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方法文章

墨西哥洞穴鱼的行为追踪与神经丘成像

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DOI：

10.3791/59099

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2019年4月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Hawai'i at Mānoa, 2Department of Anatomy, Biochemistry and Physiology, University of Hawai'i at Mānoa, 3Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

本文内容

摘要

本文介绍了对一系列墨西哥洞穴鱼行为进行高通量研究以及对机械感觉系统进行活体染色的方法。这些方法采用免费软件和自制脚本，为行为学研究提供了实用且经济高效的技术方案。

摘要

洞穴栖居动物为适应持续黑暗且食物稀少的环境，已进化出一系列形态学和行为学特征。其中，觅食行为是研究行为特征进化功能优势的重要窗口之一。本文介绍了分析洞穴型四眼鱼（Astyanax mexicanus）振动吸引行为（VAB：一种适应性觅食行为）及其相关机械感受器成像的更新方法。此外，还提供了高通量追踪多种其他洞穴鱼行为（包括过度活跃和睡眠减少）的技术方案。洞穴鱼还表现出社交回避、重复性行为以及更高的焦虑水平。因此，洞穴鱼可作为研究进化行为的动物模型。这些方法采用免费软件和自制脚本，可推广应用于其他类型的行为研究，为商业行为追踪软件提供了实用且经济的替代方案。

引言

墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus，辐鳍鱼纲：脂鲤科）在鱼类中具有独特性，因其存在两种截然不同的形态——一种为有视力、栖息于地表水域的形态，另一种为无视力、栖息于洞穴的形态，后者由多个不同的种群组成1。尽管这两种形态在形态学和生理学上存在差异，它们仍可相互交配并产生可育后代2,3。这些可杂交的形态似乎在较短时间内迅速演化而成（约2万年）4，使其成为研究快速适应的理想模型系统。已知洞穴鱼类具有一系列不同的形态和行为特征，包括味蕾密度增加、机械感受器数量增多、对特定频率振动刺激敏感的觅食行为、过度活跃以及失眠。其中许多行为可能同时演化而来，部分行为被认为有助于在黑暗的洞穴环境中更有效地觅食5，或在黑暗且食物稀少的环境中节约能量6,7。

在许多进化模型系统中，由于大多数物种分布在复杂环境的连续梯度上，因此很难全面了解动物形态和行为如何响应环境变化。然而，Astyanax 的洞穴型与地表型在由明显生态过渡带分隔的高度差异环境中演化，形成了鲜明对比，这使得 Astyanax 成为研究动物进化的理想模型。该系统使得研究人员能够更便捷地将基因和发育过程与环境中的适应性性状及自然选择联系起来。此外，近期对 Astyanax 这些性状的生物医学研究表明，这些性状可能与人类疾病的症状相似8,9,10。例如，社交能力丧失、睡眠减少，以及多动、重复性行为和皮质醇水平升高等特征，与自闭症谱系障碍患者中观察到的表现相似8。

为了研究多种行为与形态特征之间复杂的共同进化关系，同时检测多种性状有助于揭示其潜在的遗传与分子通路。本文介绍了对地表型、洞穴型及杂交型 Astyanax 鱼类的洞穴行为表型程度进行表征的方法。用于表型分析的关键行为包括洞穴适应性觅食行为（振动吸引力行为，后文简称 VAB）以及活动过度/睡眠持续时间11,12。此外，还介绍了一种用于成像与 VAB 相关的感觉系统的方法13。近年来，许多可用于运行行为检测的开源追踪软件相继出现14,15。这些软件在处理时长少于10分钟的短视频时表现良好，但对于更长的视频则因计算量大、追踪耗时而变得困难。功能强大的商业软件往往价格昂贵。本文所介绍的方法主要使用免费软件，因此具有成本低、通量高的优势。同时，本文还提供了基于这些方法的代表性实验结果。

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方案

所有操作均按照所述指南进行 "实验室动物护理原则" （美国国立卫生研究院出版物编号85-23，1985年修订版）以及夏威夷大学马诺阿分校机构动物照护与使用委员会批准的动物实验方案17-2560-3。

1. 振动吸引行为（VAB）检测（整个记录过程≤10分钟）

注意：使用红外敏感相机，或通过改装USB网络摄像头来构建红外相机。有关改装USB网络摄像头的详细说明，请参见JoVE（本洞穴鱼专题）中Keene实验室提供的介绍（来自本A. mexicanus专题），或补充材料中的简要说明。

  1. 记录装置设置
    1. 为确保相机在拍摄过程中保持静止并维持与被摄物体的正确焦距，使用聚氯乙烯（PVC）管材搭建一个尺寸为120 cm（高）× 45 cm（长）× 90 cm（宽）的黑色箱体框架。
    2. 框架搭建完成后，使用适用于水培农业的塑料遮光帘进行覆盖。
    3. 在框架顶部放置一块黑色亚克力板，板中央开有一个窗口，用于安装红外相机，窗口直径与C接口可调变焦镜头的直径相同。在此箱体内放置VAB检测设备（图1).
  2. 振动装置
    注意：振动由小型函数发生器产生。
    1. 对于以下方法，将振动调节至振幅0.15 mm、频率40 Hz，该频率可引发最强的趋近反应5,16.
    2. 将函数发生器连接至水平朝向的扬声器。
    3. 使用热熔胶或垫圈胶将一根直径为7.5 mm、长度为14 cm的玻璃棒固定在扬声器正面的防尘罩上。
    4. 垂直于该玻璃棒并朝下，安装另一根直径为7.5 mm、长4 cm的玻璃棒（图1).
  3. 行为学实验
    1. 使实验对象适应环境 A. mexicanus 在圆柱形实验装置中，使用条件化水（pH 6.8–7.0，电导率约 700 µS，温度约 22 ˚C）进行为期 4 天的适应，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。通过观察鱼类开始觅食的潜伏期来判断其是否已完成适应。若觅食潜伏期较其在原饲养缸中更长，则表明需要更长的适应时间。在整个适应期间，每天投喂一次活饵 卤虫 无节幼体
    2. 实验前一天（经过3天适应期后），将实验容器中的水更换为新鲜的条件化水。
    3. 在检测当天（适应4天后），在完成检测前不再给实验鱼喂食。饱食会影响它们对振动的反应。
    4. 在 VirtualDub 免费软件中设置录制参数17：15 帧/秒，编码器：x264vfw，录制时长：3 分 30 秒。
    5. 将振动发射装置（见步骤 1.2）调节至 40 Hz。参见 图1 用于解释仪器装置。用去离子水冲洗振动玻璃棒，以去除任何水溶性化学物质。
    6. 在黑暗中操作，将检测用圆筒置于黑箱内由红外背光照明的记录台上，让鱼适应环境3分钟。
      1. 3分钟适应期后，记录3分30秒的视频。在开始记录时，将振动的玻璃棒插入水柱中（深度约0.5 cm）。
      2. 将振动的玻璃棒放入水中时，应避免产生任何噪音或振动，因为鱼类能够感知到最微小的扰动。
      3. 从开始录像起30秒内完成此步骤，以确保记录到超过3分钟的行为。
    7. 录制过程中需实时监控视频，以确保此阶段无任何错误发生。
    8. 记录完成后，将振动的玻璃棒从圆柱形检测室中取出，并将检测室从记录台上移除。随后按照步骤1.3.5对下一条鱼重复操作。
  4. 视频分析
    注意：仅在 Windows 操作系统上，才能将编解码器转换为 ImageJ 可加载的格式18 (表1).
    1. 将压缩的 avi 视频转换为 ImageJ 可读的格式并设置分析参数。
      1. 安装 AviSynth_260.exe （https://sourceforge.net/projects/avisynth2/）、pfmap 构建版本 178（http://pismotec.com/pfm/ap/）以及 avfs 版本 1.0.0.5 或 1.0.0.6（https://sourceforge.net/projects/avf/））。请注意，该方法对程序及版本敏感。所提供的网站链接将引导至正确的版本表1).
      2. 双击运行批处理文件 avs_creater.bat （补充文件）。右键单击待分析的 avs 视频文件（从由 avs 生成的文件中选择） avs_creater.bat).
      3. 由于使用 ImageJ 中的 Tracker 插件进行视频分析需要加载 ImageJ 宏（补充文件 宏VAB_moko.txt)，通过拖放方式将宏加载到 ImageJ 的图形用户界面（GUI）中。该宏将为后续分析启用特定的快捷键。
      4. 在工作目录中，创建一个名为 "Process_ImageJ".
      5. 右键单击要分析的 .avs 文件（从生成的 .avs 文件中选择） avs_creater.bat）。选择 快速安装 选项。当avs文件作为外部驱动器挂载后，在ImageJ中打开avi文件（该avi文件的名称以 ".avi").
      6. 为设定距离测量的标尺，使用以下方法在检测室直径上画一条直线来选择其直径 直线选择工具，然后点击 分析 > 设置比例尺 功能。例如，输入 9.4 cm 若使用内径为 9.4 cm 的圆柱形培养皿。选中单选框 全球 以便在所有后续视频分析中统一标度。
    2. 转换为二值图像栈并运行分析。
      1. 使用复制检测室区域 椭圆形 选择工具，然后右键单击并选择 图像 > 重复此时，指定需保留以进行后续分析的帧范围，例如，保留振动棒进入水中后的前 2,700 帧（以 15 fps 计，恰好为 3 分钟的视频）。
      2. 清除检测室外部，然后按键盘数字栏上的快捷键 7，将其转换为二值图像。
      3. 背景清除并出现提示后，使用以下方法在中心位置添加一个黑点，以指示振动玻璃棒的位置 椭圆形 选择工具已预设为黑色 填充 功能。点击 好的 随后将弹出提示，进入阈值调整步骤。
      4. 设置阈值以生成鱼类的二值化（全黑与全白）图像。调整阈值，确保在整段视频片段中均能清晰观察到鱼类，然后选择 应用.
      5. 运行 "追踪器" 通过按下快捷键激活插件 8 在数字栏上。当提示时，将最小像素大小设置为100，然后点击 好的生成二值视频全部3分钟内每一帧中振动杆与鱼之间的距离。
      6. 调整视频中由噪声引起的跟踪偏差。为此，请检查 结果 窗口以识别返回对象编号3或更高的帧——表明这些帧中存在额外对象（例如水中的颗粒或杆状物透明臂的阴影），除了 "杆" 和 "鱼" 在画面中。使用画笔工具移除任何多余的对象。
      7. 按下快捷键 9 在数字栏上导出整个视频的二值化图像堆栈（以便必要时重新分析）以及包含坐标和距离数据的 .xls 文件（补充文件） CF01.xls、Threshold_CF01.tif 和 Trac_CF01.tif）。快捷键 9 还将关闭与当前视频关联的所有文件。对所有重复样本重复步骤 1.4.2.1 至 1.4.2.6。
      8. 运行宏脚本（补充文件） JoVE_2cmVAB_template_15fps.xlsm) 将多个 Tracker 结果文件（.xls）合并到一个电子表格中，并统计动物进入杆周围 1.5 cm 区域内的接近次数和持续时间。持续时间少于 0.5 秒的接近不计入统计。可根据具体研究问题调整被定义为“接近”的距离和时间参数。
    3. 完成所有分析后释放计算机硬盘空间。通过运行批处理文件删除已挂载的文件，以释放磁盘空间——包括 avi.avi 和 .avi.avs 文件（由软件生成的文件扩展名）。 multiunmountdel.bat 在同一个文件夹中 avs_creater.bat 在第1.4.1.2节中进行了运行。

2. 睡眠与多动行为检测（24小时记录）

  1. 行为学实验
    1. 在定制的10 L丙烯酸记录水族箱（45.9 cm × 17.8 cm × 17.8 cm；长×宽×深）中，用已调节的水（见步骤1.3.1）对每个腔室中的五条实验鱼进行至少4天的适应性驯化。
      1. 使用黑色丙烯酸板将每个独立腔室隔开，使各腔室尺寸相等，均为88.9 mm × 177.8 mm × 177.8 mm（图2）。务必覆盖每个水族箱，防止鱼类跳跃至其他腔室。
      2. 设置可编程电源定时器，在驯化期间每天自动开启白光LED照明12小时，关闭12小时（例如，设定灯光在上午7点开启，晚上7点关闭）。这将使鱼类的昼夜节律同步化（如果其具有可被同步化的特性）。
      3. 使用与10 L水族箱尺寸相似的不透明白色丙烯酸板作为漫射器，使白光和红外光透过，从而在整个水族箱区域提供强度均匀的漫射光。
      4. 在驯化期间，每天投喂一次活体卤虫（Artemia）无节幼体，并通过每个水族箱中的海绵过滤器提供通气。
        注意：确保在固定时间投喂（例如每天上午9:00投喂一次），因为投喂时间也可能影响昼夜节律的同步化19。
      5. 通过观察鱼类觅食的潜伏期来判断其是否已完成适应。若其觅食潜伏期比在原饲养缸中更长，则表明需要更长的适应时间。
    2. 在实验前一天（已完成至少3天驯化），将实验腔室中的水更换为新配制的已调节水（见步骤1.3.1）。
    3. 在VirtualDub软件17中设置录像参数：15帧/秒，编码器：x264vfw，录像时长：86,400秒（24小时）。
    4. 开启记录平台后方的红外背光灯（见图2）。通过观察VirtualDub软件在屏幕上的实时图像，调整每个水族箱的位置，使其正对USB摄像头。
    5. 在录像当天，给每条鱼投喂活体卤虫（Artemia）无节幼体，移除所有海绵过滤器，并开启红外背光灯。
    6. 于早晨开始24小时录像（例如，开始时间为上午9:00，结束时间为次日上午9:00）。启动视频采集，并确保实验场所不受干扰。定期检查录像是否正常运行。
    7. 24小时后，确认视频已正确保存。将视频转移至PC工作站，用于追踪和分析鱼类行为。
  2. 视频分析
    1. 首先，通过观察光照情况检查视频质量。确认每个区域中是否仅有一条鱼，以及是否存在可能导致追踪错误的外来运动。
    2. 制作掩膜以避免水族箱外部区域的错误追踪。根据鱼在水族箱中的顺序，制作两个掩膜：一个用于“奇数”位置的鱼，另一个用于“偶数”位置的鱼。
    3. 为上述掩膜创建两个文件夹，分别命名为"odd"和"even"。将SwisTrack的追踪参数文件分别移入这两个文件夹中。
    4. 打开SwisTrack追踪软件的参数文件（补充文件Tracking_odd.swistrack 或 Tracking_even.swistrack）。指定视频文件和掩膜文件的路径，然后保存并退出参数文件。根据实验情况，分别在"Blob detection"和"Nearest neighbor Tracking"组件中调整斑点数量和最大像素参数。
    5. 双击运行Windows自动化脚本，该脚本将自动启动SwisTrack软件（补充文件swistrack_1.exe, swistrack_2.exe, swistrack_3.exe 或 swistrack_4.exe——这些均为相同的可执行文件），以帮助更新SwisTrack中的自适应背景减除功能。
    6. 在SwisTrack软件中打开Tracking_odd.swistrack或Tracking_even.swistrack以加载追踪参数文件。加载参数后，点击运行按钮开始追踪。
    7. 在前9,000帧（600秒，即录像视频的前10分钟）内，通过查看SwisTrack组件列表中的自适应背景减除、二值掩膜和最近邻追踪结果，检查鱼类追踪是否正常工作（参见配套视频）。然后在组件列表中选择Adaptive background subtraction。
    8. 按下键盘上的R键以恢复Windows自动化程序，并让计算机继续自动追踪。对于配备4核CPU和8 GB内存的台式机，每24小时视频的追踪耗时约为5–7小时。根据需要，可运行多个SwisTrack进程（包括单个视频文件中的奇数和偶数区域），最多运行至CPU核心数。例如，4核CPU可同时处理4个视频。
    9. 在追踪过程中，避免将此计算机用于其他用途，因为Windows自动化程序会自动移动鼠标指针。前9,000帧将在后续步骤中被舍弃。
    10. 将3个Perl脚本文件（1.fillupGaps2.pl, 2.Calc_fish_id_moko_robust, 和 3.pl, 3.Sleep_summary_4cm_movingWindow.pl）复制到SwisTrack在“even”和“odd”文件夹中生成的追踪文件所在目录（见步骤2.2.3）。
    11. 使用VirtualDub从视频文件中截取一帧画面，并将该帧作为图像导入ImageJ。在ImageJ中选择水族箱的长度（45.9 cm），计算像素/厘米比值。在文本编辑器中打开1.fillGaps2.pl，输入该像素/厘米比值并保存。
    12. 启动CygWin程序（一种Unix模拟器），在命令行中使用cd命令定位到包含3个Perl脚本的SwisTrack文件夹。
    13. 输入Perl 1.fillGaps.pl运行Perl脚本。这三个Perl脚本将为每个追踪文件分配唯一的水族箱腔室编号，并分析鱼类清醒期间的睡眠时长和游泳距离。分析过程需1–2小时完成。
    14. 评估名为Summary_Sleep.txt的文本文件，判断从分析中丢失的帧数是否处于可接受的低水平；若丢失帧数少于15%，则视为可接受。
    15. 将Summary_Sleep.txt中的分析结果复制粘贴至带有宏的电子表格中（补充文件Sleep_12hr12hr_TEMPLATE.xlsm）。
    16. 运行宏以提取追踪文件的汇总数据。

3. 机械感觉神经丘的 DASPMI 或 DASPEI 染色

注意：DASPMI 和 DASPEI 染色对光敏感，应在避光条件下进行。以下方案以 DASPMI 为例，适用于 DASPMI 和 DASPEI 染色。

  1. 染色步骤
    1. 配制总共 1 L 的染色储备液（25 µg/mL），将 0.025 g DASPEI 或 DASPMI 晶体加入 1 L 的 dH2O 中，过夜溶解。溶液于 4 °C 避光保存。
    2. 在 22 °C 黑暗环境中，将鱼置于含 2.5 µg/mL DASPMI 或 DASPEI 的条件化水（见步骤 1.3.1）中浸泡 45 分钟。
    3. 45 分钟后，将鱼从 DASPMI 或 DASPEI 溶液中取出，并通过浸入含有 66.7 µg/mL 缓冲乙基-3-氨基苯甲酸甲烷磺酸盐（MS222）的冰浴条件化水中进行麻醉。
    4. 将鱼固定于培养皿中，在荧光显微镜下拍照。采集 z 轴层扫图像，并以 .tif 格式保存，用于后续分析。
  2. 使用 ImageJ 进行图像分析
    1. 在包含 .tif 文件的文件夹中，粘贴 ImageJ 宏文件模板（Neuromast_ImageJ.txt），并创建一个名为 "Process_ImageJ" 的新文件夹。在 ImageJ 宏文件中，设置路径为当前目录。
    2. 启动 ImageJ，通过将宏文件拖入图形用户界面，或点击 文件 > 打开 并选择宏文件来打开该宏。
    3. 点击 宏 > 运行宏 执行宏程序。宏将自动打开一个待分析的图像文件。如果图像文件未打开，请点击 宏 > 文件选取。
    4. 进行神经丘定量时，使用 多边形工具 选择感兴趣区域。
    5. 按下快捷键 5 复制感兴趣区域。
    6. 使用 画笔工具 对前一张图像中额外或缺失的神经丘点进行删除或添加，然后按下 6。按下 6 后，将出现两个新窗口：编号神经丘点的示意图和包含神经丘总数的表格。
    7. 按下 7 保存这两个文件：一个以 .tif 图像文件格式保存，另一个以 .xls 文件格式保存。文件保存后，将自动打开下一个图像文件以供分析。
    8. 运行宏脚本（SN_Number_Diameter.xlsm），将每条鱼的神经丽数量汇总到一个电子表格中。

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结果

本文展示的结果是采用所述方法可获得结果的代表性示例。因此，根据实验条件的不同，洞穴鱼和表层鱼的结果可能与本文所示结果略有差异。

振动吸引行为

洞穴鱼和表层鱼的VAB代表性结果如图3所示。注意表层鱼表现出的沿边缘游动行为（图3A；该特征与洞穴鱼共有）以及洞穴鱼对振动杆的强烈趋向性（图3B）。在洞穴鱼中，约35 Hz频率附近观察到趋向性的峰值（图3D），而表层鱼则无此现象（图3C），这代表了两种形态之间行为表...

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讨论

这些所提供的方法易于获取，但由于其源自免费软件的特性，实际操作可能较为复杂。因此，强烈建议在开展任何正式实验之前，先进行预实验和分析。

一旦建立实验和分析框架，数据生成的速度可以很快。框架建立后，从MS222麻醉到最终图像采集，VAB检测可实现每7分钟记录两条鱼，活动/睡眠检测可在24小时内记录30条鱼，而神经丘成像每条鱼仅需2.5至3分钟。视频和图像分析所需时间会因所用计算机性能的不同而有较大差异。使用配备4核CPU和8 GB内存的个人电脑时，每条鱼的VAB分析耗时5至7分钟，每组30条鱼的活动/睡眠分析耗时6至8小时，神经丘图像分析每条鱼耗时5或10分钟（分别为颅区单侧或双侧图像）。市面上可购得的追踪软件（材料表） 可作为视频分析的替代方案。该软件在动物追踪方面功能强大，但价格昂贵（例如，基础软件约5,000美元，多目标追踪模块约4,000美元）。目前，我们的追踪方法似乎能达到相当的追踪准确度，尤其在活动/睡眠分析中表现突出，即丢失帧数通常低于总帧数的15%。该方法在四次重复实验中也表现出高度可重复性

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Yoshizawa实验室的所有成员，包括N. Cetraro、N. Simon、C. Valdez、C. Macapac、J. Choi、L. Lu、J. Nguyen、S. Podhorzer、H. Hernandes、J. Fong、J. Kato和I. Lord，他们在本论文所用实验鱼类的饲养方面提供了帮助。我们还感谢A. Keene实验室的成员，特别是P. Masek，对MY组装红外CCD相机的培训。最后，我们衷心感谢夏威夷大学马诺阿分校社会科学学院传播学院媒体实验室在视频制作过程中提供的宝贵帮助，尤其感谢B. Smith、J. Lam和S. White。本研究得到了夏威夷社区基金会（16CON-78919和18CON-90818）以及美国国立卫生研究院NIGMS（P20GM125508）对MY的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-Di-1-ASP（4-(4-(二甲基氨基苯乙烯基)-1-甲基吡啶碘化物)）MilliporeSigmaD3418
880 nm 波长的黑光高级照明BL41192-880
avfs免费软件版本 1.0.0.6http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth免费软件版本 2.6.0http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin免费软件版本 2.11.0https://www.cygwin.com/
圆柱形检测室（Pyrex 325 ml 玻璃培养皿）康宁3140-100直径10厘米，高5厘米
Ethovision XTNoldus 信息  技术，荷兰瓦赫宁根版本 14https://www.noldus.com/动物行为研究/产品/ethovision-xt
鱼缸圆柱形软海绵石过滤器，黑色Jardin（通过 Amazon.com）NA睡眠/多动记录系统的海绵过滤器
A级卤虫卵卤虫直接法BSEA16Z
ImageJ免费软件版本 1.52ehttps://imagej.nih.gov/ij/
宏 1.8/12.5-75mm C接口变焦镜头ToyoNA使用3D打印机打印的C型接口将设备连接至USB网络摄像头
中性调节剂SeachemNA
光学铸造塑料红外长通滤光片Edmund optics43-948切成小块以适配USB网络摄像头的CCD
pfmap免费软件构建 178http://pismotec.com/download/（位于 “下载存档” 链接位于底部
Reef Crystals Reef SaltInstant OceanRC15-10
SwisTrack免费软件版本 4https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB网络摄像头（LifeCam Studio 1080p HD Webcam）微软Q2F-00013剪取前端2-2.5厘米
WinAutomation免费软件版本 8https://www.winautomation.com/（此操作流程的免费独立应用程序）
Windows 操作系统微软7、8 或 10https://www.microsoft.com/zh-cn/windows
x264vfw免费软件NAhttps://sourceforge.net/projects/x264vfw/

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