抗c-fms抗体对破骨细胞体外形成及破骨细胞前体增殖的影响

摘要

本方案包括小鼠长骨的解剖和骨髓分离，以获取骨髓巨噬细胞，并利用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）或肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导生成破骨细胞，同时可通过抗c-fms抗体（即M-CSF受体）阻断该过程。

摘要

骨重建是一个复杂的过程，涉及骨沉积和骨吸收的交替阶段。骨吸收是指破骨细胞在不同刺激下分解骨组织的过程。破骨细胞前体在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的作用下，分化为多核破骨细胞。在病理条件下，细胞因子谱发生变化，包含多种炎症性细胞因子。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是其中最重要的细胞因子之一，因其在炎症性骨溶解区域大量存在。本实验方案旨在提供一种方法，通过分离小鼠骨髓并在M-CSF以及RANKL或TNF-α的诱导下生成破骨细胞，随后使用不同浓度的抗c-fms抗体（M-CSF的受体）进行抑制。该实验突出了抗c-fms抗体在炎症性骨吸收疾病中的治疗价值。

引言

破骨细胞是高度特化的细胞，它们由造血干细胞通过多个破骨细胞前体融合而分化形成。破骨细胞对健康的骨重建至关重要，并参与类风湿性关节炎和牙周病等炎症性溶骨性疾病相关的病理性骨吸收过程¹。

破骨细胞的形成及其功能由两种关键因子介导：巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）。M-CSF和RANKL均在破骨细胞分化过程中发挥重要作用²。另一种已被证实可在体外诱导骨髓来源巨噬细胞形成破骨细胞的因子是肿瘤坏死因子α（TNF-α）^3,4,5。研究表明，TNF-α介导的破骨细胞形成在类风湿性关节炎⁶、牙周病⁷和绝经后骨质疏松症⁸等破坏性骨病所致骨溶解过程中具有关键作用。

c-fms 是 M-CSF 的膜受体，并介导其生物学作用。文献中已充分记载了 c-fms 的作用，研究表明，在关节炎模型以及 TNF-α 诱导的骨侵蚀中，给予抗 c-fms 抗体（anti-c-fms 抗体）可完全阻断破骨细胞生成，而远离炎症关节部位的破骨细胞生成仍保持活跃⁹。给予抗 c-fms 抗体还可抑制脂多糖（LPS）在小鼠颅骨中诱导的破骨细胞形成和骨吸收¹⁰，以及在 LPS 诱导的 牙周炎模型中的破骨细胞生成¹¹。 此外，抗 c-fms 抗体还能抑制正畸牙齿移动过程中由机械应力引起的牙根吸收¹²，以及与正畸牙齿移动相关的牙齿移动本身和骨吸收过程¹³。

已有报道称M-CSF具有其他对宿主免疫反应至关重要的功能。在患有细菌性肺炎的op/op小鼠中，M-CSF的缺失导致细菌负荷增加以及细菌播散至肝脏并引起肝坏死¹⁴。因此，M-CSF在抵御感染的免疫应答中具有重要作用。

本研究展示了抗c-fms抗体对体外M-CSF与RANKL或TNF-α诱导的破骨细胞形成以及M-CSF诱导的破骨前体细胞增殖的影响。本方案描述了从小鼠长骨中分离骨髓细胞的步骤，以及生成骨髓来源巨噬细胞（BMM）——即破骨细胞前体细胞——并分别通过RANKL或TNF-α两种方法诱导BMM分化为多核破骨细胞的具体操作。该方案还比较了使用抗c-fms抗体在两种方法中对破骨细胞生成过程的抑制作用。

提取骨髓并进一步生成破骨细胞前体的过程能够稳定地获得大量高纯度的破骨细胞培养物，可用于多种后续应用，例如药物筛选。本方案中使用RANKL或TNF-α诱导破骨细胞生成，可将破骨细胞生成区分为生理过程（RANKL）与病理过程（TNF-α），从而提供两种替代性实验路径，以指导选择在后续应用中更优的试剂。本方案还提供了一种方法，用于确定抗c-fms抗体的适宜浓度，以便在后续涉及骨吸收及溶骨性疾病的研究中安全使用。

方案

所有动物实验操作和动物护理均按照东北大学的规定和规章进行。

1. 小鼠后肢解剖与处理

1. 解剖前，根据容器大小，在培养皿中加入约 50 mL 的 α-MEM，并置于冰上。此培养皿将作为收集容器，直至所有骨骼解剖完成。本实验及后续实验均使用含有 10% 胎牛血清（FBS）、100 IU/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素的 α-MEM。
2. 通过吸入过量 5% 异氟烷使 C57Bl/6J 小鼠安乐死。
3. 用大头针穿过小鼠手掌和足部，将其固定于仰卧位，并用 70% 乙醇充分喷洒消毒。
4. 使用无菌手术剪刀和镊子在髋部水平做皮肤切口，并向下延伸至足部，暴露肌肉组织。
5. 切断股四头肌和腘绳肌附着于骨骼的肌腱。剥离肌肉，暴露髋关节和膝关节。准确定位这些肌腱有助于在不残留软组织的情况下将肌肉完整分离。注意不要切割到骨骼。
6. 将剪刀置于股骨头与关节腔之间，剪开以游离股骨，同时保持骨骼完整。此操作可避免暴露骨髓，从而降低污染风险。
7. 同样剪除附着于胫骨的肌肉，并在踝关节处切断胫骨，保持骨骼完整以避免污染。
8. 使用剪刀刀面和擦镜纸刮除股骨和胫骨上残留的任何软组织，并将其放入盛有置于冰上的 α-MEM 的培养皿中。

2. 小鼠后肢骨髓分离

1. 用α-MEM填充一支30 G针头的注射器。
2. 从膝关节处分离胫骨和股骨。
3. 使用剪刀从两侧剪去长骨的两端。
4. 用镊子夹住骨的中段，将针头插入骨髓腔，缓慢冲洗骨髓内容物至6 cm的培养皿中。骨将呈现白色，表明骨髓内容物已完全提取。对所有骨骼重复此操作。
5. 使用40 μm尼龙细胞滤网将骨髓提取物滤入50 mL锥形离心管中，并在300 × g 条件下离心5分钟。
6. 弃去上清液，加入5 mL α-MEM洗涤，再在300 × g 条件下离心5分钟。共洗涤两次。
7. 将沉淀重悬于10 mL α-MEM中，并使用血细胞计数板进行细胞计数，步骤如下：
   1. 取10 μL细胞悬液加入含有10 μL 0.4%台盼蓝的1.5 mL离心管中，制成1:1稀释的细胞悬液，轻轻吹打一次。
   2. 将盖玻片盖在血细胞计数板的计数室上，将染色后的细胞悬液转移至计数板边缘，依靠毛细作用使液体充满计数室，注意避免过度填充或填充不足。
   3. 将血细胞计数板置于显微镜载物台上，使用10倍物镜聚焦于中央大方格。计数被三条线包围的所有细胞。为避免重复计数，仅计数每个小方格的上侧和右侧边界上的细胞。死亡细胞呈深蓝色，不计入总数。
8. 根据后续实验应用，将细胞接种至合适的培养容器中。本实验请参照第3节操作。

3. BMM 的制备

1. 在10 cm培养皿中接种1 × 10⁷ 个细胞/10 mL，并加入M-CSF至终浓度为100 ng/mL。将细胞培养物置于37 °C、5% CO₂条件下培养3天。
2. 培养3天后，移除培养基，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）剧烈冲洗细胞两次，以去除未贴壁细胞；加入5 mL室温的含0.02%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，于37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟。
3. 通过充分吹打使细胞脱落。在显微镜下观察培养物以确认细胞是否已脱落（细胞应呈圆形并悬浮于培养基中）。若细胞仍贴壁，需重复充分吹打直至脱落。细胞脱落后，加入5 mL α-MEM以终止反应。
4. 将细胞收集至50 mL锥形离心管中，在300 x g下离心5分钟。弃上清液，并用5 mL α-MEM洗涤细胞。
5. 在300 x g下离心5分钟，将沉淀重悬于10 mL α-MEM中。
6. 按照步骤2.7.1中所述方法进行细胞计数。
7. 在10 cm培养皿中接种1 × 10⁶ 个细胞/10 mL，并加入M-CSF至终浓度为100 ng/mL。将细胞培养物置于37 °C、5% CO₂条件下培养3天。

4. 以骨髓来源巨噬细胞作为破骨细胞前体生成破骨细胞

1. 3天后，收集贴壁细胞，这些细胞代表作为破骨细胞前体的骨髓来源巨噬细胞（BMM），后续进行步骤3.2-3.7。
2. 将BMM以每孔200 μL α-MEM培养基中接种5 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中。加入RANKL，使其终浓度为50 ng/mL，或加入TNF-α，使其终浓度为100 ng/mL。向每孔中加入M-CSF，使其终浓度为100 ng/mL。
3. 向每孔中加入抗c-fms抗体，终浓度分别为0、1、10、100、1000 ng/mL。
4. 在37 °C、5% CO₂条件下培养4天。每隔一天更换一次培养基，共更换两次。

5. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

1. 孵育4天后，轻轻吸去每孔的培养基，每孔用200 μL室温1×PBS洗涤一次。
2. 每孔加入200 μL 10%福尔马林进行固定，室温孵育1小时。吸去福尔马林，每孔用去离子水洗涤3次。
3. 每孔加入200 μL含0.2% Triton X-100的PBS溶液进行通透处理，室温孵育1小时。吸去Triton X-100溶液，每孔用去离子水洗涤3次。
4. 每孔加入200 μL TRAP染色液，显微镜下观察染色情况。染色完全显色需10–30分钟。
5. 吸去染色液，每孔用去离子水洗涤3次，自然晾干。室温保存，用于后续观察。

6. 增殖实验

1. 将BMM以5 × 10³ 个细胞/200 μL α-MEM的密度接种于96孔板中作为破骨细胞前体细胞。每孔加入M-CSF，使其终浓度为100 ng/mL。
2. 加入抗c-fms抗体（终浓度分别为0、1、10、100、1,000 ng/mL），于37 °C、5% CO₂条件下孵育3天，期间不更换培养基。
3. 孵育3天后，用1× PBS洗涤细胞，每孔加入100 μL α-MEM。
4. 每孔加入10 μL细胞计数试剂盒溶液，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时，使用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度。

结果

本实验方案旨在评估抗c-fms抗体在RANKL或TNF-α存在条件下对破骨细胞形成的影响，并确定M-CSF对破骨细胞前体细胞增殖的作用。本方案提供了一种可靠的方法，可用于大量生成高纯度的破骨细胞培养物。同时，我们还提供了一种方法，用于检测抗c-fms抗体在不同培养条件下抑制破骨细胞形成的适宜浓度。

在含抗c-fms抗体的M-CSF+RANKL培养体系中，破骨细胞的形成情况如图1所示。在1、10 ng/mL抗c-fms抗体浓度下，与对照组（0 ng/mL）相比，破骨细胞数量无显著减少；而在100、1,000 ng/mL抗c-fms抗体浓度下，与对照组相比，破骨细胞数量显著减少。在含抗c-fms抗体的M-CSF+TNF-α培养体系中，破骨细胞的形成情况如图2所示。在1 ng/mL抗c-fms抗体浓度下，与对照组（0 ng/mL）相比，破骨...

讨论

在本研究中，我们探讨了抗c-fms抗体对RANKL诱导的破骨细胞形成、TNF-α诱导的破骨细胞形成以及M-CSF诱导的破骨细胞前体增殖的影响。我们发现，抗c-fms抗体在抑制RANKL诱导的破骨细胞形成、TNF-α诱导的破骨细胞形成以及M-CSF诱导的破骨细胞前体增殖过程中，其有效作用浓度各不相同。

在体外，RANKL 在 M-CSF 存在的情况下介导破骨细胞生成，而 RANK 基因敲除小鼠由于破骨细胞无法发育，会出现严重的骨硬化症¹⁵，因此 RANKL 是破骨细胞生成所必需的细胞因子，在骨稳态中具有重要的调控作用。因此，若能调控 RANKL 诱导的破骨细胞形成，则可控制骨量的减少。然而，若抑制作用过强，则无法维持骨稳态。本实验表明，抗 c-fms 抗体需达到较高浓度（100 ng/mL）才能有效减少 RANKL 诱导的破骨细胞形成。

已有研究表明，TNF-α介导的破骨细胞形成在类风湿性关节炎⁶、牙周病

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗c-Fms抗体			AFS98，一种大鼠单克隆抗小鼠c-Fms抗体（IgG2a）
TNF-αα			重组小鼠TNF-α 在本实验室制备。TNF-α 通过RT-PCR克隆cDNA片段，并将其插入pGEX-6P-1载体（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）中，以表达GST融合蛋白。GST-TNF-α 在大肠杆菌BL21细胞（Stratagene，La Jolla，CA）中表达。细胞在非变性条件下裂解，获得GST-TNF-α 使用谷胱甘肽-Sepharose柱进行纯化。根据制造商说明，通过PreScission蛋白酶（Amersham Biosciences）切除GST标签。’s 方向，并通过谷胱甘肽-Sepharose 柱去除。
RANKL	PEPROTECH	315-11	重组小鼠 sRANK 配体，来源： 大肠杆菌
M-CSF			重组人 M-CSF。CMG14 体积的 1/10–12种细胞系培养上清液，浓度为5×10⁵6 10 cm 悬浮培养皿中的细胞
α- MEM	和光		含L-谷氨酰胺和酚红
胎牛血清	Biowest	s1820-500	法国来源胎牛血清
培养皿	康宁		100 mm × 20 mm 培养皿
96孔板	赛默飞世尔科技		Nun克隆Delta表面
细胞计数试剂盒-8	日本熊本，Dojindo
酶标仪	Sunrise REMOTE；Tekan 日本，日本川崎
细胞滤筛	康宁		40 μm 尼龙
离心管	康宁		50 mL CentriStar 帽盖
Triton X-100	和光		聚氧乙烯（10）辛基苯基醚