本方案可实现对 Astyanax 洞穴鱼胚胎中基因表达的可视化观察。该方法的开发旨在最大化基因表达信号，同时最小化非特异性背景染色。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，盲眼墨西哥洞穴鱼（Astyanax mexicanus）的基因组草图已发布，揭示了数千个基因的序列信息。此前针对这一新兴模式生物系统的研究已利用全面的全基因组分析，鉴定了大量与洞穴相关表型相关的数量性状位点（QTL）。然而，将目标基因与表型变化的遗传基础相联系仍是一个重大挑战。一种有助于深入理解发育在洞穴形态进化中作用的技术是整体原位杂交（whole-mount in situ hybridization）。该技术可用于直接比较洞穴型与地表型个体间的基因表达，提名已知QTL区域内的候选基因，从新一代测序研究中鉴定感兴趣的基因，或发展其他基于发现的研究方法。在本报告中，我们提供了一种简单的实验方案，并辅以灵活的检查清单，该方案可广泛适用于本研究系统之外的多种研究场景。希望本方案能为 Astyanax 研究群体及更广泛的科研领域提供有价值的参考资源。
引言
原位杂交是一种常用的方法，用于对固定组织进行染色，以观察基因表达模式1。多年来，该技术已被应用于多种传统2和非传统3模式生物系统，开展各类生物学研究。然而，成功实施该实验流程需要多个步骤和多种试剂。对于从未操作过该技术的研究人员而言，由于步骤繁多，启动该过程可能令人望而生畏。此外，该实验流程耗时较长，容易引入技术误差，而这些误差往往难以排查和解决。
本文的总体目标是介绍一种简单直接的方法，使这种杂交技术能够被更广泛的受众所掌握。为了减少误差的引入，我们提出了一种简便的方案，可获得高质量的基因表达染色结果，并最大限度地降低非特异性背景信号。该方法与传统模式系统（如Danio rerio4）中已建立的其他方法类似。本文旨在通过提供可下载的检查清单（补充文件1），帮助研究者仔细执行每一步操作，从而促进实验方案的规范实施。这样做的目的是通过该流程所涉及的多个步骤实现良好的组织管理。本文适用于那些希望在发育胚胎中开展整体原位杂交实验但尚未实际操作过的研究人员。该方法对于Astyanax研究者的优势在于，其已在洞穴鱼和表层鱼两种形态中经过测试并被证实有效，因而有利于开展基因表达的比较分析。所介绍的方法可被应用于Astyan....
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方案
本文所述所有方法均已获得辛辛那提大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 #10-01-21-01）。
1. 固定
- 从繁殖缸中分离出所需数量的 Astyanax mexicanus 胚胎，每次固定约50个胚胎。如果胚胎较大且发育较晚，可能需要每次仅固定25个，以确保固定均匀。
- 根据胚胎的发育阶段，采用经IACUC批准的麻醉方法。对于具有功能性神经系统的较老胚胎，应通过过量麻醉实施安乐死。具体操作为将胚胎置于约1%三卡因（用缓冲液调节至pH 7.4）溶液中，以最大程度减少生物体的疼痛与不适。
- 当胚胎对触碰无反应时，移除含三卡因的系统用水，并加入约1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。
- 移除PBS溶液，加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA），于4 °C下过夜固定。
注意：PFA具有危险性（例如易燃，并对皮肤和肺部有刺激性），操作时需谨慎。
2. 脱水
- 为了脱水胚胎，先移除固定液，并用 1 mL PBS 清洗。将装有胚胎的离心管倾斜放置（30° 至 45° 之间），并在清洗过程中置于平台摇床上。继续清洗胚胎两次，每次 5 分钟。
- 如果胚胎仍带有卵膜，请将全部 50 个胚胎转移至一个 100 mm × 25 mm 的培养皿中，在....
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结果
本报告中，我们提供了一种简单直接的方法，用于对胚胎期 Astyanax 样本进行标记，以实现高质量的基因表达分析。该技术可在四天或五天内完成，实验流程中的每个主要步骤均以颜色编码的流程图表示（图1）。完成染色后，表达特定目标基因的组织应呈现深紫色的显色信号。我们已成功将该方案应用于帕琼洞穴鱼（图2A-B,E）和表层鱼（图2C-D,F）的胚胎样本。
对洞穴鱼胚胎进行了两种标记早期神经嵴组织的转录因子染色，即Sox9和Tfap2a5,<.......
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讨论
由于RNA极易降解，该实验方案中最关键的步骤之一是RNA探针的无菌合成。然而，如果探针制备得当且结果良好，则可在后续染色反应中重复使用。第二个关键步骤是实验全程所用试剂的精确配制。由于该方案耗时数天且包含大量细微步骤，因此所有试剂的准确配制及无菌保存至关重要。此外，研究者必须仔细记录方案中的每一步操作。我们发现，所提供的操作步骤清单对于确保本方案各个部分得以准确而精确地完成极为有用。
我们通常不修改本文所提供的实验方案。然而，研究者可以采用与建议温度（即70 °C）不同的温度进行探针孵育。杂交温度的微小变化会影响RNA探针的结合，因此，寻找最佳杂交温度可有效提高染色质量。关于问题排查，我们强烈建议其他研究者使用本文提供的检查清单（补充文件1）。保持详细的实验记录是确保高质量染色的必要第一步。另一个建议的小幅修改是，在最终显色反应过程中不进行振荡（例如，不使用平台摇床或振荡器）。原因是，我们偶尔会观察到沉淀物的产生，推测其来源于碱性磷酸酶（AP）缓冲液。这种沉淀物通常会过度染色成深色，并在染色组织上形成点状（非特异性）背景。为尽量减少此类沉淀物的生成.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Gross实验室成员对本文稿提出的有益意见。我们谨向四位在2017年和2018年暑期实习期间使用本实验方案的高中生表示感谢，他们分别是Christine Cao、Michael Warden、Aki Li和David Nwankwo。HL在2017年夏季获得了加州大学生物学STEM奖学金的支持。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF；项目编号DEB-1457630，授予JBG）以及美国国立牙科与颅面研究所（NIH；项目编号DE025033，授予JBG）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 血清移液管 | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL 过滤装置 | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL 血清移液管 | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL 过滤装置 | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL 血清移液管 | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL 过滤装置 | VWR | 89220-696 | |
| 抗地高辛碱性磷酸酶 Fab 片段 | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| 封闭液 | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| 柠檬酸 | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA 标记试剂盒（SP6/T7） | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf 管 | VWR | 20170-577 | |
| 乙醇 | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 加仑 |
| 甲酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| 玻璃小瓶 | VWR | 66011-041 | 1 盎司 |
| 玻璃移液管 | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| 肝素 | Sigma | H3393-25KU | |
| 氯化镁（结晶） | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| 马来酸 | Sigma | M0375-100g | 100 g |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452-4 | 4 L |
| 分子级水（无 RNase） | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH 颗粒 | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT 底物粉末 | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| 正常山羊血清 | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| 旋转混合仪 | VWR | 82007-202 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20 L |
| 蛋白酶 K（200 mg/10 mL） | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| 塑料移液管 | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNase | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| 12 L 摇床水浴锅 | VWR | 10128-126 | 12 L |
| 标准模拟摇床 | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| 酵母 tRNA | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 涡旋振荡器 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| 氯化锂（LiCl） | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
参考文献
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as r....
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重印与许可
