开约 1–2 cm。使用电凝笔止血。
   4. 放置小型自持式牵开器，以保持肋骨和肌肉张开。
4. 仅打开左侧胸膜，并将左肺向下牵拉至腹腔低位，以便接触肺动脉和支气管。将一个中号止血夹装入结扎夹施夹器中备用。
5. 结扎左侧主支气管和左侧主肺动脉
   1. 使用旺根施泰因无创镊小心提起左肺上部，以暴露肺动脉。
   2. 将止血夹及其施夹器夹闭于肺动脉周围完成结扎。注意避免夹闭或损伤左侧奇静脉。切勿用力过猛，以防血管破裂。
   3. 使用扁桃体钳进一步分离肌纤维，扩大切口。
   4. 将另一个中号止血夹装入结扎夹施夹器中，准备就绪。
   5. 使用无创镊将肺下部从切口处逐步提起，直至可视左侧主支气管和左肺静脉。必须使用无创镊轻柔牵拉肺组织向上并移出切口。由于肺体积较大，无法一次性完整拉出而不撕裂组织，因此需使用有齿镊固定肺组织位置，同时小心使用无创镊逐步牵出更多肺组织。
   6. 将左侧主支气管和左侧主肺静脉一并置于施夹器中夹闭完成结扎。切勿用力过猛夹闭静脉与支气管，以防血管破裂。
6. 使用剪刀切除肺组织。操作时注意避免剪断或拉脱止血夹。使用一小块无菌纱布吸除血液，并确认无活动性出血。
7. 肋骨及肋间肌的关闭
   1. 在缝合肋间肌前，将一根 16 G 导管从远离手术切口的位置插入胸腔，进入第七肋间间隙。确保研究者能观察到针头行进路径，避免穿刺重要器官或血管。
   2. 立即拔出针芯，保留导管原位。该导管将作为胸腔引流管使用。
   3. 使用 4-0 普理灵缝线缝合肋骨及肋间肌。
   4. 使用连续缝合法以 5-0 缝线关闭皮肤及皮下组织（材料表）。
   5. 将一根 5-0 缝线（材料表）穿过皮肤并围绕胸腔引流管固定，以便在拔除引流管时可收紧缝线封闭创口。
8. 通过导管连接 3 mL 注射器抽吸胸膜腔内气体，以恢复胸腔内的正常负压。随即使用持针器夹闭导管，防止空气重新进入胸腔。迅速拔除导管，并拉紧缝线结扎封闭创口。

5. 术后恢复

1. 将动物置于仰卧位。关闭异氟烷，但继续通过气管插管为大鼠供氧。在动物恢复足够意识并能够自主活动并安全返回笼子之前，任何时间都不得离开动物。
2. 皮下注射 2–3 mL 无菌乳酸林格液。
3. 监测心率（≈200–500 次/分钟）、血氧饱和度（≥95%）及动物体色，以确认动物呼吸良好。
4. 当动物开始出现自主呼吸动作和颈部活动，并对物理刺激产生反应（如睁眼、鼻部活动、耳朵对声音有反应）时，拔出导管并断开呼吸机，完成拔管。
5. 将动物放回空笼中，远离其他动物。动物应单独饲养至少 3 天。
6. 为控制疼痛，每 12 小时皮下注射 0.1 mg/kg 布托啡诺，持续 3 天。

6. 给予“二次打击”MCT或Sugen

1. 术后1周，通过皮下注射给予1 mL MCT（60 mg/kg）或1 mL Sugen（25 mg/kg）。

7. 末期收获

1. 在MCT或Sugen给药后七周，将动物放入一个通有氧气（1 L/min）和4%异氟烷的 密闭室中。
2. 通过鼻罩将动物连接至呼吸机。保持氧气流动，并将异氟烷浓度降低至2.5–3%。将动物仰卧位放置，并用胶带固定所有四肢。
3. 剃除动物整个腹部的毛发。
4. 打开胸腔
   1. 使用手术刀从锁骨切迹至剑突沿胸部正中做一切口 。
   2. 用组织镊夹住剑突。使用Cooley-Mayo剪刀剪开胸骨，直至充分暴露心脏和肺动脉。使用电凝止血。用牵开器将肋骨撑开。
5. 辨认肺动脉。如有必要，可在心脏下方垫纱布以调整其方位。使用20 G静脉留置针穿刺主肺动脉分叉处与肺动脉瓣之间的肺动脉。仅将20 G留置针置入动脉内，并撤出针芯。将1.2 Fr Transonic压力导管经已置入肺动脉的静脉留置针送入。当肺动脉压力波形稳定后，至少记录10秒的压力数据。重复上述步骤，记录右心室内的压力。
6. 取出心脏和肺组织。取部分肺组织置于福尔马林中固定，后续进行石蜡包埋并用苏木精-伊红染色。

结果

根据公认的分类系统，肺动脉高压的特征是平均肺动脉压（mPAP）超过正常肺动脉压的上限（即 25 mm Hg）。在肺叶切除术 + MCT 组中，第 21 天时出现严重的肺动脉高压，mPAP 升高（图 1）。mPAP 的计算公式为：

使用连接至ADVantage PV系统的压力导管在主肺动脉内测量右心室收缩压与舒张压以及肺动脉压。平均肺动脉压（mPAP）通过上述公式计算得出。在对照组（n=20）中，平均肺动脉压为18.6±...

讨论

在肺动脉高压（PAH）受累的肺脏中，血管增生伴新生内膜形成以及肺动脉闭塞，导致严重的血流动力学改变、右心室衰竭和早期死亡^7,8。血管壁的改变增加了血流阻力，进而升高动脉压和右心室压力。在PAH早期，通常在给予MCT或Sugen后约3周，大鼠出现非特异性的组织学改变，如中膜肥厚、外膜增厚以及小动脉和微动脉的肌性化，这些改变具有潜在可逆性。在后期阶段，即给予MCT或Sugen后约6–8周，大鼠肺组织出现新生内膜和丛状血管病变，导致中、小肺动脉及微动脉的阻塞和闭塞，表现为内膜细胞增生和同心圆状内膜纤维化。丛状病变通常由内皮细胞和肌成纤维细胞排列形成的血管丛构成。在许多情况下，这些改变还伴随间质性水肿和纤维化、远端小肺动脉的血栓栓塞性阻塞、肌性血管血栓部分再通以及纤维素样坏死¹²。

如前所述，其他肺动脉高压（PAH）模型中的大鼠不会出现小血管的血管闭塞、新生内膜和丛样病变，以及肺动脉和右心室的高压力。采用慢性低氧PAH模型处理...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术刀片	巴德-帕克	371215	切口
异氟烷（Forane，USP）	Baxter	NDC 10019-360-40	麻醉
BD Angiocath 16 G	BD	381157	气管插管，胸腔引流管
BD 1 mL 胰岛素注射器	BD	329652	术后给予布托啡诺
Biogel 外科医生手术手套	Biogel	30460-01	无菌外科手套
Wahl BravMini+ 修剪器	Braintree Scientific	CLP-41590 P	剃除手术部位毛发
SU5416	Cayman Chemical	13342	Sugen
光纤照明光源	Cole-Parmer	EW-41723-02	用于插管的光源
Surgipro II 4-0 缝线	Covidien	VP831X	肋间闭合肌
Polysorb 5-0 缝合线	Covidien	GL-885	缝合皮肤
中型滑盖式诱导室	DRE 兽医	12570	氧气 &和异氟烷输送
DRE Compact 150 啮齿类动物麻醉机	DRE 兽医	373	氧气 &和异氟烷输送
小型血管电凝器套装	精细科学工具	18000-00	电凝器以减少出血
VentElite 小动物呼吸机	哈佛仪器	55-7040	呼吸机
MouseSTAT Jr	Kent Scientific	MSTAT-JR	脉搏血氧仪 &和心率监测器
小鼠足爪脉搏血氧仪传感器	Kent Scientific	SPO2-MSE	脉搏血氧仪 &心率足底传感器
PhysioSuite RightTemp	Kent Scientific	PS-02	温控板
PVP 预处理溶液	Medline	MDS093944	清洁手术部位
多层衬里手术单	Medline	NON21002Z	覆盖动物
3 mL 注射器	Medline	SYR103010	术后给予液体治疗
显微外科手术器械套装，Integra	Miltex	95042-540	手术器械：普通金属窥器、双头探针、McPherson-Vannas直头虹膜剪、直头虹膜剪
止血钳 - 微型雅各布森-蚊式	Miltex	17-2602	蚊子
盐酸丁丙诺啡 0.3 mg/mL	Par制药	NDC 42023-179-01	疼痛缓解
库利-梅奥弯剪	皮林	352090	大型剪刀
杰拉尔德组织镊	皮林	351900	镊子
旺格斯特滕组织镊	皮林	342929	无创镊
薄壁血管针持	皮林	354962DG	持针器
响尾蛇亚科	Sigma-Aldrich	C2401-1G	MCT
Surflash 20 G 静脉导管	Terumo	SR*FF2051	器官采集期间的压力读数
ADVantage PV系统配合1.2 Fr导管	Transonic Inc	ADV500	记录肺动脉和右心室压力
中号止血夹	Weck	523700	结扎血管
打开结扎夹施夹器；中号，弧形	Weck Horizon	237081	止血夹施放器
手术显微镜	蔡司 OPMI MD	1808	放大倍数