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方法文章

Astyanax 胚胎的整体原位杂交

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DOI：

10.3791/59114

⸱

2019年3月2日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati

本文内容

摘要

本方案可实现对 Astyanax 洞穴鱼胚胎中基因表达的可视化观察。该方法的开发旨在最大化基因表达信号，同时最小化非特异性背景染色。

摘要

近年来，盲眼墨西哥洞穴鱼（Astyanax mexicanus）的基因组草图已发布，揭示了数千个基因的序列信息。此前针对这一新兴模式生物系统的研究已利用全面的全基因组分析，鉴定了大量与洞穴相关表型相关的数量性状位点（QTL）。然而，将目标基因与表型变化的遗传基础相联系仍是一个重大挑战。一种有助于深入理解发育在洞穴形态进化中作用的技术是整体原位杂交（whole-mount in situ hybridization）。该技术可用于直接比较洞穴型与地表型个体间的基因表达，提名已知QTL区域内的候选基因，从新一代测序研究中鉴定感兴趣的基因，或发展其他基于发现的研究方法。在本报告中，我们提供了一种简单的实验方案，并辅以灵活的检查清单，该方案可广泛适用于本研究系统之外的多种研究场景。希望本方案能为 Astyanax 研究群体及更广泛的科研领域提供有价值的参考资源。

引言

原位杂交是一种常用的方法，用于对固定组织进行染色，以观察基因表达模式1。多年来，该技术已被应用于多种传统2和非传统3模式生物系统，开展各类生物学研究。然而，成功实施该实验流程需要多个步骤和多种试剂。对于从未操作过该技术的研究人员而言，由于步骤繁多，启动该过程可能令人望而生畏。此外，该实验流程耗时较长，容易引入技术误差，而这些误差往往难以排查和解决。

本文的总体目标是介绍一种简单直接的方法，使这种杂交技术能够被更广泛的受众所掌握。为了减少误差的引入，我们提出了一种简便的方案，可获得高质量的基因表达染色结果，并最大限度地降低非特异性背景信号。该方法与传统模式系统（如Danio rerio4）中已建立的其他方法类似。本文旨在通过提供可下载的检查清单（补充文件1），帮助研究者仔细执行每一步操作，从而促进实验方案的规范实施。这样做的目的是通过该流程所涉及的多个步骤实现良好的组织管理。本文适用于那些希望在发育胚胎中开展整体原位杂交实验但尚未实际操作过的研究人员。该方法对于Astyanax研究者的优势在于，其已在洞穴鱼和表层鱼两种形态中经过测试并被证实有效，因而有利于开展基因表达的比较分析。所介绍的方法可被应用于Astyanax及其他系统的相关研究中。

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方案

本文所述所有方法均已获得辛辛那提大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 #10-01-21-01）。

1. 固定

  1. 从繁殖缸中分离出所需数量的 Astyanax mexicanus 胚胎，每次固定约50个胚胎。如果胚胎较大且发育较晚，可能需要每次仅固定25个，以确保固定均匀。
  2. 根据胚胎的发育阶段，采用经IACUC批准的麻醉方法。对于具有功能性神经系统的较老胚胎，应通过过量麻醉实施安乐死。具体操作为将胚胎置于约1%三卡因（用缓冲液调节至pH 7.4）溶液中，以最大程度减少生物体的疼痛与不适。
  3. 当胚胎对触碰无反应时，移除含三卡因的系统用水，并加入约1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。
  4. 移除PBS溶液，加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA），于4 °C下过夜固定。
    注意：PFA具有危险性（例如易燃，并对皮肤和肺部有刺激性），操作时需谨慎。

2. 脱水

  1. 为了脱水胚胎，先移除固定液，并用 1 mL PBS 清洗。将装有胚胎的离心管倾斜放置（30° 至 45° 之间），并在清洗过程中置于平台摇床上。继续清洗胚胎两次，每次 5 分钟。
  2. 如果胚胎仍带有卵膜，请将全部 50 个胚胎转移至一个 100 mm × 25 mm 的培养皿中，在显微镜下使用两把钟表匠镊子（例如 #5 镊子）小心地将胚胎从卵膜中分离出来。
    注意：在以下步骤及本方案其余部分中，在加入下一种溶液前，务必使用洁净的玻璃巴斯德吸管彻底移除上一步的液体
  3. 按照下述步骤，使用浓度逐步增加的甲醇（MeOH）溶液对胚胎进行系列脱水。稀释液总体积为 1 mL，每种溶液取 500 µL 加入 4 mL 玻璃离心管中。所有脱水步骤均在室温（RT）下于平台摇床上进行。
    1. 小心移除 PBS 溶液，加入 25% MeOH 溶液（250 µL MeOH + 750 µL PBS），在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。
    2. 小心移除 25% MeOH 溶液，加入 50% MeOH 溶液（500 µL MeOH + 500 µL PBS），在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。
    3. 小心移除 50% MeOH 溶液，加入 75% MeOH 溶液（750 µL MeOH + 250 µL PBS），在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。
    4. 小心移除 75% MeOH 溶液，加入 100% MeOH 溶液（1 mL MeOH），在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。重复此步骤 3 次。
  4. 此时可根据需要将脱水后的胚胎保存在玻璃离心管中，置于 -20 °C 长期储存。或者，可直接进入本方案第 1 天的操作步骤。

3. 第1天：重水化

  1. 从 -20 °C 冰箱中取出干燥的胚胎（或直接从步骤 2.5 继续操作）。
  2. 使用巴斯德吸管对胚胎进行分选。可根据形态类型（即洞穴型和/或表型）以及每次实验检测的基因数量进行分选。分选后，每个小瓶中的胚胎通常不超过 12 个。为保持条理清晰，可使用彩色实验室胶带标记每个基因对应的小瓶和吸管。在整个实验流程中，胚胎将始终保留在同一小瓶中。
    注意：每次使用前后，应将巴斯德吸管的尖端浸入 100% 乙醇中以进行消毒。
  3. 将摇床水浴预热至 70 °C，供后续步骤使用。小心吸出装有已分选胚胎的小瓶中的甲醇，并替换为 500 µL 新的 100% 甲醇。在平台摇床上短暂清洗（约 1 分钟）。
  4. 在平台摇床上，使用浓度逐步增加的含吐温 20 的 1x PBS 缓冲液（PBT，见下文）对胚胎进行再水化处理。稀释方案基于最终体积为 1 mL，每小瓶加入 500 µL。
    1. 加入 25% PBT 溶液（250 µL PBT，750 µL 甲醇）。在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。
    2. 小心移除 25% PBT 溶液。加入 50% PBT 溶液（500 µL PBT，500 µL 甲醇）。在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。
    3. 小心移除 50% PBT 溶液。加入 75% PBT 溶液（750 µL PBT，250 µL 甲醇）。在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。
    4. 小心移除 75% PBT 溶液。加入 100% PBT 溶液（1 mL PBT）。在平台摇床上轻轻振荡 5 分钟。重复此步骤 3 次。

4. 第1天：消化与固定

  1. 通过将 1 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL）加入 2 mL PBT 中，配制蛋白酶 K（PK）溶液。
  2. 为准备后续步骤，从 -20 °C 冷冻保存中取出杂交缓冲液（Hyb- 和 Hyb+；参见 补充文件 2 和 补充文件 3）以及 PFA 的冻存 aliquot。
    1. 让 PFA 在室温下解冻。
    2. 将 Hyb- 和 Hyb+ 的 aliquot 置于旋转的 70 °C 水浴中。将所有试剂和小瓶放入一个带网状底部的小“垫圈”内，再置于浮式水浴装置中。此方法可方便地向旋转的 70 °C 水浴中添加或取出试管和小瓶。
  3. 轻柔地将 PK 溶液加入胚胎小瓶中，确保所有组织均被溶液完全覆盖。在平台摇床上用 PK 工作液消化胚胎约 12 分钟。
    注意：研究人员可根据需要调整消化时间，以确保获得最佳结果。
  4. 轻柔吸除 PK 溶液，并短暂用 PBT 冲洗小瓶，以稀释残留的 PK。
  5. 吸除 PBT 溶液，替换为 500 µL 新鲜 PBT。在平台摇床上清洗 5 分钟。
  6. 吸除 PBT，替换为 500 µL 解冻的 4% PFA。在室温下于平台摇床上孵育胚胎 20 分钟。
  7. 吸除 4% PFA，短暂用 PBT 冲洗小瓶以稀释残留的 PFA。吸除 PBT 后，加入 500 µL 新鲜 PBT，在平台摇床上清洗 5 分钟。重复此步骤 4 次。

5. 第1天：预杂交

  1. 将500 µL预热的Hyb-溶液加入小瓶中。小心地将小瓶放入70 °C水浴（置于密封垫圈内），静置5分钟，不要振荡。
  2. 吸除Hyb-溶液，加入500 µL预热的Hyb+溶液浸没小瓶。将小瓶放回70 °C水浴中，在40 rpm条件下振荡孵育。孵育时间可选择4小时或过夜。
    注意：4小时孵育可得到一个完整的原位杂交实验流程，总时长为4天。此处采用过夜孵育，可使整个实验流程总时长达到5天。

6. 第2天：杂交

  1. 从 -20 °C 冰箱中取出一份 Hyb+，放入振荡式热水浴中加热 5 分钟。
  2. 将小瓶中的 Hyb+ 吸出，并替换为 500 µL 预热的 Hyb+。向该溶液中，小心地向每个小瓶加入 2 µL RNA 探针。轻轻旋转小瓶，以确保探针均匀分布。
  3. 将含有探针的 Hyb+ 溶液置于 70 °C 热水浴中，同时以 40 rpm 振荡，过夜孵育。
    注意：可重复使用含有探针的 Hyb+ 溶液。具体操作为：从 -20 °C 冰箱中取出第一次实验后含探针的 Hyb+，放入热水浴中加热 5 分钟，然后用此含探针的 Hyb+ 替代第 1 天实验方案中的 Hyb+，并在热水浴中继续过夜孵育。

7. 第3天：溶液配制

  1. 准备标记为 Hyb+ 的微量离心管，并加入“目的基因”RNA 探针。准备第 3 天将要使用的系列稀释液。
    1. 使用 6 个独立的离心管，在 1 mL 体积中配制以下 Hyb- 与柠檬酸钠-氯化钠（SSC，0 至 100%）的系列稀释液，并将其置于 70 °C 摇动水浴中：1 号管 = 100% Hyb-（1 mL Hyb-）；2 号管 = 25% 2x SSC（250 µL 2x SSC + 750 µL Hyb-）；3 号管 = 50% 2x SSC（500 µL 2x SSC + 500 µL Hyb-）；4 号管 = 75% 2x SSC（750 µL 2x SSC + 250 µL Hyb-）；5 号管 = 100% 2x SSC（1 mL 2x SSC）；6 号管 = 100% 0.2x SSC（2 mL 0.2x SSC）。
      注意：请密切关注 SSC 浓度的变化，因其从 2x 变为 0.2x。
    2. 使用 4 个独立的离心管，在 1 mL 体积中配制以下 PBT 与 SSC 的系列稀释液，并置于室温：1 号管 = 25% PBT（250 µL PBT + 750 µL 0.2x SSC）；2 号管 = 50% PBT（500 µL PBT + 500 µL 0.2x SSC）；3 号管 = 75% PBT（750 µL PBT + 250 µL 0.2x SSC）；4 号管 = 100% PBT（1 mL PBT）。
    3. 准备一个含有 2 mL 含 Tween 20 的马来酸缓冲液（MABT）工作液的离心管。
    4. 准备两支 15 mL 圆锥形离心管，装入封闭溶液。每管中加入 0.2 g 封闭试剂至 10 mL MABT 中（参见 补充文件 4）。将两管均置于旋转混合仪（或平台摇床）上，直至试剂完全溶解（最长可达 3 小时）。

8. 第3天：探针移除

  1. 用玻璃巴斯德吸管吸取含探针的 Hyb+ 溶液，并将其转移至一个无菌且已标记的微量离心管中。若探针标记成功，将该管保存于 -20 °C 冰箱中以备后续使用。
  2. 小心加入 500 µL 温热的 SSC/Hyb- 稀释液（如下所示）。在 70 °C 摇床水浴中，依次在以下每种溶液中孵育 10 分钟：
    1. 依次孵育：100% Hyb-（1 mL Hyb-）、25% 2x SSC（250 µL 2x SSC + 750 µL Hyb-）、50% 2x SSC（500 µL 2x SSC + 500 µL Hyb-）、75% 2x SSC（750 µL 2x SSC + 250 µL Hyb-）、100% 2x SSC（1 mL 2x SSC）、100% 0.2x SSC（2 mL 0.2x SSC）。
  3. 完成上一步后，在以下每种溶液中于室温（RT）平台摇床上依次孵育 10 分钟：25% PBT（250 µL PBT + 750 µL 0.2x SSC）、50% PBT（500 µL PBT + 500 µL 0.2x SSC）、75% PBT（750 µL PBT + 250 µL 0.2x SSC）、100% PBT（1 mL PBT）。
  4. 在 10 分钟孵育后，弃去 100% PBT，向每个小瓶中加入 500 µL MABT。重复此步骤两次，每次 5 分钟。

9. 第3天：封闭

  1. 从每个小瓶中移除 MABT，并加入预先混合的封闭液（按步骤 7.1.4 制备）浸没样品。将小瓶置于摇床上，室温下摇动约 4 小时。
  2. 向另一管 10 mL 封闭液（按步骤 7.1.4 制备）中加入 2 µL Anti-DIG-AP Fab 片段，短暂涡旋混匀。
  3. 用封闭液（约 5 mL）将每个小瓶几乎完全充满，并于 4 °C 冰箱中在摇床上过夜孵育。

10. 第4天：MABT冲洗

  1. 准备一管10%正常山羊血清（NGS）的储存液，溶于MABT缓冲液中（向900 µL的MABT中加入100 µL NGS）。
  2. 吸除每管中的封闭液，向每管中加入500 µL NGS/MABT混合液。将胚胎置于平台摇床上，室温孵育25分钟。
  3. 用500 µL 100% MABT替换NGS/MABT混合液。在平台摇床上室温孵育30分钟。在当天内每30分钟重复此漂洗步骤，共进行12次。
  4. 用100% MABT充满管子，置于4 °C冰箱或冷室中的旋转混合仪上过夜孵育。

11. 第5天：探针可视化

  1. 配制 50 mL 碱性磷酸酶（AP）缓冲液（见 补充文件 5)。在50 mL锥形管中加入以下组分，并用铝箔包裹以减少光照：5 mL 1 M Tris（pH 9.5）、5 mL 50 mM MgCl₂21% Tween 20 5 mL，1 M NaCl 5 mL，ddH2O 30 mL。
  2. 移除 MABT，加入 1 mL AP 缓冲液（用铝箔包裹的离心管）。室温孵育 5 分钟。重复此步骤两次，以确保完全去除 MABT。
  3. 移除 AP 缓冲液，加入含有 3.5 μL 5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸盐（BCIP）和 4.5 μL 硝基蓝四氮唑（NBT）的 1 mL AP 缓冲液。每小时更换一次新配制的 AP 缓冲液/NBT/BCIP 溶液，直至反应完成。密切观察，每 15 分钟检查一次，使显色反应进行至达到理想的染色程度为止。若出现沉淀物，应提前更换溶液。
  4. 通过在新鲜的100% AP缓冲液（不含NBT/BCIP）中冲洗胚胎5分钟，终止显色反应。随后在PBT中继续冲洗，直至达到理想的信号水平（背景染色尽可能低）。接着按照以下顺序，用AP缓冲液对PBT进行梯度稀释并继续冲洗样本：25% PBT（250 μL PBT，750 μL AP缓冲液），冲洗5分钟；50% PBT（500 μL PBT，500 μL AP缓冲液），冲洗5分钟；75% PBT（750 μL PBT，250 μL AP缓冲液），冲洗5分钟。
  5. 在摇床上用约 5 mL 100% PBT 清洗胚胎，直至达到理想的最低背景染色水平。多次更换新鲜的 PBT。此过程可能需要持续数天。
  6. 冲洗完成后，在平台摇床上用500 μL无菌PBS洗涤胚胎，每次5 min，共洗涤两次。PBS洗涤后，在平台摇床上用500 μL 4% PFA于室温固定1 h。或者，可在4 °C冰箱中用1 mL 4% PFA过夜固定。
  7. 用新鲜的无菌 PBS 替换固定液，每次用 5 分钟，至少冲洗两次。将胚胎置于约 4 mL 的 100% 无菌 PBS 中，于 4 °C 长期保存。

12. 成像

  1. 使用3%琼脂糖和TAE缓冲液在培养皿中制备成像板。
    注意：用量取决于所需平板的数量。平板可重复使用多次。建议在凝胶冷却过程中将一个浅的矩形模具放入培养皿中，以形成用于容纳胚胎的凹陷区域。
  2. 将胚胎置于含有PBS的平板上。
    注意：最好轻轻将胚胎倾倒到平板上，而不是用移液器吹出，因为发现胚胎会粘附在塑料移液管内壁上。
  3. 使用光学显微镜观察每个胚胎。用钝头探针调整胚胎至所需位置。
  4. 当胚胎处于所需位置时拍摄图像。请注意，应在染色完成后几周内对胚胎进行成像，以避免染料可能发生降解。

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结果

本报告中，我们提供了一种简单直接的方法，用于对胚胎期 Astyanax 样本进行标记，以实现高质量的基因表达分析。该技术可在四天或五天内完成，实验流程中的每个主要步骤均以颜色编码的流程图表示（图1）。完成染色后，表达特定目标基因的组织应呈现深紫色的显色信号。我们已成功将该方案应用于帕琼洞穴鱼（图2A-B,E）和表层鱼（图2C-D,F）的胚胎样本。

对洞穴鱼胚胎进行了两种标记早期神经嵴组织的转录因子染色，即Sox9和Tfap2a5,<...

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讨论

由于RNA极易降解，该实验方案中最关键的步骤之一是RNA探针的无菌合成。然而，如果探针制备得当且结果良好，则可在后续染色反应中重复使用。第二个关键步骤是实验全程所用试剂的精确配制。由于该方案耗时数天且包含大量细微步骤，因此所有试剂的准确配制及无菌保存至关重要。此外，研究者必须仔细记录方案中的每一步操作。我们发现，所提供的操作步骤清单对于确保本方案各个部分得以准确而精确地完成极为有用。

我们通常不修改本文所提供的实验方案。然而，研究者可以采用与建议温度（即70 °C）不同的温度进行探针孵育。杂交温度的微小变化会影响RNA探针的结合，因此，寻找最佳杂交温度可有效提高染色质量。关于问题排查，我们强烈建议其他研究者使用本文提供的检查清单（补充文件1）。保持详细的实验记录是确保高质量染色的必要第一步。另一个建议的小幅修改是，在最终显色反应过程中不进行振荡（例如，不使用平台摇床或振荡器）。原因是，我们偶尔会观察到沉淀物的产生，推测其来源于碱性磷酸酶（AP）缓冲液。这种沉淀物通常会过度染色成深色，并在染色组织上形成点状（非特异性）背景。为尽量减少此类沉淀物的生成...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢Gross实验室成员对本文稿提出的有益意见。我们谨向四位在2017年和2018年暑期实习期间使用本实验方案的高中生表示感谢，他们分别是Christine Cao、Michael Warden、Aki Li和David Nwankwo。HL在2017年夏季获得了加州大学生物学STEM奖学金的支持。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF；项目编号DEB-1457630，授予JBG）以及美国国立牙科与颅面研究所（NIH；项目编号DE025033，授予JBG）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液管VWR89130-888
1000 mL 过滤装置VWR89220-698
15 mL 圆锥形离心管VWR-Greiner82050-278
25 mL 血清移液管VWR89130-890
250 mL 过滤装置VWR89220-694
5 mL 血清移液管VWR89130-886
50 mL 圆锥形离心管VWR-Falcon21008-940
500 mL 过滤装置VWR89220-696
抗地高辛碱性磷酸酶 Fab 片段Sigma-Roche11093274910
BCIPSigma-AldrichB8503-1G1 g
封闭液Sigma-Roche11 096 176 00150 g
柠檬酸Fisher ScientificA104-500500 g
DIG RNA 标记试剂盒（SP6/T7）Sigma-Roche11175025910
Eppendorf 管VWR20170-577
乙醇Fisher-Decon04-355-2231 加仑
甲酰胺Thermo Fisher Scientific17899100 mL
玻璃小瓶VWR66011-0411 盎司
玻璃移液管Fisher Scientific13-678-8A
HClThermal-ScientificPharmco-AAPER284000ACS500 mL
肝素SigmaH3393-25KU
氯化镁（结晶）Fisher ScientificM33-500500 g
马来酸SigmaM0375-100g100 g
甲醇Fisher ScientificA452-44 L
分子级水（无 RNase）VWR7732-18-5500 mL
NaClFisher ScientificS271-33 kg
NaOH 颗粒Fisher ScientificS318-500500 g
NBT 底物粉末ThermoFisher Scientific340351 g
正常山羊血清Fisher-Invitrogen31873
旋转混合仪VWR82007-202
多聚甲醛Sigma158127-500g500 g
PBS 10xFisher ScientificBP399-2020 L
蛋白酶 K（200 mg/10 mL）Qiagen1913310 mL
塑料移液管VWR-Samco14670-147
RNaseSigmaR2020-250mL250 mL
12 L 摇床水浴锅VWR10128-12612 L
标准模拟摇床VWR89032-092
TrisSigma Millipore-OmniPur9210-500GM500 g
酵母 tRNAFisher-Invitrogen1540101125 mg
Tween 20SigmaP9416-50mL50 mL
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc50-728-002
氯化锂（LiCl）Sigma-Aldrich203637-10G10 g

参考文献

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