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方法文章

双血管阻断小鼠脑缺血-再灌注模型

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DOI：

10.3791/59078

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2019年3月1日

 ,  , 
1Research Center of Translational Imaging, College of Medicine, Taipei Medical University, 2Radiogenomic Research Center, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 3Department of Radiology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Medical Imaging, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 5Department of Medical Research, Taipei Medical University Hospital, Taipei Medical University, 6Department of Surgery, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Division of General Surgery, Department of Surgery, Taipei Medical University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。

摘要

本研究采用大脑中动脉（MCA）阻塞小鼠模型来研究脑缺血-再灌注损伤。一种可重复且可靠的动物模型有助于探讨脑缺血-再灌注的病理生理机制，并为卒中患者潜在治疗策略的确定提供依据。C57BL/6小鼠 Willis环解剖结构的个体差异会影响脑缺血损伤后的梗死体积。研究表明，远端大脑中动脉阻塞（MCAO）可克服这一问题，产生稳定的梗死范围。在本研究中，我们通过阻断右侧大脑中动脉的血流，建立一种双血管阻塞的脑缺血-再灌注小鼠模型。我们对右侧大脑中动脉和右侧颈总动脉（CCA）进行远端结扎，并在一定时间的缺血后恢复血流。该缺血-再灌注损伤可导致稳定大小的梗死灶及行为功能障碍。外周免疫细胞在24小时的浸润期内进入缺血脑组织。此外，再灌注时间越长，皮质区域的神经元丢失越少。因此，该双血管阻塞模型适用于研究脑缺血后灌注期间的免疫反应及神经元恢复过程。

引言

脑缺血-再灌注小鼠模型是研究缺血性脑损伤病理生理机制最常用的实验方法之一1。由于脑缺血-再灌注会激活外周免疫系统，导致外周免疫细胞浸润至缺血脑组织并引发神经元损伤2。因此，建立一种可靠且可重复的、能够模拟脑缺血-再灌注过程的小鼠模型，对于理解脑卒中的病理生理机制至关重要。

C57BL/6J (B6) 小鼠是脑卒中实验中最常用的品系，因其易于进行遗传操作。目前有两种常见的大脑中动脉阻塞/再灌注（MCAO/reperfusion）模型可用于模拟脑缺血-再灌注状态。第一种是近端大脑中动脉阻塞的血管内线栓模型，该方法采用硅胶包被的线栓经血管内阻断大脑中动脉（MCA）的血流，随后移除线栓以恢复血流3。短暂的阻塞时间会导致皮层下区域出现病灶，而较长时间的阻塞则会引起皮层和皮层下区域的梗死。第二种是远端大脑中动脉阻塞的结扎模型，该方法通过血管外结扎大脑中动脉和颈总动脉（CCA）以减少大脑中动脉的血流，之后通过移除缝线和动脉瘤夹来恢复血流4。在此模型中，梗死主要发生在皮层区域，且动物死亡率较低。由于大脑中动脉阻塞/再灌注的结扎模型需要进行开颅手术以暴露远端大脑中动脉部位，因此该部位易于确认，并且在手术过程中可直接观察远端大脑中动脉血流是否被有效阻断。

B6小鼠的Willis环解剖结构存在显著个体差异；这可能影响脑缺血-再灌注后梗死体积的稳定性5,6,7。目前，该问题可通过结扎远端大脑中动脉（MCA）加以克服8。在本研究中，我们建立了一种阻断MCA血流并在预定缺血时间后实现再灌注的方法。通过结扎右侧远端MCA和右侧颈总动脉（CCA），构建双血管阻塞的脑缺血-再灌注模型，从而诱导MCA供血区域的短暂性缺血，并在一定时间缺血后恢复血流。该MCAO/再灌注模型可产生稳定大小的梗死灶、大量浸润缺血脑组织的免疫细胞，以及脑缺血-再灌注后的神经功能行为缺陷4。

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方案

中国台湾中央研究院和台北医学大学的机构动物护理与使用委员会已批准本实验动物使用方案。

1. 大脑中动脉闭塞/再灌注模型

  1. 在手术前，让小鼠自由饮水和进食。
  2. 将手术器械进行高压灭菌，并使用70%乙醇对手术台和设备进行消毒。佩戴外科口罩和无菌手套。若在同一实验中需进行多只小鼠手术，可使用干式玻璃珠灭菌器对手术器械进行再次灭菌。
  3. 通过腹腔注射0.8%水合氯醛，对8至12周龄（体重：25–30 g）的小鼠进行麻醉。确保麻醉后小鼠无足底反射（通过用力捏压脚趾测试确认）。
  4. 在小鼠麻醉期间，使用兽用眼膏以防止角膜干燥。
  5. 使用无创血压系统监测小鼠的血压。
  6. 使用生理监测系统监测其直肠温度和动脉血气，并将体温维持在36.5 ± 0.5 °C。
  7. 皮下注射预防性抗生素（头孢唑林25 mg/kg）8。
  8. 将小鼠仰卧位放置于加热垫上。
  9. 使用电推剪剃除小鼠颈部腹侧以及右眼与右耳之间区域的毛发，以暴露皮肤。
  10. 使用脱毛膏清除小鼠体表残余毛发，并交替使用聚维酮碘和70%乙醇对手术区域进行消毒。
  11. 使用虹膜剪在颈部正中线处剪开约1 cm长的切口。
  12. 使用虹膜镊小心分离颈总动脉（CCA），避免损伤迷走神经。
  13. 使用5-0丝线结扎并隔离颈总动脉（CCA）。
  14. 在右眼与右耳之间的中点处，于头皮上做一个0.3 cm长的切口。
  15. 使用显微剪剪开颞肌，暴露颧骨和鳞状骨。
  16. 在体视显微镜下，使用微型钻头在右侧远端大脑中动脉（MCA）正上方钻一个直径为2 mm的孔。
  17. 使用10-0缝线结扎右侧远端大脑中动脉（MCA）主干。
  18. 使用无创动脉瘤夹夹闭右侧颈总动脉（CCA）。
  19. 缺血10分钟或40分钟后，移除动脉瘤夹和缝线，以恢复大脑中动脉（MCA）和颈总动脉（CCA）的血流。
  20. 使用缝线夹封闭头部皮肤切口。
  21. 使用 单根缝线缝合颈部皮肤切口，随后用缝线或钉合器关闭颈部皮肤9。 
  22. 皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）以缓解疼痛9。
  23. 将小鼠置于加热垫上，维持体温在36.5 ± 0.5 °C，直至其完全从麻醉中恢复。在小鼠完全恢复前，不得将其放回与其他动物同笼饲养，且在其恢复足够意识前不得无人看护。
  24. 待小鼠完全恢复后，将其放入已灭菌的笼盒中，使其可自由饮水和进食。

2. 使用2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色

  1. 通过腹腔注射0.8%水合氯醛麻醉小鼠。
  2. 使用手术剪将动物断头。
  3. 使用虹膜剪在头部皮肤上做切口以暴露颅骨。
  4. 使用手术剪剪开额骨前部。
  5. 使用虹膜剪沿矢状缝剪开颅骨。
  6. 使用咬骨钳推开额骨和顶骨，暴露脑组织。
  7. 使用虹膜镊分离脑组织。
  8. 使用小鼠脑切片模具和刀片获取2 mm厚的冠状切片。
  9. 在37 °C条件下，用1×磷酸盐缓冲液中的2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）对脑切片染色10分钟。
  10. 用10%福尔马林冲洗脑组织两次。
  11. 在室温下用10%福尔马林固定脑组织24小时。 

3. 梗死面积的测量

  1. 将切片放置在干净的塑料载玻片上，并按从头端到尾端的方向排列切片。
  2. 使用扫描仪扫描载玻片。放置一把公制尺子，确保其在扫描图像中可见。将载玻片翻转后，扫描其背面。
  3. 使用 ImageJ 软件计算每个切片的梗死面积。
    1. 打开图像文件，并为图像设置比例尺。
    2. 使用自由手工具选择梗死区域。
    3. 使用感兴趣区域（ROI）管理器测量目标区域的面积。
  4. 将每个切片的梗死面积相加，再乘以切片厚度，以估算总梗死体积。

4. 统计分析

  1. 使用 GraphPad Prism 6 通过学生 t 检验确定统计学显著性。
    注意：柱状图上的误差线代表均值的标准误（SEM）。
  2. 使用 G*Power 3.1 计算合适的样本量并进行功效分析10。

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结果

该MCAO/再灌注操作在右侧大脑中动脉（MCA）附近产生皮层梗死，并导致行为功能缺陷。通过延长结扎时间，在右侧MCA区域的大脑皮层中产生了不同程度的缺血诱导梗死体积（图1A、B）和神经元丢失（图1C、D）。该MCAO/再灌注损伤在MCAO/再灌注后48小时显著降低了动物的运动活动能力（图2）。此外，大量外周免疫细胞（CD45high细胞）在脑缺血-再灌注后也浸润至缺血脑组织（同侧半球）（图3）。我们还比较了双血管闭塞模型与MCAO模型，发现这两种模型的梗死体积无显著差异（图4）。在脑缺血-再灌注的双血管闭塞小鼠模型中，死亡率较低（<5%）。若手术过程中发生过度出血，我们将这些小鼠排除...

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讨论

大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/reperfusion）小鼠模型是一种常用于模拟人类短暂性脑缺血的动物模型。该动物模型可用于转基因小鼠和基因敲除小鼠品系，以研究脑卒中的病理生理机制。实验方案中有多个步骤尤为关键。（1）在颅骨上钻孔时必须小心使用微型钻头，操作不当极易引起大脑中动脉（MCA）出血。（2）应避免损伤大脑中动脉，并在结扎操作前后防止出血。MCA的损伤会影响缺血脑组织的再灌注程度7。MCAO术后必须检查MCA的再灌注状态。可通过激光多普勒血流仪分析MCA的血流阻断与恢复情况。（3）在分离颈总动脉（CCA）过程中，应避免CCA出血。（4）分离CCA时不得损伤迷走神经，否则可能增加梗死面积及死亡概率。（5）小鼠体温应维持在36.5 ± 0.5 °C。高热会增大梗死面积并提高死亡概率11，而低温则可减少脑缺血后的梗死体积12。

该MCAO/再灌注模型的重要意义在于能够产生高度可重复的皮层梗死和行为功能缺损

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究受中国台湾科技部（MOST 106-2320-B-038-024、MOST 105-2221-E-038-007-MY3 和 MOST 104-2320-B-424-001）及台北医学大学医院（107TMUH-SP-01）资助。本手稿经 Wallace Academic Editing 编辑润色。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
骨剪DienerFriedman
布托啡诺SigmaB-044
头孢唑林Sigma1097603
水合氯醛SigmaC8383
解剖显微镜NikonSMZ-745
电动剪毛器Petpro
10% 甲醛SigmaF5304
干珠灭菌器（Germinator）Braintree Scientific
虹膜镊Karl Klappenecker10 cm
虹膜剪Diener9 cm
直型虹膜剪Karl Klappenecker11 cm
微型钻机StoeltingFOREEDOM K.1070
微剪刀-Vannas型HEISSH-4240刀头7mm，全长8 cm
小鼠脑组织切片模具World Precision Instruments
无创血压监测系统MuromachiMK-2000ST
手术剪（直型）Karl Klappenecker14 cm
生理监测系统Harvard Apparatus
剃刀刀片Ever-Ready
Stoelting啮齿类动物保温装置Stoelting53810加热垫
缝合夹Stoelting
镊子IDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672外科粘合胶
10-0缝合线UNIKNT0410
2,3,5-三苯基氯化四氮唑SigmaT8877

参考文献

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