孢子吸附作为一种非重组型酶和抗原展示系统

摘要

本方案重点介绍利用细菌孢子作为 "活体" 一种用于吸附具有多种生物活性的异源分子的纳米生物技术工具。同时展示了测量吸附效率的方法。

摘要

细菌芽孢是一种代谢静止的细胞，由一系列保护性结构层包裹脱水的细胞质而形成。这种特殊的结构使芽孢具有极强的稳定性与抗性，因而提示可将芽孢作为展示异源分子的平台。迄今为止，多种抗原和酶已通过重组方法，以及随后发展出的一种简单高效的非重组方法，成功展示于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）及其他少数几种细菌的芽孢表面。这种非重组展示系统依赖于异源分子直接吸附于芽孢表面，避免了构建重组菌株以及将基因改造细菌释放到环境中所带来的问题。吸附的分子通过与芽孢相互作用而得到稳定和保护，从而减缓抗原在不利条件下的快速降解，并减少酶活性的丧失。使用后的芽孢吸附酶可轻松回收，且活性降低最小，可用于多轮重复反应。本文介绍了如何将模式分子吸附到纯化的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）芽孢上，如何评估吸附效率，以及如何回收使用过的芽孢以供新一轮反应再利用。

引言

展示系统旨在将具有生物活性的分子呈现在微生物表面，并已广泛应用于从工业、医学到环境生物技术等多个领域。除了噬菌体^1,2以及多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞^3,4,5,6,7之外，细菌孢子也已被提出作为展示系统的两种策略^8,9。

由于其独特的结构，即脱水的细胞质被一系列保护层包围¹⁰，芽孢在展示系统方面相较于噬菌体和基于细胞的展示系统具有多项优势^8,9。第一个优势在于芽孢在对其他所有细胞有害的条件下仍具有极强的稳定性和耐受性^10,11。芽孢表面展示的抗原和酶在室温长期储存后仍保持稳定¹²，并在低pH值和高温条件下受到保护而不被降解¹³。第二个优势是许多形成芽孢的物种具有良好的安全性。B. subtilis, B. clausii, B. coagulans 及其他多个物种在全球范围内被用作益生菌，已作为人用或动物用产品在市场上应用数十年^14,15。这种卓越的安全记录是表面展示系统的一项基本要求，尤其当该系统拟用于人类或动物时尤为重要¹⁶。第三个重要优势是基于芽孢的展示系统对需要暴露的分子大小没有限制。在基于噬菌体的系统中，较大的异源蛋白可能影响衣壳结构；而在基于细胞的系统中，可能影响膜结构或限制/损害跨膜转运过程¹⁷。包围芽孢的保护层由超过70种不同的蛋白质组成¹⁰，其结构足够灵活，能够容纳较大的外源蛋白，而不会出现明显的结构缺陷或功能受损⁸。此外，在两种基于芽孢的展示系统中，均无需进行异源蛋白的跨膜转运^8,9。实际上，异源蛋白要么在母细胞的细胞质中合成并组装到在同一细胞质中正在形成的芽孢上，要么被吸附到成熟的芽孢表面^8,9。

芽孢展示技术最初是通过构建一种遗传系统来改造芽孢表面而实现的¹⁸。该遗传系统基于以下两点：i）将编码芽孢衣蛋白（作为载体）的基因与目标展示蛋白的基因构建成融合基因——利用内源基因的转录和翻译信号来调控该融合基因的表达；ii）将嵌合基因整合到 B. subtilis 染色体中，以确保遗传稳定性。通过这种重组方法，已成功展示多种抗原和酶，采用不同的芽孢表面蛋白作为载体，旨在实现多种潜在应用，包括黏膜疫苗、生物催化剂、生物传感器、生物修复剂或生物分析工具^8,13。

最近，人们开发出一种不同的孢子展示方法¹⁹。该第二类系统为非重组型，依赖于分子在孢子表面的自发且极为牢固的吸附作用⁹。已有研究成功实现了抗原^19,20和酶^13,21的高效展示，并表明该方法显著优于重组型方法。这种非重组策略能够以天然构象展示蛋白质²⁰，并且也可使用经高压灭菌的死亡孢子进行操作¹⁹。目前，吸附作用的分子机制尚未完全阐明。已有研究提出，孢子的负电荷和疏水性可能是与其吸附相关的重要特性^13,19,22。最近有研究表明，一种模式蛋白——珊瑚Discosoma的红色自发荧光蛋白（mRFP）——在吸附至孢子后，能够穿透表面层并定位于内膜层²³。若该现象在其他蛋白质中也成立，则异源蛋白的内部定位可能解释其在吸附至孢子后稳定性增强的现象²³。

在最近的一项研究中，两种催化木聚糖降解途径中连续两个步骤的酶被分别展示在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的孢子表面，当共同孵育时，能够完成这两个降解步骤²¹。反应后收集的孢子仍具有活性，加入新鲜底物后可继续进行木聚糖降解²¹。尽管在第二次反应中观察到最终产物约有15%的损失²¹，但孢子展示系统在单步及多步反应中吸附酶的可重复使用性，是其另一项重要优势。

Pan 等人²⁴报道了一种将异源蛋白展示在孢子表面的额外方法：在孢子形成过程中，由母细胞产生的异源蛋白（一种内切葡聚糖酶蛋白和一种β-半乳糖苷酶蛋白）可自发地包裹于正在形成的孢子衣中，无需载体蛋白。这种额外的孢子展示系统结合了前述两种方法的特点。实际上，该方法具有重组特性，因为异源蛋白经过基因工程改造后在孢子形成期间于母细胞中表达；而其在孢子衣内的组装过程则是自发进行的，因此属于非重组方式²⁴。然而，该额外方法的展示效率仍有待使用相同的异源蛋白与其他两种方法进行系统性测试和比较。

本实验方案不包括孢子的产生与纯化过程，这些内容已在其他文献中得到充分描述²⁴。本方案包含吸附反应、通过点印迹和荧光显微镜评估吸附效率，以及回收吸附的酶以用于后续反应循环。

方案

1. 吸附反应

1. 在200 µL结合缓冲液（50 mM柠檬酸钠，pH 4.0，含16.7 mM二水合柠檬酸钠和33.3 mM柠檬酸）中，将2、5和10 µg的mRFP与2 × 10⁹个B. subtilis野生型纯化芽孢在25 °C下于摇床中孵育1小时（图1）。
2. 将结合反应混合物离心（13,000 × g，10分钟），分离沉淀（P2、P5和P10）与上清液（S2、S5和S10）。将上清液保存用于步骤3.2中所述的吸附效率间接评估。
3. 用200 µL结合缓冲液洗涤沉淀2次，然后将其重悬于100 µL结合缓冲液中，并用于后续分析。
   注意：结合反应优先在低于蛋白质等电点的pH条件下进行；通常使用1.5 M磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 4.0，或50 mM柠檬酸钠，pH 4.0。

2. 吸附效率的直接评估

1. 表面蛋白提取与蛋白质印迹分析
   1. 取50 µL吸附mRFP的孢子重悬液（步骤1.3中的P2、P5和P10），加入50 µL 2倍浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）-二硫苏糖醇（DTT）溶液（0.1 M Tris-HCl，pH 6.8；2% SDS；0.1 M DTT），以溶解孢子表面蛋白。
   2. 分别使用游离的纯化mRFP以及等量未吸附蛋白的孢子提取物作为阳性对照和阴性对照。
   3. 在65 °C孵育45分钟后，将混合物在13,000 × g条件下离心10分钟，取10 µL上清液（提取的蛋白质）进行蛋白质印迹分析，使用识别mRFP N端His标签的单克隆抗His抗体进行检测（图2A）。
2. 荧光显微镜观察
   注：通过使用荧光异源蛋白或进行免疫荧光分析，可利用荧光显微镜对吸附分子进行定位与定量。
   1. 取步骤1.3中获得的吸附孢子重悬液5 µL，加入95 µL pH 4.0的1倍浓度磷酸盐缓冲液（1x PBS），使孢子浓度约为1 × 10⁶ 个/µL。
   2. 取5 µL悬液滴加于载玻片上，覆盖经多聚-L-赖氨酸处理30秒的盖玻片，置于荧光显微镜下观察。
   3. 对每个视野，分别保存相差显微镜图像和荧光显微镜图像（图2B）。
      注：也可通过流式细胞术分析荧光孢子。将总共10⁶个吸附或未吸附异源蛋白的孢子重悬于1 mL pH 4.0的1x PBS中，使用流式细胞仪分析该悬液（图2C）。
3. 使用ImageJ进行数据分析
   1. 使用ImageJ软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）打开荧光显微镜图像，并确认所有图像均为8位格式（图像 | 类型 | 8位）。
   2. 如有需要，调整图像对比度（图像 | 调整 | 亮度/对比度），并确认图像比例尺单位为像素（PIXEL）（图像 | 设置比例尺）。
   3. 从“分析”菜单中选择设置测量，确保已勾选面积、积分密度和平均灰度值。
   4. 使用任意绘图/选择工具（如圆形、多边形或自由绘制）围绕目标孢子绘制轮廓线（图3）。
   5. 从“分析”菜单中选择测量（或按下cmd + M），将弹出包含该第一个孢子各项数值的结果窗口（图3）。
   6. 对所选视野中至少另外50个孢子重复上述两个步骤。
   7. 选择多个无孢子区域（无荧光信号），重复测量，作为背景值。
      注：区域大小不重要。这些背景荧光值将用于手动扣除背景信号。
   8. 全选“结果”窗口中的数据，将结果复制到电子表格中。
   9. 计算所选孢子的积分密度和面积的平均值，以及背景荧光值的平均值，并利用以下公式计算校正后的单细胞总荧光值（CTCF）：CTCF = 平均积分密度 - （平均面积 × 平均背景荧光）。
      注：若所有孢子分离良好，也可按照ImageJ操作指南，使用分析颗粒（Analyze Particles）功能对整幅图像中的所有孢子进行分析。为避免软件误识别特定荧光信号或孢子聚集体，需将颗粒尺寸设定为像素ˆ2 = 50–200（图4）。

3. 吸附效率的间接评估

1. 制备纯化蛋白的系列稀释液。
   1. 使用结合缓冲液，在一个1.5 mL离心管中配制250 µL终浓度为0.5 ng/µL的纯化mRFP溶液。该体积足以加载两个泳道。
   2. 使用结合缓冲液进行六次两倍系列稀释，每次终体积为250 µL。
2. 对含有吸附反应中未结合mRFP组分的上清液样品（步骤1.2中的S2、S5和S10）进行两倍系列稀释。
   1. 将每种上清液各取100 µL加入1.5 mL离心管中，并加入100 µL结合缓冲液。使用结合缓冲液进行六次两倍系列稀释，每次终体积为200 µL。
3. 裁剪一张孔径为0.45 µm、尺寸为9 cm × 10 cm的硝酸纤维素膜，使其覆盖5（样品数）× 6（稀释梯度数）个点样区域。膜不应超出点印迹装置垫圈的边缘。
4. 将预湿后的膜放入点印迹装置中。去除膜与垫圈之间可能存在的气泡。用胶带或石蜡膜覆盖装置未使用的部分，防止空气通过这些孔。
5. 按照制造商说明组装点印迹装置。
6. 若在组装过程中使用真空，需每孔加入100 µL 1× PBS重新水化膜，以确保抗原均匀结合，避免出现晕圈或信号弱的现象。
7. 通过真空轻轻抽干孔中的缓冲液。一旦所有孔中的缓冲液完全排尽，立即关闭真空泵并断开连接。
8. 将标准品加样至最外侧的两个泳道，样品加样至中间区域（图5）。每个稀释度取100 µL加入相应孔中。每个孔使用相同体积可确保所有样品孔的过滤均匀一致。
9. 开启真空泵2分钟，关闭后让样品依靠重力流过滤通过膜。
10. 用100 µL 1× PBS清洗所有孔，在洗涤缓冲液完全排尽后继续运行真空泵5分钟。
11. 保持真空状态下，松开螺丝，小心打开点印迹装置。
12. 关闭真空，取出膜，并按照Western blot实验流程进行后续处理。
13. 使用适当的软件（如ImageJ）对膜进行密度分析。
    1. 用相同面积的圆形圈定每个点，使用分析/测量命令测定各点的积分密度。
    2. 在空白区域绘制圆形以测定背景积分密度，或使用处理/减去背景命令对图像进行背景校正。
    3. 将标准品点的积分密度与其对应的上样蛋白量相关联，绘制标准曲线（校准曲线的R²值应大于0.95）。
    4. 利用标准曲线外推各样品点中mRFP的浓度。
    5. 计算未结合组分中残留mRFP的浓度。
       注意：为确保点印迹装置正确闭合，从而使膜受到均匀压力，应按对角交叉顺序拧紧螺丝，然后开启真空泵进一步加固螺丝。

4. 孢子收集与再利用

1. 为回收吸附的孢子，按照步骤1.1–1.3所述方法，使用10 µg纯化的GH10-XA木聚糖酶或10 µg纯化的GH3-XT β-木糖苷酶，分别与2.0 × 10⁹个纯化孢子进行两次吸附反应（图6A）。
2. 收集含有酶吸附孢子的沉淀，将其重悬于50 µL酶反应测定最适缓冲液中（50 mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5；含Na₂HPO₄ 2.48689 g/L，NaH₂PO₄ 4.88991 g/L），混合后得到100 µL吸附有GH10-XA或GH3-XT的孢子混合物。
3. 加入底物（5 mg/mL 4-O-甲基-d-葡糖醛酸-d-木聚糖 [MGX]），在65 °C下反应16小时。
4. 将反应混合物离心（13,000 × g，15分钟），并保存含有酶反应产物的上清液。
5. 将沉淀重悬于100 µL新鲜的50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）中，并加入新的底物（MGX）（图6B）。
   注意：若需吸附多种酶，可同时或依次分别进行吸附。后者有利于对每种酶的吸附效率和活性进行定量分析，从而确定反应所需每种酶的化学计量平衡。

结果

可通过蛋白质印迹法（Western blotting）评估吸附是否成功。反应完成后，将混合物通过离心分离并洗涤，收集沉淀组分（图1），用于提取表面蛋白。提取物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并与一抗和二抗反应。仅在吸附孢子提取物加样泳道中检测到预期大小的蛋白条带，表明吸附反应成功（图2A）。

吸附反应的效率可通过直接和间接方法进行评估。对吸附效率的直接评估取决于所使用的异源蛋白，可通过荧光显微镜（图2B）和流式细胞术（图2C）对吸附反应分步离心后的沉...

讨论

该孢子吸附方案非常简单直接。反应严格依赖于反应缓冲液的pH值，在酸性pH条件（pH 5.0或更低）下吸附效率最高。在中性pH条件下，吸附效率较低；而在碱性pH条件下，可能不发生吸附。最佳吸附效果是在1.5 mL离心管中使用200 µL体积（或保持类似比例）并在摇床上进行反应时获得。

吸附非常牢固，使用与反应缓冲液相同pH的缓冲液洗涤不会导致吸附蛋白的任何释放。使用碱性缓冲液洗涤可能导致吸附蛋白的少量（通常小于15%²⁶）释放。

通过点印迹法间接评估吸附效率是可靠的，前提是分析纯化蛋白和未结合蛋白的多个稀释梯度，并正确进行密度测定分析。目前尚未有报道显示异源蛋白发生降解²⁵。对吸附效率的直接评估在很大程度上取决于所吸附的蛋白性质。如果蛋白具有自发荧光或已被荧光标记，则可通过ImageJ辅助分析，定量测定孢子表面荧光信号及荧光分子的数量。若蛋白具有酶活性，可通过特异性酶活性检测来估算其在孢子表面的含量。然而，已知由于与孢子相互作用带来的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P8920
0.45 µm 硝酸纤维素印迹膜	Sartorius	M_Blotting_Membranes
100× UPlanF1 物镜	Olympus	显微镜设备
Bacillus subtilis 菌株 NCIB3610	枯草芽孢杆菌遗传保藏中心	3A1
BD ACCURI C6 PLUS	BD	流式细胞仪
BX51	Olympus	荧光显微镜
Clarity	Biorad	1705060
DP70 数码相机 a	Olympus	显微镜设备
山羊抗兔 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，FITC 标记	Thermo fisher	F-2754
山羊抗兔 IgG H&L (HRP)	Abcam	ab6721
单克隆抗多聚组氨酸−过氧化物酶抗体	Sigma	A7058-1VL	用于检测在C端或N端带有6个组氨酸标签的吸附蛋白
SecureSlip 玻璃盖玻片	Sigma	S1815-1PAK
Superwhite 无电荷载玻片	VWR	75836-190
U-CA 放大倍率转换器	Olympus	显微镜设备