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负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

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DOI：

10.3791/59095

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2019年1月26日

 ,  , 
1Department of Pathology and Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。

摘要

双链（ds）RNA 是 RNA 病毒感染过程中产生的复制中间体。宿主模式识别受体（PRRs），例如视黄酸诱导基因 I（RIG-I）样受体（RLRs）RIG-I 和黑色素瘤分化相关蛋白 5（MDA-5）可识别 dsRNA，从而诱导先天免疫反应。在正义链 RNA 病毒感染中，dsRNA 的形成及其细胞内分布已通过显微镜技术得到充分表征。许多负义链 RNA 病毒（包括某些沙粒病毒）在感染期间也会触发先天免疫反应。然而，人们曾认为负义链 RNA 病毒产生的 dsRNA 水平较低，这阻碍了对 PRR 识别病毒 dsRNA 过程的成像研究。此外，高致病性沙粒病毒的感染实验必须在高等级生物安全防护实验室（BSL-4）中进行。由于研究人员在 BSL-4 实验室中面临额外的技术挑战，目前对高致病性 RNA 病毒的病毒 RNA 与 PRR 之间的相互作用仍知之甚少。最近，一种最初用于泛肠道病毒检测的单克隆抗体（Mab）（克隆号 9D5）被发现能够比传统的 J2 或 K1 抗 dsRNA 抗体更敏感且特异地检测 dsRNA。本文中，我们利用 9D5 抗体描述了一种共聚焦显微镜实验方案，该方案已成功用于在单个沙粒病毒感染细胞中同时可视化 dsRNA、病毒蛋白和 PRR。该方案也适用于在 BSL-4 实验室中对高致病性沙粒病毒感染细胞中 dsRNA 与 PRR 分布的成像研究。

引言

先天免疫反应诱导的初始步骤是宿主通过模式识别受体（PRR）识别双链（ds）RNA，例如视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLR）RIG-I和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA-5）1。对于正链RNA病毒，通常可使用J2或K1抗双链RNA单克隆抗体（Mab） readily检测到双链RNA2。利用共聚焦显微镜已对小RNA病毒等正链RNA病毒中双链RNA与PRR之间的相互作用进行了表征3。然而，对于负链RNA病毒，由于缺乏高灵敏度的双链RNA抗体，PRR与双链RNA相互作用的可视化和表征一直受到限制。RNA荧光原位杂交（FISH）技术已被用于病毒RNA和PRR的可视化研究4。然而，FISH方法需要已知靶RNA序列，且可能无法与PRR共染色兼容。最近发现，最初用于泛肠道病毒感染诊断的9D5单克隆抗体（Mab）比J2 Mab更敏感，能够 readily检测负链RNA病毒感染中的双链RNA5,6。因此，9D5 Mab是一种研究负链RNA病毒复制及其PRR与病毒RNA相互作用的新型且有用的工具。

沙粒病毒是一类单链负义RNA病毒，包含多种可导致人类严重出血热疾病的病原体，例如拉沙病毒（LASV）、胡宁病毒（JUNV）和马秋波病毒（MACV）7。来自由新大陆沙粒病毒JUNV引起阿根廷出血热重症及致死病例的临床数据显示，患者血清中干扰素-α（IFN-α）水平异常升高8,9。我们已证实，致病性新大陆沙粒病毒（JUNV和MACV）能够在人单核细胞来源的树突状细胞中诱导I型干扰素（IFN）反应，而致病性旧大陆沙粒病毒LASV则不能10。此外，RIG-I是介导JUNV感染细胞产生I型干扰素反应的传感器之一11。我们还发现，蛋白激酶R（PKR）受体——传统上以其识别双链RNA（dsRNA）的功能而著称——在致病性新大陆沙粒病毒感染中被激活12。为了进一步理解沙粒病毒感染过程中病毒特异性干扰素反应的机制，我们旨在建立一种可视化病毒dsRNA与胞质模式识别受体（PRR）相互作用的实验方案。

致病性JUNV、MACV和LASV的感染实验必须在生物安全四级（BSL-4）设施中进行。因此，除了沙粒病毒感染过程中可能产生的双链RNA（dsRNA）水平较低之外，满足生物安全要求是在BSL-2实验室中对这些高致病性病毒开展成像研究的另一项技术挑战。本报告描述了一种基于共聚焦显微镜的实验方案，该方案利用9D5抗体和JUNV的Candid1#疫苗株，已成功用于在BSL-2实验室中可视化沙粒病毒感染细胞内的dsRNA、病毒蛋白和模式识别受体（PRR）。该方案同样适用于在BSL-4设施中研究致病性沙粒病毒感染期间dsRNA与PRR的细胞内分布情况。

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方案

1. A549 细胞的准备与 JUNV 感染

  1. 在感染前24小时，将2 × 105个人类肺上皮A549细胞接种于12孔板中经多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的玻璃盖玻片上。
  2. 准备150 μL JUNV13病毒液，感染复数（MOI）为每细胞1.0个蚀斑形成单位，用添加了2%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）稀释。
  3. 移除细胞培养液，向每孔含盖玻片的细胞中加入病毒接种物，在37 °C孵育1.5小时，每15分钟摇动一次培养板。
  4. 移除病毒接种物，加入1 mL添加了5% FBS和1% P/S的DMEM培养基，在37 °C孵育至预定时间点。

2. 固定与免疫染色

  1. 吸弃培养基。通过向每孔加入 1 mL 含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞。
  2. 移除 PBS。向每孔加入 1 mL 预冷至 -20 °C 的甲醇（MeOH），在 -20 °C 或干冰上孵育 15 分钟。
  3. 移除甲醇（MeOH）。
  4. 向每孔加入 1 mL PBS，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复洗涤，共洗涤 4 次。
  5. 在 1 mL 0.2% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇中，于 4 °C 轻轻振荡洗涤盖玻片上的固定细胞 5 分钟。
  6. 向每孔加入 1 mL PBS，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复洗涤步骤，共洗涤 4 次。
  7. 为检测 dsRNA 和 MDA5，将样品在 200 μL 含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的稀释液中与一抗孵育。抗-dsRNA 9D5 抗体按 1:2 稀释，抗-MDA-5 抗体按 1:250 稀释。4 °C 轻轻振荡过夜孵育。
  8. 移除一抗，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。
  9. 加入 200 μL 用 3% BSA 稀释的二抗（1:2,000 稀释），室温孵育 1 小时。
  10. 移除二抗，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。
  11. 为检测 JUNV 核蛋白（NP）和 RIG-I，加入 200 μL 用 3% BSA 稀释的偶联抗体。偶联抗-JUNV NP（AG-12）抗体按 1:1,000 稀释，室温轻轻振荡孵育 2 小时；偶联抗-RIG-I 抗体按 1:500 稀释，4 °C 轻轻振荡过夜孵育。
  12. 移除偶联抗体，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。
  13. 用 DAPI（1:1,000）在室温下轻轻振荡复染盖玻片 3 分钟。
  14. 在 1 mL 0.5% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇中，室温轻轻振荡洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
  15. 在 1 mL PBS 中洗涤 2 次，每次 5 分钟，室温轻轻振荡。
  16. 在 1 mL ddH2O 中室温轻轻振荡洗涤 1 次，持续 1 分钟。
  17. 使用封片剂将盖玻片封固于载玻片上，室温避光固化过夜。
  18. 用指甲油封片，室温晾干 1 小时。
  19. 使用共聚焦显微镜，配备 60x/1.42 数值孔径油镜，对所有样品采用相同的激光发射参数进行成像。
  20. 分析数据时，如有必要，对所有样品使用相同的线性调整方式调节亮度和对比度。

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结果

本方案用于研究RLR（RIG-I和MDA-5）与JUNV感染细胞中dsRNA的分布及共定位情况。如图1和图2所示，随着病毒感染进程的推进，dsRNA的积累随时间逐渐增加。集中的MDA-5信号（图1）和RIG-I信号（图2）均与NP和dsRNA的点状结构共定位。

JUNV 感染显微镜图像；dsRNA、MDA-5、NP 染色；与模拟感染的时间推移比较。
图 ...

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讨论

对于正义链RNA病毒和双链DNA病毒，可使用广泛使用的J2抗双链RNA抗体轻松检测到双链RNA。然而，据认为，使用相同抗体检测负义链RNA病毒产生的双链RNA时，其水平较低或低于检测限2。因此，负义链RNA病毒中病毒RNA与模式识别受体（PRR）相互作用的许多方面仍不明确。我们曾尝试使用J2抗体对沙粒病毒感染中的双链RNA进行染色，但其荧光信号与模拟感染相比无明显差异。单克隆抗体9D5最初用于泛肠道病毒检测，后被发现对双链RNA具有特异性且比J2抗体更敏感5。该抗体已成功用于检测负义链RNA病毒感染过程中产生的病毒双链RNA，包括原型沙粒病毒淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus）5,6,14。因此，我们采用单克隆抗体9D5对双链RNA、病毒核蛋白（NP）以及模式识别受体（PRRs）进行共染色，以进一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢德克萨斯大学医学分部成像核心设施以及 Maxim Ivannikov 在显微镜使用方面的协助。

本工作获得了公共卫生服务基金授予 SP 的 RO1AI093445 和 RO1AI129198 项目资助、UTMB 承诺基金 P84373（授予 CH）以及授予 EM 的 T32 AI007526 项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APEX Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒InvitrogenA10475
BSASigma AldrichA4503
DAPICell Signaling40831:1,000 稀释
驴抗兔 Alexa Fluor 594InvitrogenA-110581:2,000 稀释；批号 #: 1454437
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium）Corning10-013-CV
胎牛血清Atlanta BioS11150
玻璃显微镜载玻片Fisher12-550-15
羊抗小鼠 Alexa Fluor 488InvitrogenA-110291:2000 稀释；批号 #: 1874804
人肺上皮 A549 细胞ATCCCCL-185
甲醇FisherA412储存于 -20 °C
小鼠单克隆抗体抗 JUNV NPBEINA05-AG12与 Alexa-647 偶联，使用 1:1,000 稀释
小鼠单克隆抗体 pan-Enterovirus 9D5 试剂Millipore Sigma3361即用型；稀释至 1:2；批号 #: 3067445
含 Ca 和 Mg 的 PBSCorning21-030-CV
PDL 包被的盖玻片NeuvitroH-12-1.5-pdl
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP10144
兔单克隆抗体 MDA-5Abcamab1266301:250 稀释；批号 #: GR97758-7
重组 JUNV Candid#1 毒株实验室制备实验室制备如参考文献 13 中先前所述
与 Alexa-594 偶联的小鼠单克隆抗体 RIG-ISanta Cruzsc-3768451:1000 稀释；批号 #: AO218
Triton X-100Sigma AldrichT8787 

参考文献

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标签

RNA 9D5 PRR A549 BSL4

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