异基因小鼠模型中移植物抗宿主病的诱导与评分及使用数字PCR定量小鼠组织中的人源T细胞

摘要

本文介绍了一种在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中诱导并评估疾病发生的方法。xenoGVHD 提供了一种体内模型，用于研究人T细胞的免疫抑制作用。此外，我们还描述了如何利用数字PCR检测组织中的人T细胞，以此作为量化免疫抑制程度的工具。

摘要

急性移植物抗宿主病（GVHD）是接受造血干细胞移植以治疗血液系统缺陷和恶性肿瘤的患者面临的重要限制因素。当供体T细胞将宿主组织识别为外来抗原并对宿主发起免疫应答时，便会发生急性GVHD。目前的治疗方法主要依赖具有毒性的免疫抑制药物，这会使患者易受感染并增加疾病复发风险。因此，目前正在进行持续研究，以开发能够有效靶向供体T细胞并减少副作用的急性GVHD治疗策略。大量临床前研究采用异种GVHD（xenoGVHD）小鼠模型，该模型可在体内系统中直接在人源细胞而非小鼠细胞上测试免疫抑制疗法。本实验方案详细说明了如何诱导xenoGVHD，以及如何实施盲法和标准化临床评分，以确保结果的一致性。此外，本方案还描述了如何使用数字PCR检测小鼠组织中的人源T细胞，从而可用于量化所测试疗法的有效性。xenoGVHD模型不仅为GVHD治疗提供了研究平台，也可用于评估任何能够抑制人源T细胞的疗法，这些疗法未来可能应用于多种炎症性疾病。

引言

同种异体造血干细胞移植（HSCT）已成为治疗预后不良的血液系统恶性肿瘤（如白血病）患者的常规疗法。HSCT 的一个严重并发症是急性移植物抗宿主病（GVHD）。2012 年的一项研究报道，在接受同胞供者移植的 HSCT 患者中，有 39% 发生急性 GVHD，而在接受无关供者移植的患者中，这一比例为 59%¹。急性 GVHD 是由供体来源的 T 细胞攻击受体器官所引起的。目前治疗 GVHD 唯一有效的方法是使用强效免疫抑制药物²，但这些药物具有高度毒性，会增加感染和肿瘤复发的风险。因此，尽管近年来在改善急性 GVHD 患者生存率方面已取得一定进展^3,4,5，但仍迫切需要开发毒性更低、能够促进长期缓解的新型 GVHD 治疗方法。

以下方法的总体目标是诱导并评估异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）。xenoGVHD模型作为一种研究工具，可用于利用人源细胞而非鼠源细胞诱导急性GVHD，从而更直接地将临床前GVHD研究结果转化为临床试验⁶。该模型通过尾静脉向亚致死剂量照射的NOD-SCID IL-2Rγnull（NSG）小鼠体内注射人外周血单个核细胞（PBM....

方案

所有小鼠实验均在堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会的合规监督下并经其批准后进行。所有健康人血液样本均在获得知情同意及堪萨斯大学医学中心机构审查委员会批准后获取。

1. NSG 小鼠的照射

1. 在PBMC注射前一天，对8至12周龄的NSG小鼠（可使用任一性别）进行照射。在无菌生物安全柜中，将小鼠放入已灭菌的派型鼠笼或独立通气笼具中。使用Cs¹³⁷放射源或小型动物照射仪（例如RS 2000），以150 cGy的总剂量对小鼠进行照射，同时缓慢旋转以确保照射均匀。
2. 将小鼠转移至无菌生物安全柜中的洁净笼盒内。

2. 注射用人外周血单个核细胞的制备

1. 采集足量的健康人血液，以分离出每只小鼠 1.1 × 10⁷ 个外周血单个核细胞（PBMC）。将肝素抗凝的血液用等体积含 2% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
   注意：采用本方案，通常每 10 mL 全血可获得 0.5–1 × 10⁷ 个 PBMC。每只小鼠将接受 10⁷ 个 PBMC，溶于 100 µL PBS 中。额外准备每只小鼠 1 × 10⁶ 个 PBMC（溶于 10 µL PBS），以确保在注射器加样过程中若出现损耗，仍能保证每只小鼠获得完整剂量。
....

结果

接受人外周血单个核细胞（PBMC）的亚致死剂量照射的8至12周龄NSG小鼠（两性均有），在注射后约第10天开始出现移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状，而仅接受磷酸盐缓冲液（PBS）的阴性对照小鼠则未出现相关症状（图1A）。异种GVHD（XenoGVHD）小鼠的中位生存期为23.5天（图1B）。通过数字PCR检测，在接受人PBMC的小鼠肺和肝组织样本中可检测到CD3ε阳性的人源T细胞。注射PBS的小鼠组织样本作为对照（图2）。

讨论

在异种移植物抗宿主病（xenoGVHD）模型中，即使使用不同供体的外周血单个核细胞（PBMC）进行注射，疾病进展通常也具有一致性，因此可将多个实验的数据合并分析。维持这种一致性的关键步骤包括正确的静脉注射技术、盲法操作以及一致的评分标准。Nervi 等人的一项研究²⁵表明，与尾静脉注射相比，经眶后注射PBMC可实现更稳定的植入效果并引发更严重的GVHD。Leon-Rico 等人²⁶也证实，与尾静脉注射相比，眶后注射在小鼠中可实现更稳定的造血干细胞植入。然而，如有必要，尾静脉注射也可作为xenoGVHD模型中的替代方法^27,28,29。

通过增加实验动物数量，可以降低尾静脉注射结果变异性的相关问题。此外，对小鼠进行评分的人员必须对小鼠的处理情况保持盲态，以避免在评估活动能力或毛发质地等较为主观的指标时引入.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Fisher	05-408-129
10 mL 血清移液管	VWR International	89130-898
10 mL BD 真空采血管 — 绿色盖，含肝素钠	Becton Dickinson	366480
250 µL Ranin 移液器吸头	Rainin	17001118	不得使用其他移液器或吸头进行液滴生成
50 mL 锥形管	VWR International	89039-656
96 孔微滴数字 PCR 板	Bio-Rad	12001925
ACK（氯化铵-氯化钾）溶血缓冲液	Lonza	10-548E	可选
酒精擦拭巾	Fisher Scientific	6818
麻醉室	World Precision Instruments	EZ-178	由动物设施提供
麻醉机	Parkland Scientific	PM1002	由动物设施提供
BD Vacutainer 安全锁式采血套装	Becton Dickinson	367281
用于 QX100/QX200 微滴生成仪的 DG8 微滴生成卡和垫圈	Bio-Rad	1864007
无 DNA 酶和 RNA 酶的分子级 H2O	Life Technologies	1811318
分子生物学级纯乙醇，200 proof	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
Ficoll	Fisher Scientific	45001750
胰岛素注射器	Fisher Scientific	329424
异氟烷	Sigma-Aldrich	CDS019936	由动物设施提供
液氮	N/A	N/A
小鼠辐照用 Pie 型鼠笼	Braintree Scientific, Inc.	MPC 1	最多可容纳 11 只小鼠
Nexcare 柔性纸质胶带（又称 3M Micropore 外科胶带 / 3/4"）	Fisher Scientific	19-027-761
P1000 移液器	MidSci	A-1000
P200 移液器	MidSci	A-200
可穿刺铝箔热封膜	Bio-Rad	1814040
Pipetaid Gilson Macroman 移液辅助器	Fisher Scientific	F110756
Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+	Rainin	17013805	不得使用其他移液器或吸头进行液滴生成
Qiagen DNeasy 血液与组织试剂盒	Qiagen	69506
qPCR 板	VWR International	89218-292
QX200 微滴数字 PCR 系统	Bio-Rad	12001925	包含微滴生成仪、微滴读取仪、笔记本电脑、软件及相关耗材，适用于 EvaGreen 或探针法数字 PCR 应用
用于 EvaGreen 的 QX200 微滴生成油	Bio-Rad	1864006
QX200 ddPCR EvaGreen 超级预混液	Bio-Rad	1864033
无 RNase 和 DNase 的板封膜	Thermo Scientific	12565491
RPMI Advanced 1640 培养基	Life Technologies	12633012
无菌纱布垫（2" × 2"，12 层）	Fisher Scientific	67522
无菌磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	21040CV
无菌储液槽	VWR International	89094-662
手术剪刀	Kent Scientific	INS600393-4
手术镊	Kent Scientific	INS650914-4