脑缺血再灌注的双血管闭塞小鼠模型

脑缺血再灌注小鼠模型是研究缺血所致脑损伤1的最常用的实验方法之一.由于脑缺血再灌注激活外周免疫系统, 外周免疫细胞浸润到缺血性脑, 并造成神经元损伤²。因此, 一个可靠的和可复制的小鼠模型, 模仿脑缺血再灌注是必要的, 以了解中风的病理生理学。

c57bl/6j (b6) 小鼠是中风实验中最常用的菌株, 因为它们很容易被基因操纵。有两种常见的模拟脑缺血再灌注状况的 mcao·再灌注模型。第一种是近端 mcao 的腔内长丝模型, 其中采用硅涂层长丝对 mca 中的血流进行血管内闭塞;随后将闭塞的长丝取出, 以恢复血液流动³。短的闭塞持续时间会导致皮质下区域的病变, 而较长的闭塞持续时间会导致皮质和皮质下区域的梗塞。第二个模型是远端 mcao 的结扎模型, 它包括 mca 和 cca 的血管外结扎, 以减少通过 mca 的血液流动, 之后通过切除缝合线和动脉瘤^{夹 4}恢复血液流动。在这种模型中, 皮质区域发生梗死, 死亡率较低。由于 mcao\ 再灌注模型的结扎需要颅骨切除术来暴露远端 mca 的部位, 因此可以很容易地确认该部位, 并检查在手术过程中远端 mca 的血流是否中断是很简单的。

b6 小鼠在威利斯圆圈的解剖结构上表现出相当大的变化;这可能会影响脑缺血再灌注^{5,6, 7 后}的梗死体积。目前, 这个问题可以通过远端 mca⁸的结扎来解决。在这项研究中, 我们建立了一种方法, 以闭塞 mca 血流和使再灌注后预定的缺血期。脑缺血再灌注模型的双血管闭塞通过右远端 mca 和右 cca 的结扎, 引起 mca 区域的短暂性缺血, 在一定时期的缺血后恢复血液流动。这种 mcao\ 再灌注模型诱导了一个大小稳定的梗塞, 在缺血性脑中的大量脑浸润免疫细胞, 并在脑缺血再灌注⁴后的行为缺陷。

中央研究院和台北医科大学的机构动物护理和使用委员会批准了这一实验动物使用协议。

1. mcao"再灌注模型

1. 为老鼠提供免费用水和食物, 直到手术。
2. 高压灭菌手术工具, 并使用70% 乙醇对手术台和设备进行消毒。戴外科口罩和无菌手套。如果在一个实验中进行多个鼠标手术, 请使用干珠消毒器对手术工具进行再消毒。
3. 通过腹腔注射, 使用0.8% 的水合氯醛, 对8至12周大的小鼠 (质量: 25–30克) 进行麻醉。麻醉后, 确保麻醉鼠标没有踏板反射 (使用牢固的脚趾捏测试)。
4. 使用兽医软膏, 以防止眼睛干燥的小鼠, 而它是在麻醉。
5. 使用无创血压系统来监测小鼠的血压。
6. 使用生理监测系统来监测直肠温度和动脉血气。将体温保持在36.5±0.5°c。
7. 皮下注射预防性抗生素 (25 mgkg 头孢唑啉)⁸。
8. 将鼠标放在加热垫上的仰角位置。
9. 使用电动剪子在腹侧颈部区域以及右眼和右耳之间的区域剃须鼠标皮毛来暴露皮肤。
10. 使用脱毛霜清除老鼠体内的皮毛, 并用聚二酮碘和70% 乙醇对手术部位进行交替消毒。
11. 用虹膜剪刀在脖子上切一个1厘米长的中线切口。
12. 使用虹膜钳仔细解剖没有迷走神经的 cca, 而不会造成身体伤害。
13. 使用5-0 丝缝线分离 cca。
14. 在右眼和右耳之间的中点做一个0.3 厘米的头皮切口。
15. 用微剪刀切割胫骨肌肉, 露出受热骨和鳞状骨。
16. 在立体解剖显微镜下, 使用微钻头直接在右侧远端 mca 上创建一个直径为2毫米的孔。
17. 使用10-0 缝合线将右侧远端 mca 的躯干结扎。
18. 用动脉瘤夹闭塞右侧 cca。
19. 缺血10分钟或40分钟后, 取出动脉瘤夹和缝合线, 以恢复 mca 和 cca 的血液流动。
20. 使用缝合夹密封头部的皮肤切口。
21. 用单一缝合线密封颈皮肤切口, 然后用缝合线或钉⁹缝合颈部皮肤。
22. 皮下注射丁丙诺非 (0.1 mg/kg), 用于止痛⁹。
23. 将鼠标的体温保持在36.±0.5°c 的加热垫上, 直到它从麻醉中完全恢复。在完全康复之前, 不要将接受手术的动物归还其他动物的陪伴。在动物恢复足够的意识之前, 不要让它无人看管。
24. 将鼠标放入高压灭菌的保持架中, 以便它在完全恢复后可以自由地进入水和咀嚼。

2. 用 2, 3, 5-三苯基四唑氯化钠染色

1. 通过腹腔注射, 将0.3% 的水合氯醛对小鼠进行麻醉。
2. 使用操作剪刀使动物斩首。
3. 用虹膜剪刀暴露头骨, 在头部皮肤上做一个切口。
4. 使用手术剪刀切割额骨的前部。
5. 用虹膜剪刀沿着矢状缝合线切割头骨。
6. 使用骨龙骨推开额骨和顶叶骨, 露出大脑。
7. 使用虹膜钳解剖大脑。
8. 使用鼠标大脑基质和剃须刀片获得2毫米冠状切片。
9. 在37°c 下, 用1x 磷酸盐缓冲盐水中的 2% 2, 3, 5-三苯基四唑氯化物 (ttc), 将脑片染色10分钟。
10. 用10% 的福尔拉林冲洗大脑2倍。
11. 在室温下将大脑固定在10% 的福尔拉林中, 时间为24小时。

3. 梗死大小的测量

1. 在干净的塑料滑梯上排列部分, 并将部分从屋顶定位到尾端。
2. 使用扫描仪扫描幻灯片。放置一个公制标尺, 并确保它在扫描的图像中可见。翻转幻灯片并扫描背面。
3. 使用 imagej 软件计算每个部分的梗死面积。
   1. 打开图像文件并设置图像的比例。
   2. 使用徒手选择来选择梗死区域。
   3. 使用感兴趣的区域 (roi) 管理器来衡量感兴趣的区域。
4. 求和每个部分的梗死面积, 并将结果乘以截面厚度, 以估计总梗死量。

4. 统计分析

1. 使用石墨垫棱镜6来确定与学生的t测试的统计意义。
   注: 条形图上的误差线表示平均值 (sam) 的标准误差。
2. 使用 g * power 3.1 计算适当的样本大小并执行功率分析¹⁰。

这种 mcao\ 再灌注程序在右 mca 附近产生了皮质梗塞, 并造成了行为缺陷。通过增加结扎时间, 在右 mca 区域的大脑皮层中产生了不同程度的缺血引起的梗死体积 (图 1a、b) 和神经元丢失 (图 1c, d)。这种 mcao\ 再灌注损伤减少了动物在 mcao\ 再灌注后48小时的运动活动 (图 2)。大部分外周免疫细胞 (cd45高细胞) 也在脑缺血再灌注后浸润缺血性脑 (同侧半球) (图 3)。此外, 我们还将这种双船遮挡模型与 mcao 模型进行了比较, 发现这两个模型的梗死体积没有明显差异 (图 4)。死亡率低 (lt;5)在双血管闭塞小鼠脑缺血再灌注模型中。如果手术过程中出现了过度出血, 我们将小鼠排除在进一步分析之外。正确遵循手术后, 由于颅骨切除术或 mca 出血过多, 动物排斥率不到15%。仅右 mca 或 cca 的闭塞并不会引起梗死。

图 1: 血管闭塞的长度与血管体积和神经元丢失呈正相关.(a) 在 mcao·再灌注24小时后, 小鼠脑片的典型 ttc 污渍。mcao 的持续时间为10或 40分钟, 所显示的数据代表了三个独立的实验。(b) 梗死量的量化。误差线表示 sm;n = 8;*p < 0.05。(c) 用免疫组织化学方法测定 immunohistochemistry 再灌注后 24小时 b6 脑中 map2 的表达。在大脑部分的 map2 染色的代表性图像中, map2-负区域被虚线所包围。(d) map2 负区域的量化。map2-负面积 (%) = 同侧 map2 负面积/对侧半球 x 100; n = 3; * p < 0.05。

图 2: 脑缺血再灌注后的体外循环活性降低.(a) 对 mcao·再灌注48小时后的生物活性进行了分析。mcao 的持续时间为40分钟。在一次露天分析中记录了60分钟的数据。使用 CleverSys topscan 1.0 分析了老鼠的跟踪距离。假对照组由在没有 mca 或 cca 闭塞的情况下接受手术的小鼠组成。(b) 对假小鼠和 mcao·再灌注小鼠移动的距离进行量化。数据以平均± sem 的形式提供;n = 7;*p < 0.05。请点击这里查看此图的较大版本.

图3:脑缺血再灌注后外周免疫细胞浸润到缺血半球.(a) 采用流式细胞仪分析了流式细胞仪分析了同侧和对侧半球脑浸润免疫细胞 (cd45高细胞), 在 mcao·再灌注后24小时。大脑浸润免疫细胞的分离已经在之前的一项研究4中描述过。mcao 的持续时间为 40分钟 (b) 在 mcao/再灌注后24小时对同侧和对侧半球的脑浸润免疫细胞进行定量。数据以平均± sem 的形式提供;n = 4;*p < 0.05。

图 4: mcao-和 mcao"再灌注损伤之间的梗死体积没有差异.(a) 在 mcao 之后24小时内, 小鼠脑片的典型 ttc 污渍。在 mcao 实验组中, 正确的 mca 使用容器尾流永久截断, 而正确的 cca 被过渡结扎40分钟。在 mcao只能再灌注 (mcaosep) 实验组中, 该程序如协议第1节所述。mcao 的持续时间为 40分钟 (b) 梗死体积的定量。数据以平均± sem 的形式提供;n = 7。

表 1: 不同实验的梗死体积和变异性的比较.在三个独立实验的 mcao·再灌注后, 在24小时内确定了梗死体积。mcao 的持续时间为 40分钟, sd = 标准偏差;n = 每个实验使用的鼠标数。

作者没有什么可透露的。