建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。
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摘要
摘要
本研究采用大脑中动脉（MCA）阻塞小鼠模型来研究脑缺血-再灌注损伤。一种可重复且可靠的动物模型有助于探讨脑缺血-再灌注的病理生理机制，并为卒中患者潜在治疗策略的确定提供依据。C57BL/6小鼠 Willis环解剖结构的个体差异会影响脑缺血损伤后的梗死体积。研究表明，远端大脑中动脉阻塞（MCAO）可克服这一问题，产生稳定的梗死范围。在本研究中，我们通过阻断右侧大脑中动脉的血流，建立一种双血管阻塞的脑缺血-再灌注小鼠模型。我们对右侧大脑中动脉和右侧颈总动脉（CCA）进行远端结扎，并在一定时间的缺血后恢复血流。该缺血-再灌注损伤可导致稳定大小的梗死灶及行为功能障碍。外周免疫细胞在24小时的浸润期内进入缺血脑组织。此外，再灌注时间越长，皮质区域的神经元丢失越少。因此，该双血管阻塞模型适用于研究脑缺血后灌注期间的免疫反应及神经元恢复过程。
引言
脑缺血-再灌注小鼠模型是研究缺血性脑损伤病理生理机制最常用的实验方法之一1。由于脑缺血-再灌注会激活外周免疫系统，导致外周免疫细胞浸润至缺血脑组织并引发神经元损伤2。因此，建立一种可靠且可重复的、能够模拟脑缺血-再灌注过程的小鼠模型，对于理解脑卒中的病理生理机制至关重要。
C57BL/6J (B6) 小鼠是脑卒中实验中最常用的品系，因其易于进行遗传操作。目前有两种常见的大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/reperfusion）模型可用于模拟脑缺血-再灌注状态。第一种是近端大脑中动脉阻塞的血管内线栓模型，该方法采用硅胶包被的线栓经血管内阻断大脑中动脉（MCA）的血流，随后移除线栓以恢复血流3。短暂的阻塞时间会导致皮层下区域出现病灶，而较长时间的阻塞则会引起皮层和皮层下区域的梗死。第二种是远端大脑中动脉阻塞的结扎模型，该方法通过血管外结扎大脑中动脉和颈总动脉（CCA）以减少大脑中动脉的血流，之后通过移除缝线和动脉瘤夹来恢复血流4。在此模型中，梗死主要发生在皮层区域，且动物死亡率较低。由于大脑中动脉阻塞/再灌注的结扎模型需要进行开颅手术以暴露远端大脑中动脉部位，因此该部位易于确认，并且在手术过程中可直接观察远端大脑中动脉血流是否被有效阻断。
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方案
中国台湾中央研究院和台北医学大学的机构动物护理与使用委员会已批准本实验动物使用方案。
1. 大脑中动脉闭塞/再灌注模型
- 在手术前，让小鼠自由饮水和进食。
- 将手术器械进行高压灭菌，并使用70%乙醇对手术台和设备进行消毒。佩戴外科口罩和无菌手套。若在同一实验中需进行多只小鼠手术，可使用干式玻璃珠灭菌器对手术器械进行再次灭菌。
- 通过腹腔注射0.8%水合氯醛，对8至12周龄（体重：25–30 g）的小鼠进行麻醉。确保麻醉后小鼠无足底反射（通过用力捏压脚趾测试确认）。
- 在小鼠麻醉期间，使用兽用眼膏以防止角膜干燥。
- 使用无创血压系统监测小鼠的血压。
- 使用生理监测系统监测其直肠温度和动脉血气，并将体温维持在36.5 ± 0.5 °C。
- 皮下注射预防性抗生素（头孢唑林25 mg/kg）8。
- 将小鼠仰卧位放置于加热垫上。
- 使用电推剪剃除小鼠颈部腹侧以及右眼与右耳之间区域的毛发，以暴露皮肤。
- 使用脱毛膏清除小鼠体表残余毛发，并交替使用聚维酮碘和70%乙醇对手术区域进行消毒。
- 使用虹膜剪在颈部正中线处剪开约1 cm长的切口。
- 使用虹膜镊小心分离颈总动脉（CCA），避免损伤迷走神经。
- 使用5-....
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结果
该MCAO/再灌注操作在右侧大脑中动脉（MCA）附近产生皮层梗死，并导致行为功能缺陷。通过延长结扎时间，在右侧MCA区域的大脑皮层中产生了不同程度的缺血诱导梗死体积（图1A、B）和神经元丢失（图1C、D）。该MCAO/再灌注损伤在MCAO/再灌注后48小时显著降低了动物的运动活动能力（图2）。此外，大量外周免疫细胞（CD45high细胞）在脑缺血-再灌注后也浸润至缺血脑组织（同侧半球）（图3）。我们还比较了双血管闭塞模型与MCAO模型，发现这两种模型的梗死体积无显著差异（图4）。在脑缺血-再灌注的双血管闭塞小鼠模型中，死亡率较低（<5%）。若手术过程中发生过度出血，我们将这些小鼠排除.......
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讨论
大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/reperfusion）小鼠模型是一种常用于模拟人类短暂性脑缺血的动物模型。该动物模型可用于转基因小鼠和基因敲除小鼠品系，以研究脑卒中的病理生理机制。实验方案中有多个步骤尤为关键。（1）在颅骨上钻孔时必须小心使用微型钻头，操作不当极易引起大脑中动脉（MCA）出血。（2）应避免损伤大脑中动脉，并在结扎操作前后防止出血。MCA的损伤会影响缺血脑组织的再灌注程度7。MCAO术后必须检查MCA的再灌注状态。可通过激光多普勒血流仪分析MCA的血流阻断与恢复情况。（3）在分离颈总动脉（CCA）过程中，应避免CCA出血。（4）分离CCA时不得损伤迷走神经，否则可能增加梗死面积及死亡概率。（5）小鼠体温应维持在36.5 ± 0.5 °C。高热会增大梗死面积并提高死亡概率11，而低温则可减少脑缺血后的梗死体积12。
该MCAO/再灌注模型的重要意义在于能够产生高度可重复的皮层梗死和行为功能缺损
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受中国台湾科技部（MOST 106-2320-B-038-024、MOST 105-2221-E-038-007-MY3 和 MOST 104-2320-B-424-001）及台北医学大学医院（107TMUH-SP-01）资助。本手稿经 Wallace Academic Editing 编辑润色。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 骨剪 | Diener | Friedman | |
| 布托啡诺 | Sigma | B-044 | |
| 头孢唑林 | Sigma | 1097603 | |
| 水合氯醛 | Sigma | C8383 | |
| 解剖显微镜 | Nikon | SMZ-745 | |
| 电动剪毛器 | Petpro | ||
| 10% 甲醛 | Sigma | F5304 | |
| 干珠灭菌器（Germinator） | Braintree Scientific | ||
| 虹膜镊 | Karl Klappenecker | 10 cm | |
| 虹膜剪 | Diener | 9 cm | |
| 直型虹膜剪 | Karl Klappenecker | 11 cm | |
| 微型钻机 | Stoelting | FOREEDOM K.1070 | |
| 微剪刀-Vannas型 | HEISS | H-4240 | 刀头7mm，全长8 cm |
| 小鼠脑组织切片模具 | World Precision Instruments | ||
| 无创血压监测系统 | Muromachi | MK-2000ST | |
| 手术剪（直型） | Karl Klappenecker | 14 cm | |
| 生理监测系统 | Harvard Apparatus | ||
| 剃刀刀片 | Ever-Ready | ||
| Stoelting啮齿类动物保温装置 | Stoelting | 53810 | 加热垫 |
| 缝合夹 | Stoelting | ||
| 镊子 | IDEALTEK | No.3 | |
| Vetbond | 3M | 15672 | 外科粘合胶 |
| 10-0缝合线 | UNIK | NT0410 | |
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | Sigma | T8877 |
参考文献
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11(2011).
- Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology.
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重印与许可
