时间分辨序列飞秒晶体学实验的成功依赖于高效的样品递送。本文介绍了优化从高黏度微挤出注射器中挤出紫膜蛋白微晶的实验方案。该方法依赖于使用一种新型三通耦合器对样品进行均质化处理，并通过高速相机实现可视化观察。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
高黏度微挤出注射器显著降低了在X射线自由电子激光器（XFELs）上进行的序列飞秒晶体学实验（SFX）中的样品消耗量。一系列利用光驱动质子泵细菌视紫红质开展的实验进一步确立了这些注射器作为时间分辨序列飞秒晶体学（TR-SFX）中输送晶体的首选方案，以解析蛋白质在光激活后发生的结构变化。为了获得多个高质量的结构快照，必须收集大量数据，并确保每次泵浦激光脉冲之间晶体被充分清除。本文详细描述了我们在美国直线加速器相干光源（LCLS）开展的近期TR-SFX实验中，如何优化细菌视紫红质微晶的挤出过程。该方法的目标是在维持晶体高密度的同时，实现稳定且连续的流动，从而提高TR-SFX实验中数据采集的速率。我们通过使用一种新型三通注射器连接装置制备晶体分布均匀的脂质立方相，再结合高速相机系统对挤出稳定性进行测量，进而调整样品组成，以此实现上述目标。该方法可推广适用于其他微晶流动条件的优化。该装置将向新的瑞士自由电子激光设施的用户开放使用。
引言
X射线自由电子激光器（XFEL）的独特性质，利用数千个微米级晶体在室温下测定其结构，同时在辐射损伤发生之前完成数据采集，从而规避了大部分辐射损伤问题。 "衍射先于破坏" 原理1,2,3.
在SFX的时间分辨扩展技术（TR-SFX）中，利用XFEL的飞秒脉冲来研究蛋白质的结构变化4,5。在泵浦-探测实验装置中，目标蛋白质在被XFEL照射前，先通过光学激光（或其他活性触发方式）激活。通过精确控制泵浦脉冲与探测脉冲之间的延迟时间，可捕获目标蛋白质在不同状态下的构象。跨越十一个数量级时间尺度的结构变化分子电影，展示了新型XFEL光源在研究多种蛋白质动态过程中的强大能力6,7,8,9,10,....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 蛋白质晶体样品制备
- 在准备注射样品前约 30 分钟，将 50 µL 含晶体的以单油精为基础的脂质立方相（LCP）装入一支 100 µL 注射器中。
- 在常压下注射时：将 10 µL 液体石蜡装入第二支注射器的后端。将注射器垂直持握，排出其中的气泡。
- 在真空环境中注射时：将 5 µL MAG 7.9 和 5 µL 液体石蜡装入第二支注射器的后端。将注射器垂直持握，排出其中的气泡。
- 将装有石蜡/MAG 7.9 的注射器连接至标准注射器连接器，轻轻推动推杆，排出连接器中的空气，直至在连接器针头尖端可见少量（<1 µL）石蜡/脂质。
- 将样品注射器连接至注射器连接器，注意避免将空气引入样品中。通过多次将样品物料穿过连接器，使其与脂质/石蜡充分混合。
- 将 20 µL 预混的 LCP（27% PEG，100 mM Sorensen 缓冲液，pH 5.6 + MO）装入另一支 100 µL 注射器中。根据需要去除气泡。
- 从连接器上取下空注射器，使用标准注射器连接器将预混 LCP 与含晶体的注射器连接。将样品穿过连接器 100 次。
注意：样品混合过程可能使样品轻微升温46。应以缓慢速度进行混合，以保持样品温度相对恒定。 - 在光源下检查样品的透明度。若已形成澄清均一的 LCP，则进入步骤 1.9。
- 为使....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本实验方案（图3）的理想起始材料是高密度微晶，需将其混悬于黏性载体介质中，用于注射器进样。每次样品制备约需50 µL含晶体的载体介质。这些微晶可直接在脂质立方相（LCP）中生长，例如本文所用的细菌视紫红质（bR）9,10（图4），也可采用传统气相扩散法培养的晶体进行制备。Ishchenko 等人（2016）37 提供了在密闭注射器中直接进行结晶的优秀视频指南。对于bR，晶体片层的理想直径约为20 μm，此尺寸在衍射能力与泵浦激光均匀激发之间达到良好平衡。采用上述方案制备的蛋白质晶体，用于在bR质子泵上采集时间分辨串行飞秒晶体学（TR-SFX）数据，揭示了光子吸收后发生的超快结构变化（图5）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
采用粘性挤出喷射器的TR-SFX方法已被证明是研究紫膜质9,10和光系统II13结构动力学的有效技术，目前似乎已具备研究驱动其他光生物学过程（如光驱动离子转运或感光感知）的蛋白质的能力5,50。上述方案旨在最大限度地提高紫膜质TR-SFX数据采集的成功率，但我们认为其也可作为优化其他样品数据采集的模板。通过这种方式，目前因堵塞或样品挤出不良而浪费的宝贵机时，将可被更有效地用于在更多时间延迟点采集更高质量的数据。
该实验方案中最困难且最关键的步骤是加入少量单油酸甘油酯，以使脂质基质进入立方相（步骤1.8）。难点在于相变过程十分微妙，且当单油酸甘油酯过量时会对样品产生不利影响。
应根据不同的蛋白质晶体对实验方法进行相应调整。这些晶体可能与相同的添加剂、.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Gebhard Schertler、Rafael Abela和Chris Milne支持在PSI使用高粘性注射器。感谢Richard Neutze及其团队就时间分辨晶体学及使用高粘性注射器进行样品递送的相关讨论。在经费支持方面，我们感谢瑞士国家科学基金会提供的资助（项目编号31003A_141235、31003A_159558（授予J.S.）以及PZ00P3_174169（授予P.N.））。本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No 701646下的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蚊式 LCP 注射器耦合器 | TTP labtech 商店 | 3072-01050 | |
| Hamilton 注射器 1710 RNR，100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton 注射器 1750 RNR，500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| 单油精 | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids 公司 | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | 分子维度公司（Molecular Dimensions） | MD2-250-7 | |
| 石蜡（液态） | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| 高速相机 | Photron | Photron Mini AX | |
| 高倍放大镜头 | Navitar | 12X 变焦镜头系统 | |
| 三轴位移台 | ThorLabs | PT3/M | |
| 光纤光源 | Thorlabs | OSL2 | |
| 熔融石英光纤 | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch 套管 | IDEX | LT-100 | |
| ASU 高粘度注射器 | 亚利桑那州立大学（Arizona State University） | 可向 Uwe Weierstall (weier@asu.edu) 购买 | |
| HPLC 泵 | 岛津（Shimadzu） | LC-20AD | |
| 电子气体调节器 | Proportion Air | GP1 |
参考文献
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- B....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
