本文介绍了对一系列墨西哥洞穴鱼行为进行高通量研究以及对机械感觉系统进行活体染色的方法。这些方法采用免费软件和自制脚本，为行为学研究提供了实用且经济高效的技术方案。
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本文内容
摘要
摘要
洞穴栖居动物为适应持续黑暗且食物稀少的环境，已进化出一系列形态学和行为学特征。其中，觅食行为是研究行为特征进化功能优势的重要窗口之一。本文介绍了分析洞穴型四眼鱼（Astyanax mexicanus）振动吸引行为（VAB：一种适应性觅食行为）及其相关机械感受器成像的更新方法。此外，还提供了高通量追踪多种其他洞穴鱼行为（包括过度活跃和睡眠减少）的技术方案。洞穴鱼还表现出社交回避、重复性行为以及更高的焦虑水平。因此，洞穴鱼可作为研究进化行为的动物模型。这些方法采用免费软件和自制脚本，可推广应用于其他类型的行为研究，为商业行为追踪软件提供了实用且经济的替代方案。
引言
墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus，辐鳍鱼纲：脂鲤科）在鱼类中具有独特性，因其存在两种截然不同的形态——一种为有视力、栖息于地表水域的形态，另一种为无视力、栖息于洞穴的形态，后者由多个不同的种群组成1。尽管这两种形态在形态学和生理学上存在差异，它们仍可相互交配并产生可育后代2,3。这些可杂交的形态似乎在较短时间内迅速演化而成（约2万年）4，使其成为研究快速适应的理想模型系统。已知洞穴鱼类具有一系列不同的形态和行为特征，包括味蕾密度增加、机械感受器数量增多、对特定频率振动刺激敏感的觅食行为、过度活跃以及失眠。其中许多行为可能同时演化而来，部分行为被认为有助于在黑暗的洞穴环境中更有效地觅食5，或在黑暗且食物稀少的环境中节约能量6,7。
在许多进化模型系统中，由于大多数物种分布在复杂环境的连续梯度上，因此很难全面了解动物形态和行为如何响应环境变化。然而，Astyanax 的洞穴型与地表型在由明显生态过渡带分隔的高度差异环境中演化，形成了鲜明对比，这使得
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方案
所有操作均按照所述指南进行 "实验室动物护理原则" （美国国立卫生研究院出版物编号85-23，1985年修订版）以及夏威夷大学马诺阿分校机构动物照护与使用委员会批准的动物实验方案17-2560-3。
1. 振动吸引行为（VAB）检测（整个记录过程≤10分钟）
注意：使用红外敏感相机，或通过改装USB网络摄像头来构建红外相机。有关改装USB网络摄像头的详细说明，请参见JoVE（本洞穴鱼专题）中Keene实验室提供的介绍（来自本A. mexicanus专题），或补充材料中的简要说明。
- 记录装置设置
- 为确保相机在拍摄过程中保持静止并维持与被摄物体的正确焦距，使用聚氯乙烯（PVC）管材搭建一个尺寸为120 cm（高）× 45 cm（长）× 90 cm（宽）的黑色箱体框架。
- 框架搭建完成后，使用适用于水培农业的塑料遮光帘进行覆盖。
- 在框架顶部放置一块黑色亚克力板，板中央开有一个窗口，用于安装红外相机，窗口直径与C接口可调变焦镜头的直径相同。在此箱体内放置VAB检测设备（图1).
- 振动装置
注意：振动由小型函数发生器产生。- 对于以下方法，将振动调节至振幅0.15 m....
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结果
本文展示的结果是采用所述方法可获得结果的代表性示例。因此，根据实验条件的不同，洞穴鱼和表层鱼的结果可能与本文所示结果略有差异。
振动吸引行为
洞穴鱼和表层鱼的VAB代表性结果如图3所示。注意表层鱼表现出的沿边缘游动行为（图3A；该特征与洞穴鱼共有）以及洞穴鱼对振动杆的强烈趋向性（图3B）。在洞穴鱼中，约35 Hz频率附近观察到趋向性的峰值（图3D），而表层鱼则无此现象（图3C），这代表了两种形态之间行为表.......
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讨论
这些所提供的方法易于获取，但由于其源自免费软件的特性，实际操作可能较为复杂。因此，强烈建议在开展任何正式实验之前，先进行预实验和分析。
一旦建立实验和分析框架，数据生成的速度可以很快。框架建立后，从MS222麻醉到最终图像采集，VAB检测可实现每7分钟记录两条鱼，活动/睡眠检测可在24小时内记录30条鱼，而神经丘成像每条鱼仅需2.5至3分钟。视频和图像分析所需时间会因所用计算机性能的不同而有较大差异。使用配备4核CPU和8 GB内存的个人电脑时，每条鱼的VAB分析耗时5至7分钟，每组30条鱼的活动/睡眠分析耗时6至8小时，神经丘图像分析每条鱼耗时5或10分钟（分别为颅区单侧或双侧图像）。市面上可购得的追踪软件（材料表） 可作为视频分析的替代方案。该软件在动物追踪方面功能强大，但价格昂贵（例如，基础软件约5,000美元，多目标追踪模块约4,000美元）。目前，我们的追踪方法似乎能达到相当的追踪准确度，尤其在活动/睡眠分析中表现突出，即丢失帧数通常低于总帧数的15%。该方法在四次重复实验中也表现出高度可重复性
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Yoshizawa实验室的所有成员，包括N. Cetraro、N. Simon、C. Valdez、C. Macapac、J. Choi、L. Lu、J. Nguyen、S. Podhorzer、H. Hernandes、J. Fong、J. Kato和I. Lord，他们在本论文所用实验鱼类的饲养方面提供了帮助。我们还感谢A. Keene实验室的成员，特别是P. Masek，对MY组装红外CCD相机的培训。最后，我们衷心感谢夏威夷大学马诺阿分校社会科学学院传播学院媒体实验室在视频制作过程中提供的宝贵帮助，尤其感谢B. Smith、J. Lam和S. White。本研究得到了夏威夷社区基金会（16CON-78919和18CON-90818）以及美国国立卫生研究院NIGMS（P20GM125508）对MY的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4-Di-1-ASP（4-(4-(二甲基氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘化物)） | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm 波长的黑光 | 高级照明 | BL41192-880 | |
| avfs | 免费软件 | 版本 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | 免费软件 | 版本 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | 免费软件 | 版本 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| 圆柱形检测室（Pyrex 325 ml 玻璃培养皿） | 康宁 | 3140-100 | 直径10厘米，高5厘米 |
| Ethovision XT | Noldus 信息 技术，荷兰瓦赫宁根 | 版本 14 | https://www.noldus.com/动物行为研究/产品/ethovision-xt |
| 鱼缸圆柱形软海绵石过滤器，黑色 | Jardin（通过 Amazon.com） | NA | 睡眠/多动记录系统的海绵过滤器 |
| A级卤虫卵 | 卤虫直接法 | BSEA16Z | |
| ImageJ | 免费软件 | 版本 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| 宏 1.8/12.5-75mm C接口变焦镜头 | Toyo | NA | 使用3D打印机打印的C型接口将设备连接至USB网络摄像头 |
| 中性调节剂 | Seachem | NA | |
| 光学铸造塑料红外长通滤光片 | Edmund optics | 43-948 | 切成小块以适配USB网络摄像头的CCD |
| pfmap | 免费软件 | 构建 178 | http://pismotec.com/download/（位于 “下载存档” 链接位于底部 |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | 免费软件 | 版本 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB网络摄像头（LifeCam Studio 1080p HD Webcam） | 微软 | Q2F-00013 | 剪取前端2-2.5厘米 |
| WinAutomation | 免费软件 | 版本 8 | https://www.winautomation.com/（此操作流程的免费独立应用程序） |
| Windows 操作系统 | 微软 | 7、8 或 10 | https://www.microsoft.com/zh-cn/windows |
| x264vfw | 免费软件 | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
参考文献
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Elsevier Inc. Amsterdam. (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R.
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重印与许可
