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方法文章

异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

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DOI：

10.3791/59107

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2019年5月23日

 , 
1Department of Microbiology, Molecular Genetics, and Immunology, University of Kansas Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD 提供了一种体内模型，用于研究人T细胞的免疫抑制作用。此外，我们还描述了如何利用数字PCR检测组织中的人T细胞，以此作为量化免疫抑制程度的工具。

摘要

急性移植物抗宿主病（GVHD）是接受造血干细胞移植以治疗血液系统缺陷和恶性肿瘤的患者面临的重要限制因素。当供体T细胞将宿主组织识别为外来抗原并对宿主发起免疫应答时，便会发生急性GVHD。目前的治疗方法主要依赖具有毒性的免疫抑制药物，这会使患者易受感染并增加疾病复发风险。因此，目前正在进行持续研究，以开发能够有效靶向供体T细胞并减少副作用的急性GVHD治疗策略。大量临床前研究采用异种GVHD（xenoGVHD）小鼠模型，该模型可在体内系统中直接在人源细胞而非小鼠细胞上测试免疫抑制疗法。本实验方案详细说明了如何诱导xenoGVHD，以及如何实施盲法和标准化临床评分，以确保结果的一致性。此外，本方案还描述了如何使用数字PCR检测小鼠组织中的人源T细胞，从而可用于量化所测试疗法的有效性。xenoGVHD模型不仅为GVHD治疗提供了研究平台，也可用于评估任何能够抑制人源T细胞的疗法，这些疗法未来可能应用于多种炎症性疾病。

引言

同种异体造血干细胞移植（HSCT）已成为治疗预后不良的血液系统恶性肿瘤（如白血病）患者的常规疗法。HSCT 的一个严重并发症是急性移植物抗宿主病（GVHD）。2012 年的一项研究报道，在接受同胞供者移植的 HSCT 患者中，有 39% 发生急性 GVHD，而在接受无关供者移植的患者中，这一比例为 59%1。急性 GVHD 是由供体来源的 T 细胞攻击受体器官所引起的。目前治疗 GVHD 唯一有效的方法是使用强效免疫抑制药物2，但这些药物具有高度毒性，会增加感染和肿瘤复发的风险。因此，尽管近年来在改善急性 GVHD 患者生存率方面已取得一定进展3,4,5，但仍迫切需要开发毒性更低、能够促进长期缓解的新型 GVHD 治疗方法。

以下方法的总体目标是诱导并评估异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）。xenoGVHD模型作为一种研究工具，可用于利用人源细胞而非鼠源细胞诱导急性GVHD，从而更直接地将临床前GVHD研究结果转化为临床试验6。该模型通过尾静脉向亚致死剂量照射的NOD-SCID IL-2Rγnull（NSG）小鼠体内注射人外周血单个核细胞（PBMC）。注入的人T细胞被呈递小鼠抗原的人抗原呈递细胞（APCs）激活，活化的T细胞迁移至远端组织，引发全身性炎症反应，最终导致动物死亡6,7,8,9,10。xenoGVHD模型中的疾病病理特征及进展过程与人类急性GVHD高度相似。具体而言，致病性人T细胞对小鼠主要组织相容性复合体（MHC）蛋白产生反应，这与人类GVHD中T细胞的同种异体反应性相似6,9。相较于另一种广泛应用的GVHD模型——小鼠MHC错配模型，xenoGVHD模型的主要优势在于允许在人源细胞上测试治疗手段，而非鼠源细胞。这使得所测试的产品无需任何修改即可直接应用于临床，因为这些产品原本就是针对人细胞设计的。近期，该模型已被用于评估人源抗IL-2抗体11、人胸腺调节性T细胞（Tregs）12以及人源间充质干细胞13作为治疗急性GVHD的潜在方案。从更广泛的角度来看，该模型还可作为体内抑制实验的平台，用于评估任何能够抑制人T细胞活性的药物或细胞类型。例如，Stockis等人14利用xenoGVHD模型研究了阻断整合素αVβ8对Treg在体内抑制功能的影响。 因此，xenoGVHD模型可在体内环境中揭示任何靶向T细胞疗法的作用机制。

本方案中描述的另一种方法是使用数字聚合酶链式反应（digital polymerase chain reaction, dPCR）在小鼠组织中检测人源T细胞。该方法的目的是提供一种工具，用于量化T细胞在靶组织中的迁移和增殖情况，从而评估在此模型中测试的免疫抑制疗法的有效性。dPCR是一种相对较新的核酸定量技术15。简而言之，将PCR反应体系分割成多个独立的分区，每个分区含有少量目标序列或不含目标序列。随后通过DNA嵌入染料或荧光标记的序列特异性探针对目标序列进行扩增和检测。dPCR基于阳性分区的比例和泊松统计学原理来计算目标序列的拷贝数15,16。与流式细胞术和组织学等其他替代方法相比，使用dPCR检测T细胞所需的组织量显著减少，并且可用于冷冻或固定保存的组织样本。dPCR无需标准曲线即可确定拷贝数，也不需要技术重复。与传统的定量PCR（qPCR）相比，这减少了dPCR所需的试剂和模板DNA用量16。dPCR通过将PCR反应分割为多个子反应，有效富集了目标分子17。因此，dPCR主要用于在大量非目标DNA背景中检测稀有目标序列。例如，dPCR已被用于检测牛奶中的细菌污染18、鉴定雌激素受体基因中的稀有突变19，以及检测患者血液中的循环肿瘤DNA20。在本方案中，dPCR作为一项高效工具，用于检测和定量异基因移植物抗宿主病（xenoGVHD）小鼠模型组织中的人源T细胞。

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方案

所有小鼠实验均在堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会的合规监督下并经其批准后进行。所有健康人血液样本均在获得知情同意及堪萨斯大学医学中心机构审查委员会批准后获取。

1. NSG 小鼠的照射

  1. 在PBMC注射前一天，对8至12周龄的NSG小鼠（可使用任一性别）进行照射。在无菌生物安全柜中，将小鼠放入已灭菌的派型鼠笼或独立通气笼具中。使用Cs137放射源或小型动物照射仪（例如RS 2000），以150 cGy的总剂量对小鼠进行照射，同时缓慢旋转以确保照射均匀。
  2. 将小鼠转移至无菌生物安全柜中的洁净笼盒内。

2. 注射用人外周血单个核细胞的制备

  1. 采集足量的健康人血液，以分离出每只小鼠 1.1 × 107 个外周血单个核细胞（PBMC）。将肝素抗凝的血液用等体积含 2% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
    注意：采用本方案，通常每 10 mL 全血可获得 0.5–1 × 107 个 PBMC。每只小鼠将接受 107 个 PBMC，溶于 100 µL PBS 中。额外准备每只小鼠 1 × 106 个 PBMC（溶于 10 µL PBS），以确保在注射器加样过程中若出现损耗，仍能保证每只小鼠获得完整剂量。
  2. 向 50 mL 圆底离心管中加入 15 mL 淋巴细胞分离密度梯度介质（例如 Ficoll），然后小心地将最多 25 mL 稀释后的血液叠加在密度梯度液上方。将含有密度梯度介质和稀释血液的离心管在室温下以 400 × g 离心 40 分钟，离心过程中不启用刹车。
  3. 收集位于密度梯度界面的 PBMC 层，转移至含 10 mL PBS 的 50 mL 圆底离心管中。以 400 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  4. 轻弹离心管使细胞沉淀松散，加入 10 mL PBS 重悬细胞以洗涤 PBMC。以 400 × g 离心 5 分钟。
  5. （可选）弃去上清液，向细胞沉淀中加入与沉淀体积相等的氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液，以裂解红细胞（RBCs）。轻轻重悬沉淀，并轻轻摇晃离心管 30–60 秒。随后用无血清 RPMI 培养基充满离心管，以 400 × g 离心 5 分钟。
  6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL PBS 中。使用血细胞计数板和显微镜，通过台盼蓝排斥法进行细胞计数。
  7. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 PBS 中，调整细胞浓度至 1 × 108 个细胞/mL。

3. 人外周血单个核细胞经眶后注射入小鼠21

  1. 将麻醉室置于层流罩内以维持无菌环境。用5%异氟烷和1 L/min的氧气流速预充麻醉室5分钟。
  2. 将异氟烷浓度降至2%，并将同一只笼子中的小鼠放入麻醉室。待小鼠失去翻正反射后，在麻醉室内继续麻醉5分钟。在此期间，用注射器预先抽取100 µL细胞悬液（含1 × 107个细胞）。
  3. 将小鼠置于加热垫上，鼻部插入鼻罩以维持麻醉状态。通过轻捏足垫并观察是否无反射反应来确认意识丧失。
  4. 用拇指和中指固定小鼠。将28 G 1/2英寸针头斜面向下，从内眦外侧穿过结膜膜，直至抵达眼球后方。稍回撤针头，缓慢注入100 μL细胞悬液（含1 × 107个细胞）。
  5. 完全撤出针头，并妥善处理注射器和针头。闭合眼睑，用纱布轻轻按压注射部位。
  6. 检查注射部位是否有肿胀或其他可见损伤。让小鼠在铺有纸巾的无菌笼中恢复意识，以防止在转移至饲养笼前吸入垫料。 待出血停止后，向眼部滴加一滴丙帕他卡因以缓解疼痛。
    注意：根据Macholz等人的描述22，尾静脉注射是本方案中PBMC静脉注射的替代方法。

4. 小鼠急性移植物抗宿主病的临床评分（图1）23

  1. 每隔一天测量一次移植物抗宿主病（GVHD）评分，直到小鼠评分为2分，之后每天测量一次，直至安乐死当天。
    1. 将笼子放入超净工作台，移除食物和水，盖上笼盖。观察小鼠5分钟，评估其活动能力并评分：0分 = 小鼠数分钟内开始行走并在笼内持续活动；1分 = 小鼠超过数分钟才起身，且在笼内行走缓慢；2分 = 小鼠在5分钟内不起身，仅在受到触碰时才行走。
  2. 将每只小鼠放入玻璃烧杯中称重，并给予体重减轻评分：0分 = 体重变化<10%；1分 = 体重变化10–25%；2分 = 体重变化>25%。
  3. 小鼠仍在烧杯中时，检查其姿势：0分 = 正常；1分 = 静息时呈弓背状；2分 = 弓背影响活动能力；毛发质地：0分 = 正常；1分 = 轻度至中度毛发蓬乱；2分 = 严重毛发蓬乱；以及皮肤完整性：0分 = 正常；1分 = 足垫或尾部出现脱屑；2分 = 明显的皮肤裸露区域（需检查耳朵、尾巴和足垫是否有脱屑）。
  4. 共五个评分类别，每类评分范围为0–2分，因此小鼠最高评分为10分。当小鼠评分达到7分或以上，或注射后达到42天时，采用CO2安乐死法或其他经本地机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方法实施安乐死。
    注：为确保结果准确性，评分应由对处理分组设盲的研究人员进行24。此外，尽管多数IACUC方案推荐将体重减轻超过>20%作为人道终点，但在提供额外依据的情况下，可获得IACUC对该方案的批准。

5. 收集安乐死小鼠的组织以提取基因组DNA并分离基因组DNA

  1. 使用无菌外科器械解剖小鼠。从目标器官（如肺、肝或脾）上切下一小块约 3 mm × 0.5 mm 大小的组织。称量组织样本，并将组织放入无菌的 1.5 mL 离心管中。若需采集多个组织，每次切割不同器官之间须用乙醇清洗器械。
  2. 将装有组织的离心管浸入液氮中速冻，直至液氮停止沸腾，随后于 -80 °C 冷冻过夜。解冻组织样本，并按照基因组 DNA（gDNA）提取试剂盒说明书进行裂解。
  3. 根据试剂盒说明书提供的步骤提取基因组 DNA。务必记录每微升洗脱的 gDNA 所对应的组织处理量（mg/μL）。
    注意：冷冻组织可长期保存于 -80 °C，待后续实验时再行处理。

6. 使用数字PCR对人体T细胞进行定量（图2）

  1. 根据所用数字PCR仪的DNA结合染料操作规程配制数字PCR反应体系。使用以下针对人CD3ε基因组DNA（NCBI参考序列：NG_007383.1）的特异性引物：正向引物：AGGCTGCCTTAACTCCCAAG，反向引物：GCCCTACCAGCTGTGGAAAC。这些引物将扩增出一条105 bp的单一产物。
    注意：在每个反应中加入0.5 μL的限制性内切酶（如HindIII），以消化基因组DNA。务必测试不同浓度的基因组DNA稀释液，以优化阳性与阴性液滴的分离效果。此外，部分浸润性T细胞可能是无致病性的调节性T细胞。这些细胞可通过使用针对调节性T细胞标志物的额外引物进行定量。
  2. 按照以下条件进行数字PCR反应：热盖温度105 °C，95 °C预变性10 min（1个循环）；95 °C变性30 s（升温速率2 °C/s），55 °C退火1 min（升温速率2 °C/s），共40个循环；72 °C延伸10 min，最后12 °C保存。
    注意：这些参数可能需要根据具体的数字PCR设备进行调整。
  3. 使用分析软件获取数字PCR数据。采用以下公式将结果表示为每毫克组织中的拷贝数：（拷贝数/μL）×（反应中gDNA体积/μL）×（稀释倍数）/（组织质量/mg ÷ 总gDNA体积/μL）

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结果

接受人外周血单个核细胞（PBMC）的亚致死剂量照射的8至12周龄NSG小鼠（两性均有），在注射后约第10天开始出现移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状，而仅接受磷酸盐缓冲液（PBS）的阴性对照小鼠则未出现相关症状（图1A）。异种GVHD（XenoGVHD）小鼠的中位生存期为23.5天（图1B）。通过数字PCR检测，在接受人PBMC的小鼠肺和肝组织样本中可检测到CD3ε阳性的人源T细胞。注射PBS的小鼠组织样本作为对照（图2）。

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讨论

在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中，即使使用不同供体的外周血单个核细胞（PBMC）进行注射，疾病进展通常也具有一致性，因此可将多个实验的数据合并分析。维持这种一致性的关键步骤包括正确的静脉注射技术、盲法操作以及一致的评分标准。Nervi 等人的一项研究25表明，与尾静脉注射相比，经眶后注射PBMC可实现更稳定的植入效果并引发更严重的GVHD。Leon-Rico 等人26也证实，与尾静脉注射相比，眶后注射在小鼠中可实现更稳定的造血干细胞植入。然而，如有必要，尾静脉注射也可作为xenoGVHD模型中的替代方法27,28,29。

通过增加实验动物数量，可以降低尾静脉注射结果变异性的相关问题。此外，对小鼠进行评分的人员必须对小鼠的处理情况保持盲态，以避免在评估活动能力或毛发质地等较为主观的指标时引入...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢Lane Christenson实验室为本实验提供了数字PCR仪以及给予的技术支持。我们还要感谢Thomas Yankee博士提供的指导和帮助。这些研究得到了Tripp家族基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管Fisher05-408-129
10 mL 血清移液管VWR International89130-898
10 mL BD 真空采血管 — 绿色盖，含肝素钠Becton Dickinson366480
250 µL Ranin 移液器吸头Rainin17001118不得使用其他移液器或吸头进行液滴生成
50 mL 锥形管VWR International89039-656
96 孔微滴数字 PCR 板Bio-Rad12001925
ACK（氯化铵-氯化钾）溶血缓冲液Lonza10-548E可选
酒精擦拭巾Fisher Scientific6818
麻醉室World Precision InstrumentsEZ-178由动物设施提供
麻醉机Parkland ScientificPM1002由动物设施提供
BD Vacutainer 安全锁式采血套装Becton Dickinson367281
用于 QX100/QX200 微滴生成仪的 DG8 微滴生成卡和垫圈Bio-Rad1864007
无 DNA 酶和 RNA 酶的分子级 H2OLife Technologies1811318
分子生物学级纯乙醇，200 proofSigma-AldrichE7023-500ML
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
FicollFisher Scientific45001750
胰岛素注射器Fisher Scientific329424
异氟烷Sigma-AldrichCDS019936由动物设施提供
液氮N/AN/A
小鼠辐照用 Pie 型鼠笼Braintree Scientific, Inc.MPC 1最多可容纳 11 只小鼠
Nexcare 柔性纸质胶带（又称 3M Micropore 外科胶带 / 3/4"）Fisher Scientific19-027-761
P1000 移液器MidSciA-1000
P200 移液器MidSciA-200
可穿刺铝箔热封膜Bio-Rad1814040
Pipetaid Gilson Macroman 移液辅助器Fisher ScientificF110756
Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+Rainin17013805不得使用其他移液器或吸头进行液滴生成
Qiagen DNeasy 血液与组织试剂盒Qiagen69506
qPCR 板VWR International89218-292
QX200 微滴数字 PCR 系统Bio-Rad12001925包含微滴生成仪、微滴读取仪、笔记本电脑、软件及相关耗材，适用于 EvaGreen 或探针法数字 PCR 应用
用于 EvaGreen 的 QX200 微滴生成油Bio-Rad1864006
QX200 ddPCR EvaGreen 超级预混液Bio-Rad1864033
无 RNase 和 DNase 的板封膜Thermo Scientific12565491
RPMI Advanced 1640 培养基Life Technologies12633012
无菌纱布垫（2" × 2"，12 层）Fisher Scientific67522
无菌磷酸盐缓冲液Fisher Scientific21040CV
无菌储液槽VWR International89094-662
手术剪刀Kent ScientificINS600393-4
手术镊Kent ScientificINS650914-4

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