蛋白质从细胞表面逆行运输至高尔基体对于维持膜稳态至关重要。本文介绍一种利用功能化纳米抗体在HeLa细胞中对重组蛋白从细胞表面到高尔基体的运输进行生化分析的方法。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质和膜从细胞表面向高尔基体及更远区域的运输对于维持细胞稳态、细胞器特性及生理功能至关重要。为了研究逆向蛋白质运输，我们近期开发了一套多功能的基于纳米抗体的工具包，可用于通过固定细胞和活细胞成像、电子显微镜或生物化学方法，分析从细胞表面到高尔基体复合物的运输过程。我们构建了功能化的抗绿色荧光蛋白（GFP）纳米抗体——一种小分子、单体、高亲和力的蛋白质结合物——可应用于表达带有胞外GFP片段的膜蛋白的目标细胞系。这些衍生化的纳米抗体与GFP报告分子结合后，能够特异性地被内化，并沿着报告分子的分选路径“搭便车”进行运输。纳米抗体可通过标记荧光染料，用于荧光显微镜和活体成像追踪逆向运输过程；通过偶联抗坏血酸过氧化物酶2（APEX2），用于电子显微镜下研究报告分子-纳米抗体复合物的超微结构定位；或通过引入酪氨酸硫酸化（TS）基序，用于评估其到达反式高尔基网络（TGN）的动力学过程。在本方法学文章中，我们概述了在细菌中表达和纯化功能化纳米抗体的一般流程。我们以mCherry标记和TS修饰的纳米抗体为例，展示了该工具在分析内吞摄取及货物蛋白到达TGN过程中的强大应用。
引言
蛋白质和脂质从细胞表面逆向运输至各种细胞内区室，对于维持膜稳态、平衡分泌过程以及回收顺向运输机制的组分至关重要1,2通过网格蛋白依赖性或非依赖性内吞作用内化后，蛋白质和脂质货物首先到达早期内体，随后被进一步分选至内体-溶酶体系统、循环返回质膜，或靶向转运至反式高尔基网络（TGN）。从早期内体和/或细胞表面向TGN的循环转运，是多种顺向跨膜货物受体功能循环的一部分，例如依赖阳离子的和非依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体（CDMPR和CIMPR），它们负责将新合成的溶酶体水解酶从TGN转运至晚期内体和溶酶体3,4,5，sortilin 和 SorLA6,7以及Wntless（WLS）将Wnt配体转运至细胞表面8,9,10,11其他被回收至反式高尔基网络的蛋白质包括TG....
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方案
1. 利用功能化纳米抗体进行细菌转化
注意：本方案已针对功能化抗GFP纳米抗体的表达、纯化和分析进行了优化，如先前所述30。若与其他蛋白部分进行衍生化，可能需要对该标准方案进行修改。
- 将适用于蛋白表达的化学感受态细菌（约 100 µL）置于冰上融化（例如 Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) 细胞）。
注意：根据实验室常规操作制备化学感受态细菌细胞。或者，也可直接购买商业化的化学感受态细菌细胞。 - 加入 50 ng 编码功能化纳米抗体的质粒。为在细菌表达过程中实现纳米抗体报告分子的充分位点特异性生物素化，还需额外加入三倍过量（150 ng）编码生物素连接酶 BirA 的细菌表达质粒（质粒信息参见 表 1）。用移液器轻柔吹打混匀。
注意：若无需进行纳米抗体生物素化，或纳米抗体报告分子不含生物素受体肽（BAP），则无需共转化编码 BirA 的质粒。 - 将细菌细胞在冰上孵育 30 分钟。
- 将细菌细胞置于 42 °C 水浴或加热块中 1 分钟，进行热激处理。
- 加入 1 mL 室温（RT）的 LB 培养基（Luria broth....
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结果
为了研究蛋白质逆行运输至各种细胞内目的地的过程，我们近期建立了一种基于抗GFP纳米抗体的工具，用于标记并追踪从细胞表面开始的重组融合蛋白30。本文中，我们展示了此类修饰型纳米抗体的细菌表达生产方法，并演示了其在荧光显微镜和免疫印迹分析中用于研究内吞摄取的应用，以及通过硫酸化分析来检测其是否到达反式高尔基网络（TGN）的方法。后者是本实验方案的方法学重点。
我们通过标准分子克隆技术构建了一套具有共同特征但功能各异的抗GFP纳米抗体工具箱30。其中最简单的（标准型）纳米抗体VHH-std包含VHH结构域、用于后续特异性抗体检测的T7和HA表位、用于纯化的C端六组氨酸（His6）标签，以及一段生物素受体肽（BAP）序列，可用于生物素化及高亲和力链霉亲和素下拉实验（图1A）。通过对VHH-std进行衍生化改.......
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讨论
纳米抗体是一类新兴的蛋白质结合支架，相较于传统抗体具有诸多优势：分子量小、稳定性高、呈单体形式、可筛选出高亲和力的克隆，且不含二硫键33,35,44,45。它们已被广泛应用于多种研究场景，例如在发育生物学的细胞培养系统和模式生物中46,47,48,49，作为结构生物学中稳定构象状态的结晶伴侣50,51,52,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由瑞士国家科学基金会资助（项目编号 31003A-162643）。我们感谢Nicole Beuret以及巴塞尔大学生物中心成像核心设施（IMCF）提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗GFP抗体 | Sigma-Aldrich | 118144600001 | 产品由Sigma-Aldrich经销，但由Roche生产 |
| 抗His6抗体 | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| 抗肌动蛋白抗体 | EMD Millipore | MAB1501 | |
| 山羊抗兔HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| 山羊抗鼠HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich | D9542 | 溶于1× PBS/1% BSA |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Applichem | A3672 | |
| D-生物素 | Sigma-Aldrich | B4501 | 溶于无菌500 mM NaH2PO4 或DMSO |
| 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐（dALA） | Sigma-Aldrich | A3785 | 溶于无菌水 |
| DNase I | Applichem | A3778 | 溶于无菌水 |
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | 18037059001 | 产品由Sigma-Aldrich经销，但由Roche生产 |
| 布雷菲德菌素A（BFA） | Sigma-Aldrich | B5936 | |
| 嘌呤霉素 | Invivogen | ant-pr-1 | |
| 青霉素/链霉素 | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| L-谷氨酰胺 | Applichem | A3704 | |
| Dulbecco’s改良Eagle’s培养基（DMEM） | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| 胎牛血清（FCS） | Biowest | S181B-500 | |
| 硫-35（以硫酸钠形式） | Hartmann Analytics | ARS0105 | 产品含5 mCi |
| Earle's平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM氨基酸溶液（50×） | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM维生素溶液（100×） | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 11836153001 | 产品由Sigma-Aldrich经销，但由Roche生产 |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Applichem | A1008 | 溶于无菌水，储存液为1 M |
| 羧苄青霉素二钠盐 | Applichem | A1491 | 溶于无菌水，储存液为100 mg/mL |
| 硫酸卡那霉素 | Applichem | A1493 | 溶于无菌水，储存液为100 mg/mL |
| 考马斯亮蓝R（Brilliant Blue） | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Applichem | A3813 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| His GraviTrap层析柱 | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
| His缓冲液试剂盒 | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| 一次性PD10脱盐柱 | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Mini-Protean TGX凝胶，4–20%，15孔 | Bio-Rad | 456-1096 | |
| 不含Ca2+/Mg2+的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液（DPBS） | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35 mm培养皿 | Falcon | 353001 | |
| 6孔板 | TPP | 92406 | |
| 玻璃盖玻片（No. 1.5H） | VWR | 631-0153 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Applichem | A0999.0025 | 溶于40% DMSO和60%异丙醇，储存液为500 mM |
| 胰蛋白胨 | Applichem | A1553 | |
| 酵母提取物 | Applichem | A1552 | |
| 六水合氯化镁 | Merck Millipore | 105833 | 溶于无菌水，储存液为1 M |
| 二水合氯化钙 | Merck Millipore | 102382 | 溶于无菌水，储存液为1 M |
| 氯化钠 | Merck Millipore | 106404 | 溶于无菌水，储存液为5 M |
参考文献
- Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
- Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-5....
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