气泡柱光生物反应器中绿藻的培养及中性脂质检测方法

摘要

本文介绍了一种构建实验室规模气泡柱式光生物反应器的方案，并利用该反应器培养微藻的方法。同时提供了测定微藻培养物生长速率和中性脂质含量的实验方法。

摘要

人们对微藻的研究在工程应用方面具有浓厚兴趣，例如用于生产生物燃料、高附加值产品以及废物处理。由于大多数新研究工作都从实验室规模开始，因此需要一种经济高效且可重复的微藻培养方法。本文介绍了一种在实验室规模光生物反应器中培养微藻并测定其生长情况和中性脂质含量的有效方法。文中还包含了光生物反应器系统的搭建说明。尽管示例生物为Chlorella和Auxenochlorella物种，但该系统可适用于培养多种微藻，包括微藻与非藻类物种的共培养体系。首先在瓶中培养保藏种，以制备光生物反应器系统的接种物。将微藻接种物浓缩后转移至光生物反应器中进行分批培养。每天采集样品进行光密度测定。分批培养结束后，通过离心收集细胞，洗涤后冻干，以获得最终的干重浓度。利用最终干重浓度建立光密度与干重浓度之间的相关性。随后采用改良的Folch法从冻干生物质中提取总脂质，并通过微孔板法测定提取物中的中性脂质含量。该检测方法此前已有发表，但本文包含了详细的实验步骤，以突出实验流程中容易出错的关键环节。本文所述的生物反应器系统填补了简单烧瓶培养与完全可控的商用生物反应器之间的空白。即使每个处理仅设置3-4个生物学重复，本方法在微藻培养、生长及脂质检测中仍可获得较小的标准偏差。

引言

近年来，微藻在工程与生物技术领域的应用引起了广泛关注。目前，微藻正被研究用于废水处理^1,2,3,4、生物燃料生产^5,6,7,8，以及营养保健品和其他高附加值产品的制备^9,10。此外，为提高微藻在特定工程应用中的适应性，对其开展的遗传改造研究也日益增多^11,12。因此，在受控条件下对具有工业应用价值的生物体进行实验备受关注。本方法旨在介绍一种在受控实验室环境中培养微藻并测定其生长情况和中性脂质含量的有效方案。提高微藻的生长速率和中性脂质含量，已被认为是实现藻类生物燃料商业化应用的两个关键瓶颈¹³。

方案

1. 气泡柱光生物反应器的设置

1. 使用1 L玻璃瓶和杂交管附带的塑料盖，制作一组带通气孔的盖子（带示意图和照片，参见图1）。为加湿器、混合捕集器、每个气升式光生物反应器以及每个瓶式反应器分别制作盖子。
   1. 在盖子上钻¼”孔：生物反应器和加湿器盖需要2个孔；混合捕集器需要3个孔。
   2. 将一个¼” O型圈套在1/8”面板安装式鲁尔接头的螺纹上，并将其插入盖子上钻好的¼”孔中（图1A）。
   3. 再将第二个¼” O型圈套在螺纹上，使盖子夹在两个O型圈之间。将锁紧螺母旋到螺纹上并拧紧，以固定面板安装式鲁尔接头。
   4. 将卡扣环安装到从盖子伸出的公鲁尔接头上。对盖子上的每个孔重复步骤1.1.2–1.1.4。
   5. 对于将用于鼓泡柱和瓶式反应器的盖子，将1/8”母鲁尔转卡套接头连接到长度为1.5”的1/8”内径PVC管段上。将这些管段分别连接到盖子上露出的公鲁尔接头上。
   6. 将一个单向阀（阀口方向远离盖子）连接到其中一段1/8”管的自由端。
      注：这将作为生物反应器的排气口。
   7. 将一个公鲁尔转卡套接头连接到从盖子伸出的第二段1/8”管上。扣紧旋转锁环，并在此处安装一个0.2 μm空气过滤器。
      注：这将作为反应器的进气口。
<....

结果

该实验可获得在550 nm波长下的藻类光密度（OD 550 nm）随时间变化的数据图4A）。光密度与干重浓度数据可进行关联（图4B）。这首先需要计算冻干步骤后的最终干重藻类浓度。接着，可将采样最后一天进行的培养物系列稀释的光密度值与实际干重浓度进行关联。对于低细胞浓度，可采用线性关联；而对于较高细胞浓度，则可采用二阶多项式关联。建议针对每种培养条件分别建立独立的关联曲线。最后，将该关联关系应用于时间过程中的光密度数据，以获得干重生长曲线。图4C）。在此示例实验中， Auxenochlorella protothecoides （UTEX 2341）²⁵在四种条件下培养：在新鲜 N8-NH 培养基上培养的无菌对照培养物₄ 培养基²¹，与细菌共培养 Azos.......

讨论

培养藻类时最重要的考虑因素是了解特定生物体或生物群体的具体需求。此处描述的藻类培养系统可用于培养多种藻类，但需根据具体生物体的需求调整非生物因素（温度、培养基、pH、光照强度、CO₂浓度、通气速率）。请注意，本文所述参数适用于Chlorella和Auxenochlorella的培养。这些生物体具有工业应用价值，因其能够耐受高营养水平、强光照和高温条件²⁷。然而，可通过移除荧光灯管来降低光照强度，并可调整昼夜循环以模拟季节变化。同样，可通过调节加热装置控制水浴系统的温度。尽管本文描述的系统未采用降温功能，但可通过低成本冷却系统将鱼缸水浴温度降至室温以下。具体方法是将一桶水置于小型冰箱中，使用可调速泵将冷水桶中的水抽入鱼缸并循环返回。抽水速率越快，鱼缸储水槽的温度就越低。

尽管藻类培养系统通常能提供稳定的结果，但仍有一些重要的注意事项需要考虑。首先是通气系统在突然失去压力时可能发生的虹吸现象例如， 气流接头损坏或空气压缩机故障）。加湿器内的压力会将加湿水通过管路反.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>气升式光生物反应器装置所需材料
1 L 耐热玻璃瓶	Corning	16157-191	用于瓶式反应器的加湿器
1/2" 软管夹	家得宝	UC953A	或同等产品
1/4" 雌性鲁尔接头转卡套	Nordson 生物医学	Nordson FTLL360-6005	1/4" ID，PP
1/4" ID，3/8" OD 可高压灭菌 PVC 管	Thermo-Nalgene	63013-244	50'
1/4" 在O形环中	格雷格纳	1REC5	#010 中等硬度硅胶O型圈，0.239" I.D.，0.379"O.D.
1/8" 雌性鲁尔接头转接头	Nordson 生物医学	FTLL230-6005
1/8" ID，1/4" OD 可高压灭菌 PVC 管路	Thermo-Nalgene	63013-608	250'
1/8" 雄性旋转鲁尔接头转接至倒刺接头	Nordson 生物医学	MLRL013-6005
1/8" 多端口插头	Nordson 生物医学	4PLL230-6005	1/8" 多端口倒刺
1/8" NPT 转接至卡套	Nordson 生物医学	18230-6005	1/8" 200系列接头
1/8" 面板安装式鲁尔接头	Nordson 生物医学	Nordson MLRLB230-6005	1/8"，PP
10加仑鱼缸	沃尔玛	802262	根据布局不同，最多可容纳8个生物反应器
100-1000 ccm 流量计	Dwyer	RMA-13-SSV	用于瓶式反应器
2 英尺荧光灯组	Agrobrite	FLT24 T5
200-2500 ccm 流量计	Dwyer	RMA-14-SSV	用于加湿器上游的空气调节
250 mL Pyrex 瓶	康宁	16157-136	加湿器后的气体混合
50-500 ccm 流量计	Dwyer	RMA-12-SSV	用于杂交管式反应器
5-50 立方厘米/分钟 流量计	Dwyer	RMA-151-SSV	用于控制 CO2 流速
空气滤器 0.2 µm	沃特曼/费舍尔	09-745-1A	Polyvent，28 mm，0.2 µ米，聚四氟乙烯，50 个装
单向阀	VWR	89094-714
康宁公司生产的耐热玻璃瓶瓶盖	VWR	89000-233	10 个 GL45 盖子
雌性鲁尔端帽	Nordson 生物医学	Nordson FTLLP-6005	雌性稳定型 PP
杂交管	康宁	32645-030	35x300 毫米，2 个装
光照定时器	沃尔玛	556393626
锁紧螺母	Nordson 生物医学	Nordson LNS-3	1/4"，红色尼龙
低剖面磁力搅拌器	VWR	10153-690	低剖面磁力搅拌器
雄性鲁尔端帽	Nordson 生物医学	Nordson LP4-6005	雄性插头 PP
旋转式鲁尔锁环	Nordson 生物医学	Nordson FSLLR-6005
长型搅拌子	VWR	58949-040	38.1 毫米，用于瓶式反应器
磁力搅拌子 - 中号	VWR	58949-034	25 毫米，用于杂交管
<强>培养藻类所需的耗材和试剂
0.2 µm 滤膜	VWR	28145-491	13 毫米，聚四氟乙烯，用于过滤日常培养取样中的用后培养基
1 mL 注射器	密封	89215-216	用于过滤日常培养取样中的用后培养基
1.5 mL 离心管	VWR	87003-294	无菌（或同等条件）
10 mL 血清学移液管	Greiner Bio-One	82050-482	无菌（或同等条件）
100 mm 培养皿	VWR	25384-342	100x15 mm 可堆叠无菌培养皿
15 mL 离心管	Greiner Bio-One	82050-276	无菌（或同等条件），聚丙烯
2 mL 血清学移液管吸头	Greiner Bio-One	82051-584	无菌（或同等条件）
2 mL 离心管	VWR	87003-298	无菌（或同等条件）
50 mL 离心管	Greiner Bio-One	82050-348	无菌（或同等要求）聚丙烯
96孔微孔板	Greiner Bio-One	89089-578	带盖平底聚苯乙烯板
接种环	VWR	80094-478	无菌（或同等条件）
液态二氧化碳罐及减压阀	Airgas	CD-50
<强>脂质提取与中性脂质检测所需的耗材和试剂
2 mL 珠管	VWR	10158-556	带盖聚丙烯管
96孔微孔板	Greiner Bio-One	82050-774	聚丙烯，平底
漂白剂	沃尔玛	550646751	仅使用普通漂白剂，而非清洁用漂白剂
氯仿	BDH	BDH1109-4LG
二甲基亚砜	BDH	BDH1115-1LP
异丙醇	BDH	BDH1133-1LP
甲醇	BDH	BDH20864.400
尼罗红	VWR	TCN0659-5G
巴斯德吸管尖端	VWR	14673-010
氯化钠	BDH	BDH9286-500G
植物油	沃尔玛	9276383	任何新鲜的植物油均可使用
氧化锆/二氧化硅珠（直径 0.5 mm）	Biospec 产品	11079105z
<强>仪器设备
分析天平	Mettler-Toledo	XS205DU	至少具备4位小数精度
珠磨机	Omni	19-040E
台式微量离心机	赛默飞世尔科技（Thermo）	Heraeus Fresco 21 配 24x2	包含可处理1.5和2 mL离心管的转子
干浴加热器	VWR	75838-282	包含用于微孔板的干式温控模块
冷冻干燥机	Labconco	7670520	2.5L 冻干系统
大型台式离心机	赛默飞世尔科技	Heraeus Megafuge 16R 离心机组织样本处理	包括可处理400 mL瓶、50 mL离心管和15 mL离心管的转子
酶标仪	Molecular Devices	SpectraMax M2	能够读取吸光度和荧光
涡旋混合器	VWR	10153-838