方法文章

改进 x 射线激光时分辨序列飞秒晶体学微晶的高粘度挤出

DOI：

10.3791/59087

⸱

2019年2月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology and Chemistry - Laboratory for Biomolecular Research, Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division - SwissFEL, Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Department of Biology, ETH Zürich

本文内容

摘要

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时间解析的飞秒晶体学实验的成功取决于有效的样品传递。在这里, 我们描述了从高粘度微挤压喷射器中优化细菌视紫红质微晶挤出的方案。该方法依赖于样品同质化与一种新的三向耦合器和可视化与高速相机。

摘要

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在 x 射线自由电子激光器 (xfels) 的连续飞秒晶体学实验 (sfx) 中, 高粘度微挤出喷射器大幅降低了样品消耗。一系列使用光驱动质子泵细菌视灯相的实验进一步确定了这些注射剂作为为时间分辨的串行飞秒晶体学 (tr-sfx) 提供晶体的首选, 以解决结构变化。光激活后的蛋白质。为了获得高质量的多个结构快照, 必须收集大量数据, 并确保每个泵浦激光脉冲之间的晶体间隙。在这里, 我们详细介绍了我们如何优化细菌视紫红素微晶的挤出, 为我们最近在 linac 相干光源 (lcls) 进行的 tr-sfx 实验。该方法的目标是优化挤出, 以实现稳定和连续的流动, 同时保持高密度的晶体, 从而提高 tr-sfx 实验中收集数据的速度。我们通过使用一种新型的三向注射器耦合装置制备具有均匀分布的晶体的脂质立方相来实现这一目标, 然后根据高速对挤出稳定性的测量调整样品组成。摄像机设置。该方法可以调整, 以优化其他微晶的流动。该设置将提供给新的瑞士免费电子激光设施的用户。

引言

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串行飞秒晶体学 (sfx) 是一种结构生物学技术, 利用 x 射线自由电子激光器 (xfel) 的独特特性, 从数千颗微米大小的晶体中确定室温结构, 同时超过大多数晶体。辐射损伤由 "衍射在破坏之前" 原则1,2,3。

在 sfx (TR-SFX) 的时间解析扩展中, 来自 xfel 的飞秒脉冲用于研究蛋白质4,5的结构变化。感兴趣的蛋白质是用光学激光 (或另一个活动触发器) 激活的, 就在 xfel 在泵-探针设置中被 xfel 击中之前。通过精确控制泵与探针脉冲之间的延迟, 可以在不同的状态下捕获目标蛋白。分子电影的结构变化超过十一个数量级的时间显示了新的 xfel 源的力量, 研究几个蛋白质靶标 6,7,8, 9, 10、

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方案

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1. 蛋白质晶体样品制备

  1. 在样品注射前大约 30分钟, 将50μl 的基于晶体的单油蛋白基 lcp 装入100μl 注射器中。
  2. 用于在大气压力下注射: 将10μl 的液体石蜡装入第二个注射器的背面。垂直按住注射器, 排出注射器中的气泡。
    1. 用于注入真空环境: 将5μl 的 mag 7.9 和5μl 的液体石蜡加载到第二个注射器的背面。垂直按住注射器, 排出注射器中的气泡。
  3. 用石蜡与 mag 7.9 连接注射器到标准的注射器耦合器, 轻轻按压柱塞, 将空气从耦合器中清除, 直到在耦合器针头处可见少量 (& lt;1 μl)。
  4. 将样品注射器连接到注射器耦合器, 注意不要在样品中引入任何空气。通过多次通过耦合器将样品材料传递到脂肪-石蜡中。
  5. 将20μl 预混 lcp (27% peg, 100 mm sorensen ph 5.6 + mo) 加载到另一个100μl 注射器中。根据需要去除气泡。
  6. 从耦合器中取出空注射器, 并使用标准注射器耦合器将预混 lcp 连接到含有注射器的晶体上。通过耦合器将样品传递100次。
    注: 样品混合可能会使样品稍微加热46。在样品温度可以保持合理稳定的情况下, 应以较慢的速度进行混合。
  7. 根据光源检查样品的透明度。如果形成了明确的齐次 lcp, 请转到步骤1.9。
  8. 要将样品放入立方相....

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结果

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此处描述的过程 (图 3) 的理想起始材料是将微晶高密度集成到喷射器的粘性载体介质中。该程序要求每个制备过程中大约有50μl 的含晶载流子。它们可以直接在 lcp 中生长, 就像这里使用的 br9, 10 一样, 例如 (图 4), 也可以使用传统蒸汽扩散设置中生长的晶体进行制备。在 ishchenko 等人 (2016年)37中可以找到直接在气密注射器中结晶的优秀视频指南。使用 br, 晶体板的理想直径约为 20μm, 这是在衍射功率和泵浦激光器的均匀激活之间的一个很好的妥协。使用上述协议制备的蛋白质晶体被用来收集质子泵 br 上的 tr-sfx 数据, 这些数据揭示了光子吸收后发生的超快变化 (图 5)。

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讨论

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tr-sfx 方法与粘性挤出喷射器已被证明是一种可行的技术,结构动力学研究细菌视紫红质 9,10 和光系统 ii13 , 现在似乎准备研究蛋白质驱动其他照片生物过程, 如光驱动离子传输或感官感知5,50。上述协议旨在最大限度地提高 TR-SFX 细菌视紫红质数据收集的成功率, 但我们相信可以作为模板, 优化其他样本的数据收集。这样, 目前因堵塞或样品挤出不良而损失的许多宝贵的波束时间, 可以在更多的时间延迟下用于收集更好的数据。

该协议中最困难、最关键的一步是添加少量的单烯烃, 将脂质基质带入立方阶段 (步骤 1.8)。困难在于相变的微妙性和过量添加单烯烃对样品的负面影响。

应对方法进行修改, 以适应不同的蛋白质晶体。这些可能与相同的添加剂或数量或.......

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披露

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提交人声明没有相互冲突的利益。

致谢

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我们感谢 gebhard schertler、rafael abela 和 chris milne 支持在 psi 使用高粘度喷射器。richard neutze 和他的团队被认可讨论时间解析的晶体学和样品交付使用高粘度喷射器。为了提供财政支助, 我们感谢瑞士国家科学基金会提供赠款31003A_141235、31003A_159558 (向 j. s.) 和 PZ00P3_174169 (向 p. n.) 提供的赠款。根据 marie-sklolowska-curie 第706号赠款协议, 该项目得到了欧洲联盟 "地平线 2020" 研究和创新方案的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蚊式LCP注射器耦合TTP实验室技术商店3072-01050
汉密尔顿注射器1710 RNR，100和微型;l汉密尔顿HA-81065
汉密尔顿注射器 1750 RNR，500 & micro;lHamiltonHA-81265
MonooleinNu-Chek Prep， Inc.M-239
7.9 MAGAvanti 极性脂质公司850534O
50% w/v PEG 2000分子尺寸MD2-250-7
石蜡（液体）Sigma-Aldrich1.07162
高速相机PhotronPhotron Mini AX
高放大倍率镜头Navitar12X 变焦镜头系统
三轴载物台ThorLabsPT3/M
光纤ThorlabsOSL2
熔融石英光纤Molex/PolymicroTSP-505375
Lite touch 插芯IDEXLT-100
ASU 高粘度注射器亚利桑那州立大学可从 Uwe Weierstall （weier@asu.edu）
HPLC 泵岛津LC-20AD
购买 电子气体调节器比例空气GP1

参考文献

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  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. B....

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