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方法文章

线粒体DNA污染低的原代人CD4+ T淋巴细胞ATAC-seq检测

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DOI：

10.3791/59120

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2019年3月22日

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

本文内容

摘要

本文介绍了一种在活化的人类CD4+淋巴细胞上进行转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）的实验方案。通过引入一种新的裂解缓冲液，该方案经过优化，可将线粒体DNA读段的污染从50%降至3%。

摘要

由于ATAC-seq技术具有快速且简便地绘制全基因组可及染色质图谱的优势，现已成为表观遗传学研究中广泛应用的方法。本文介绍了一种改进的ATAC-seq实验流程，可显著降低线粒体DNA读段的污染。以往的ATAC-seq实验流程通常存在约50%的线粒体DNA污染读段，而本流程中引入的优化 裂解缓冲液可将线粒体DNA污染降低至平均3%。该改进的ATAC-seq流程几乎可使测序成本降低50%。我们展示了如何从活化的CD4+淋巴细胞制备高质量的ATAC-seq文库，并提供了从全血中分离CD4+淋巴细胞到数据分析的详细操作步骤。该优化的ATAC-seq流程已在多种细胞类型中得到验证，将为研究染色质可及性的科研人员提供即用且可靠的技术支持。

引言

转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）分析已迅速成为研究染色质结构的主流方法。ATAC-seq 通过标签化剪切（tagmentation）过程来识别可及性染色质区域，该过程由同一种酶完成DNA的片段化和标签添加，从而构建测序文库，用于全基因组范围内染色质可及性的测定。这一标签化剪切过程由高活性Tn5转座酶介导，由于核小体的空间位阻效应，Tn5转座酶仅切割染色质的开放区域。在切割的同时，Tn5转座酶还会插入测序接头，从而通过PCR快速构建文库，并进行全基因组可及性染色质的高通量测序1,2。

由于ATAC-seq具有相对简单快速的实验流程、可从结果中获取高质量和广泛的信息，以及所需起始材料量少等优点，已成为确定染色质可及性区域的首选方法。与同样检测全基因组染色质可及性的DNase-seq3、用于确定开放基因组区域中核小体位置的MNase-seq4，以及甲醛介导的FAIRE-seq5相比，ATAC-seq更快捷、成本更低且可重复性更高1。此外，ATAC-seq的灵敏度更高，仅需低至500个细胞核即可开展实验，而DNase-seq则需要多达5000万个细胞核3。ATAC-seq还能比其他方法提供更丰富的染色质结构信息，包括转录因子结合区域、核小体定位以及开放染色质区域1。目前已有经过验证的高效单细胞ATAC-seq实验方案，可在单细胞水平上提供染色质结构的相关信息6,7。

ATAC-seq 已被用于表征多种研究领域和细胞类型的染色质结构，包括植物8、人类9以及许多其他生物体。该技术在识别疾病状态下表观遗传调控方面也发挥了关键作用7。然而，目前最广泛使用的 ATAC-seq 方案存在一个主要缺陷，即测序读段中存在线粒体 DNA 的污染。在某些数据集中，这种污染水平可高达测序结果的 60%1。目前研究领域正共同努力减少这些线粒体来源的污染读段，以提高 ATAC-seq 的应用效率7,10,11。 本文提出了一种改进的 ATAC-seq 方案，可将线粒体 DNA 污染率降低至仅 3%，从而节省约 50% 的测序成本10。这一改进得益于简化的 CD4+ 淋巴细胞分离与活化流程，以及一种在最大程度减少线粒体 DNA 污染方面至关重要的优化裂解缓冲液。

该改良的ATAC-seq方案已在多种原代细胞中得到验证，包括人原代外周血单个核细胞（PBMCs）10、人原代单核细胞以及小鼠树突状细胞（未发表数据）。该方法还成功应用于黑色素瘤细胞系，在针对非编码元件的规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）筛选中实现了有效检测11。此外，本方案中描述并在GitHub上提供的数据分析软件包，为新进和有经验的研究人员提供了分析ATAC-seq数据的实用工具。ATAC-seq是全基因组范围内绘制染色质可及性图谱最有效的检测方法，本文所引入的现有方案的优化改进，将有助于研究人员获得高质量数据，同时降低线粒体DNA污染，减少测序成本并提升ATAC-seq的通量。

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方案

本改进方案提供了从全血起始材料到数据分析的CD4+淋巴细胞ATAC-seq实验的逐步操作说明（图1）。

1. 从全血中分离CD4+ T细胞

注意：本实验方案的起始材料为采用标准方法采集的15 mL新鲜全血，起始材料的来源可根据研究需求进行选择。根据需要对实验步骤进行相应放大或缩小。在开始CD4+ T细胞富集操作前，将磷酸盐缓冲液（PBS）加2%胎牛血清（FCS）预热至室温（RT），并将离心机调节至室温。

  1. 在50 mL锥形管中，向15 mL全血加入750 µL人CD4+ T细胞富集混合液，通过倒置轻轻混匀。室温孵育20分钟。孵育完成后，向管中加入15 mL PBS + 2% FCS，通过倒置轻轻混匀。
  2. 在另一个新的50 mL锥形管中加入15 mL密度介质。小心地将稀释后的血液样本叠加在密度介质上方，注意不要破坏形成的密度介质与血液之间的界面。在室温下以1,200 × g离心20分钟，加速度设为1，降速刹车设为关闭。
    注意：必须将离心机的加速度设为1且降速刹车关闭，以避免破坏密度介质中的细胞层。
  3. 使用细颈移液管从密度介质与血浆界面收集富集的CD4+ T细胞。将收集的细胞转移至一个新的50 mL锥形管中。在室温下以423 × g离心8分钟，收集CD4+ T细胞。
    注意：请确保在步骤1.3及后续所有步骤中，将离心机加速度恢复至9，降速刹车设为开启。
  4. 弃去上清液，并用50 mL PBS + 2% FCS将细胞沉淀洗涤两次，每次在室温下以423 × g离心8分钟。弃去最后一次洗涤的上清液，将洗涤后的细胞沉淀重悬于2 mL PBS + 2% FCS中。
  5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。如需继续进行ATAC-seq实验，请进入步骤2.3；如需将细胞冷冻以备后续处理，请进入步骤1.6。
  6. 每100万个细胞加入1 mL新鲜配制的冻存液（90% FCS + 10%二甲基亚砜）。将含细胞的冻存液按每管1 mL分装至冻存安全管中。将冻存管置于-80 °C慢速冷冻容器中过夜。次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
    注意：每2 mL原始全血体积可分离出约100万个CD4+ T细胞。建议将500,000个细胞分装至1 mL冻存液中。每次使用时均需新鲜配制冻存液。

2. 激活并纯化 CD4+ T 细胞

注意：该激活和纯化CD4+ T细胞的快速方案仅需48小时，即可获得95%存活率的活化CD4+ T细胞。在开始实验前，需将离心机预冷至4 °C。

  1. 在37 °C水浴中解冻1管（500,000个）CD4+ T细胞，直至冰晶刚刚融化。轻柔地将细胞转移至含有9 mL预热的含10%胎牛血清（FCS）的Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培养基（以下简称完全RPMI）的15 mL锥形管中。
    注意：不要让细胞完全解冻，以避免暴露于DMSO中。
  2. 在1500 × g、4 °C条件下离心6分钟。弃去上清液，轻柔地将沉淀重悬于2 mL完全RPMI中。再次离心，弃去上清液，并将细胞轻柔地重悬于0.5 mL完全RPMI中。
  3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。用完全RPMI调整细胞悬液密度，使每孔加入200 µL，接种50,000个细胞至96孔圆底板的每个孔中。
    注意：从一管冻存的50万个CD4+ T细胞出发，可在96孔板中接种10孔，每孔含50,000个CD4+ T细胞，体积为200 µL。
  4. 准备偶联人T激活剂抗CD3和抗CD28抗体的磁珠。
    1. 将每份ATAC-seq样本12.5 µL的人T激活剂CD3/CD28磁珠分装至1.5 mL离心管中。用1 mL 1× PBS洗涤磁珠，并将离心管置于磁力架上1分钟。
    2. 小心移除并弃去澄清的上清液，将离心管从磁力架上取下，并将磁珠重悬于每份ATAC-seq样本13 µL的完全RPMI中。
      注意：根据待处理的ATAC-seq样本数量计算所需磁珠总量。本方案中每500,000个细胞（即一个ATAC-seq样本）需要12.5 µL CD3/CD28磁珠。
  5. 激活CD4+ T细胞。在15 mL锥形管中收集500,000个细胞于2.1 mL完全RPMI培养基中，并加入12.5 µL预洗涤的人T激活剂磁珠。通过轻轻翻转离心管混合均匀。
  6. 使用多通道移液器将含磁珠的细胞轻柔转移至无菌储液槽中，并将每孔200 µL的细胞-磁珠混合液加入96孔圆底板的各孔中。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育48小时。
  7. 孵育结束后，将96孔板在423 × g、室温条件下离心8分钟。从每孔中移除100 µL培养基，收集至锥形管中后再弃去，以确保无磁珠丢失。将细胞沉淀重悬于剩余的100 µL液体中，并全部收集至1.5 mL离心管中。
    注意：10孔激活后的T细胞将被收集至总体积为1 mL的溶液中。
  8. 进行CD4+细胞分离。在含500,000个细胞的1 mL完全RPMI中加入50 µL预洗涤的CD4偶联磁珠。使用移液器混匀磁珠与细胞。在4 °C冰箱中孵育20分钟，每隔6分钟轻轻震荡混合一次。
    注意：本方案适用于一份500,000个细胞的样本。若处理两份或更多相同规模的样本，请相应调整试剂用量。
  9. 孵育完成后，将离心管置于磁力架上2分钟。待上清澄清后，移除并弃去上清液。通过将离心管从磁力架上取下，用1 mL PBS + 2% FCS重悬磁珠结合的细胞，再放回磁力架上1分钟，随后弃去澄清上清液，完成一次洗涤。重复该过程，共洗涤3次。
    注意：洗涤过程中务必小心，避免丢弃磁珠。
  10. 最后一次洗涤后，将离心管置于磁力架上1分钟。移除并弃去上清液，将沉淀置于冰上。随后进入第3节（ATAC-seq）操作。

3. ATAC-seq

注意：在此步骤中，从活化的 CD4+ T 细胞中分离细胞核用于 ATAC-seq。本方案所用的裂解缓冲液已优化，对细胞核更温和，从而实现更高效的消化并获得更高质量的结果。第 3 部分中的所有离心步骤均使用保持在 4 °C 的固定角度离心机进行。开始实验前需预先将离心机冷却。

  1. 进行细胞核分离。用预冷的裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.03% 吐温-20）重悬磁珠和细胞。立即在500 x g离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。移除并弃去上清液。
  2. 进行转座酶反应。用50 µL Tn5转座酶混合物重悬分离的细胞核沉淀（表1在37 °C下孵育30分钟，热盖温度设为40 °C，孵育结束后置于4 °C保存。
  3. 热循环结束后，立即进行短暂台式离心，然后将离心管置于磁力架上1分钟，以去除产物中的磁珠。
  4. 将磁力架上离心管中的澄清上清液转移至DNA纯化柱中。用250 µL PB缓冲液洗涤柱子一次，再用750 µL PE缓冲液洗涤两次。用10 µL洗脱缓冲液洗脱样品。立即进入步骤3.5。
    注意： 此步骤用于扩增带有连接接头的DNA片段，此处称为ATAC-seq文库。为了将多个ATAC-seq文库混合后在同一NGS测序通道中运行，所有样本应使用无索引的引物1，而各个样本则使用不同的带索引的引物2（表2）。引物的工作浓度为 1.25 µM。
  5. 在无核酸酶的PCR管中配制初始PCR扩增反应体系，按指定的顺序和体积加入各组分 表3. 将PCR管放入热循环仪中，并按照指定的循环条件运行PCR扩增程序 表4.
  6. 通过qPCR监测反应。在无核酸酶的PCR管中配制qPCR反应体系，组分及用量按表5所示顺序和体积加入。将反应管放入qPCR仪中，按照表6规定的循环程序进行扩增。
    1. 为确定剩余45 µL反应体系所需的额外扩增循环数，绘制以循环数为横轴、相对荧光单位（RFU）为纵轴的曲线图。最佳额外扩增循环数为qPCR反应达到平台期所需循环数的三分之一。
      注意：通过qPCR监测反应可确定获得最佳文库片段扩增效果所需的最优PCR循环次数，同时最大限度减少GC含量和片段大小带来的偏差。
  7. 完成剩余45 µL PCR反应体系的最终PCR扩增。将步骤3.5中得到的PCR扩增反应管重新放入热循环仪，按照所述程序运行 表7.
    注意： 根据本方案所述方法处理的样本，PCR扩增的最佳总循环数确定为12个。
  8. 扩增完成后，使用PCR纯化试剂盒按照制造商的说明书纯化文库，用25 µL洗脱缓冲液洗脱。
    注意： 扩增后的文库可在4 °C下保存最多48小时，或在-20 °C冷冻以长期保存。

4. ATAC-seq 文库质量分析

注意：在进行下一代测序之前，验证ATAC-seq文库的质量和数量非常重要。应使用市售试剂盒（参见材料表）评估文库的质量和数量。

  1. 使用基于微流控技术的平台对DNA进行片段大小分析、定量和质量控制，以评估ATAC-seq文库的质量和数量。代表性质量评估结果见图2。
    注意：为获得高质量的测序结果，ATAC-seq文库的浓度必须>1 ng/µL。平均可获得25 µL中含30 nM的文库。

5. 测序与数据分析

注意：该分析流程允许用户控制读段比对过程的质量，调整实验设计的坐标参数，并进行下游分析的峰位识别。以下是命令行及其执行说明。数据分析软件包可从以下网址获取：(https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq)。

  1. 在下一代测序仪上对制备好的文库进行测序，每个样本的平均测序深度达到4200万条读长。
  2. 通过检查 FastQC 生成的文件来评估测序读段的质量12 使用以下命令的软件包：
    fastqc -o <输出目录> <fastq_file>
  3. 使用 Trimmomatic 对测序读段进行末端修剪13 如有需要，根据 FastQC 质量检测结果，使用以下命令（针对双端测序）进行软件处理：
    java -jar <trimmomatic jar 文件的路径> PE <input1> <输入2> <配对输出1> <未配对输出1> <配对输出2> <未配对输出2> 头部切除<作物基部>
  4. 使用 Bowtie2 将测序读段比对至人类参考基因组（hg38）14 软件：
    bowtie2 -x <参考基因组> -1 <输入对 1> <输入对 2> - <输出 SAM 文件>
    注意： 参数 -x 用于指定参考基因组索引的基名称，-S 用于指定输出为 SAM 格式。
  5. 使用 Samtools 检查比对后 reads 的质量15 flagstat 软件包：
    samtools flagstat <BAM 文件>
  6. 使用 Picard 对比对后的 reads 文件进行排序并去除重复序列16 工具：
    java -jar picard.jar SortSam INPUT=<输入的 SAM 文件名> OUTPUT=<输出排序后的 BAM 文件名称> 排序顺序=坐标”和“java -jar picard.jar 标记重复序列 INPUT=<排序后的 BAM 文件> OUTPUT=<无重复序列的 BAM 输出文件> REMOVE_DUPLICATES=TRUE
  7. 索引 BAM 文件，为 ATAC-seq 实验目的剪除未使用的染色体读段并调整坐标17:
    java -jar picard.jar BuildBamIndex INPUT=<BAM 文件>
    samtools idxstats <输入 BAM 文件> | cut -f 1 | grep -v chrY | grep -v chrM | grep -v chrUn | xargs samtools view -b <输入 BAM 文件> > <输出修剪后的 BAM 文件>
    bedtools bamtobed -i <输入经修剪的 BAM 文件> > <输出修剪后的 BED 文件>
    awk 'BEGIN {OFS = "\t"} ; {如果 ($6 == "+"）打印 $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6；否则打印 $1, $2 - 5, $3 - 5, $4, $5, $6}' <输入经修剪的 BED 文件> <修剪后的移位 BED 文件>
  8. 删除移位到负坐标的读段：
    awk '{if ($2 > 0) 输出 $1 "（空）" $2 "（无内容可翻译）" $3 "\t" $4 "（无内容需翻译）" $5 "\t" $6 }' <输入 BED 文件> <输出非负坐标的 BED 文件>.
  9. 将 BED 文件转换为 BAM 文件，以用于后续的 DiffBind 分析18 分析：
    bedtools bedtobam -i <输入 BED 文件> -克 <参考基因组> <输出 BAM 文件>
  10. 使用 DiffBind 进行峰识别18 软件包：
    macs2 callpeak -t <输入 BAM 文件> -f BAM -g hs -nomodel --nolambda --keep-dup all --call-summits --outdir <输出目录路径> - n <输出名称> -B -q 0.01 --bdg --shift -100 --extsize 200
    注意： 过滤后，每个样本预计中位数为 3700 万条读段。线粒体 DNA 污染率范围为 0.30%–5.39%（平均 1.96%）。多重比对读段的比例较低（6.7%–56%，平均 19%），可用的核读段比例相对较高（60%–92%，平均 79%）。

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结果

从15 mL新鲜全血中，本方案可平均获得100万个CD4+ T细胞。这些细胞可冷冻保存以备后续处理，也可立即使用。无论新鲜或冻融后的CD4+ T细胞，其活力均保持稳定 >95%。该CD4+ T细胞分离方法在样本来源和采集时间上具有较高的灵活性。改进后的ATAC-seq实验流程所获得的最终文库产量超过1 ng/µL 用于测序。使用市售系统进行质量控制时，应显示DNA片段大小在200至1,000 bp之间（图2）。测序应仅使用高质量的文库进行。

所有文库的测序深度均达到平均每样本超过4000万条读段。尽管这一标准常被采用 ATAC-seq 实验方案常受到线粒体DNA污染的挑战，其测序读段可占总测序读段的50%–60%1 此改进后的方案消除了该问题。按照本方案制备的文库中，线粒体读段平均仅占3%（

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讨论

本文介绍的改进型ATAC-seq方案可获得可重复的结果，并将线粒体DNA污染降至最低。该方案已成功用于表征人原代外周血单个核细胞（PBMCs）10、人单核细胞、小鼠树突状细胞（未发表）以及培养的黑色素瘤细胞系11的染色质结构。我们预计这种优化的裂解条件也有望适用于其他细胞类型。同时预计，该细胞核分离方案可与单细胞核ATAC-seq方案兼容，通过减少线粒体DNA污染来提升测序结果质量。

该改良方案的另一个优势在于，可根据患者样本的可获得性，在不同时间点分批冻存从PBMCs中分离的CD4+ T细胞。由于随后可对所有样本同时进行ATAC-seq，从而最大限度地减少了转座酶反应和测序过程中潜在的批次效应偏差10。每次使用时必须新鲜配制冻存液，以维持该冻融方案所能达到的高细胞活力。为避免转座酶反应中出现非特异性消化，分离所得CD4+ T细胞的活力应保持在90%以上1。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Atsede Siba 提供的技术支持。C.S.C. 获美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1R61DA047032 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBS，无菌Gibco10010023可使用其他同类产品。
5810/5810 R 制冷摆桶式离心机，配备 50 mL、15 mL 和 1.5 mL 离心管桶Eppendorf22625501可使用其他同类产品。
96 孔圆底板Thermo Scientific163320可使用其他同类产品。
Agilent 4200 TapeStation 系统AgilentG2991AA建议用于质量评估。
冻存管Thermo Scientific374081可使用其他同类产品。
DMSOSigmaD8418可使用其他同类产品。
Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28Invitrogen Life Technologies11131D关键组分
Dynabeads 未接触人 CD4 T 细胞分离试剂盒Invitrogen Life Technologies11346D关键组分
Dynamagnet 磁力架Invitrogen Life Technologies12321D关键组分
FCSGemini Bio Products100-500可使用其他同类产品。
高灵敏度 DNA 检测试剂盒Agilent50674626建议用于质量评估。
氯化镁六水合物，分子生物学级SigmaM2393可使用其他同类产品。
MinElute PCR 纯化试剂盒（PB 缓冲液、PE 缓冲液、洗脱缓冲液）Qiagen28004关键组分
Mr. Frosty 冻存盒Thermo Scientific5100-0001可使用其他同类产品。
氯化钠，分子生物学级SigmaS3014可使用其他同类产品。
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液New England BioLabsM0541关键组分
Nextera DNA 文库制备试剂盒（2x TD 缓冲液、Tn5 酶）IlluminaFC1211030关键组分
无核酸酶无菌 dH2OGibco10977015可使用其他同类产品。
聚山梨酯 20（Tween20）SigmaP9416可使用其他同类产品。
PowerUp SYBR Green 预混液Applied BiosystemsA25780关键组分
精密水浴锅Thermo ScientificTSGP02可使用其他同类产品。
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104关键组分
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Invitrogen Life TechnologiesQ32851建议用于质量评估。
Qubit 荧光计Invitrogen Life TechnologiesQ33226建议用于质量评估。
RosetteSep 人 CD4+ 密度分离介质Stem Cell Technologies15705关键组分
RosetteSep 人 CD4+ 富集混合液Stem Cell Technologies15022关键组分
RPMI-1640 培养基Gibco11875093可使用其他同类产品。
无菌储液槽Thermo Scientific8096-11可使用其他同类产品。
带加热盖的 T100 梯度 PCR 仪BioRad1861096可使用其他同类产品。
Tris-HClSigmaT5941可使用其他同类产品。

参考文献

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