线粒体DNA污染低的原代人CD4+ T淋巴细胞ATAC-seq检测

摘要

本文介绍了一种在活化的人类CD4+淋巴细胞上进行转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）的实验方案。通过引入一种新的裂解缓冲液，该方案经过优化，可将线粒体DNA读段的污染从50%降至3%。

摘要

由于ATAC-seq技术具有快速且简便地绘制全基因组可及染色质图谱的优势，现已成为表观遗传学研究中广泛应用的方法。本文介绍了一种改进的ATAC-seq实验流程，可显著降低线粒体DNA读段的污染。以往的ATAC-seq实验流程通常存在约50%的线粒体DNA污染读段，而本流程中引入的优化 裂解缓冲液可将线粒体DNA污染降低至平均3%。该改进的ATAC-seq流程几乎可使测序成本降低50%。我们展示了如何从活化的CD4+淋巴细胞制备高质量的ATAC-seq文库，并提供了从全血中分离CD4+淋巴细胞到数据分析的详细操作步骤。该优化的ATAC-seq流程已在多种细胞类型中得到验证，将为研究染色质可及性的科研人员提供即用且可靠的技术支持。

引言

转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）分析已迅速成为研究染色质结构的主流方法。ATAC-seq 通过标签化剪切（tagmentation）过程来识别可及性染色质区域，该过程由同一种酶完成DNA的片段化和标签添加，从而构建测序文库，用于全基因组范围内染色质可及性的测定。这一标签化剪切过程由高活性Tn5转座酶介导，由于核小体的空间位阻效应，Tn5转座酶仅切割染色质的开放区域。在切割的同时，Tn5转座酶还会插入测序接头，从而通过PCR快速构建文库，并进行全基因组可及性染色质的高通量测序^1,2。

由于ATAC-seq具有相对简单快速的实验流程、可从结果中获取高质量和广泛的信息，以及所需起始材料量少等优点，已成为确定染色质可及性区域的首选方法。与同样检测全基因组染色质可及性的DNase-seq³、用于确定开放基因组区域中核小体位置的MNase-seq⁴，以及甲醛介导的FAIRE-seq⁵相比，ATAC-seq更快捷、成本更低且可重复性更高¹。此外，ATAC-seq的灵敏度更高，仅需低至500个细胞核即可开展实验，而DNase-seq则需要多达5000万个细胞核

方案

本改进方案提供了从全血起始材料到数据分析的CD4+淋巴细胞ATAC-seq实验的逐步操作说明（图1）。

1. 从全血中分离CD4+ T细胞

注意：本实验方案的起始材料为采用标准方法采集的15 mL新鲜全血，起始材料的来源可根据研究需求进行选择。根据需要对实验步骤进行相应放大或缩小。在开始CD4+ T细胞富集操作前，将磷酸盐缓冲液（PBS）加2%胎牛血清（FCS）预热至室温（RT），并将离心机调节至室温。

1. 在50 mL锥形管中，向15 mL全血加入750 µL人CD4+ T细胞富集混合液，通过倒置轻轻混匀。室温孵育20分钟。孵育完成后，向管中加入15 mL PBS + 2% FCS，通过倒置轻轻混匀。
2. 在另一个新的50 mL锥形管中加入15 mL密度介质。小心地将稀释后的血液样本叠加在密度介质上方，注意不要破坏形成的密度介质与血液之间的界面。在室温下以1,200 × g离心20分钟，加速度设为1，降速刹车设为关闭。
   注意：必须将离心机的加速度设为1且降速刹车关闭，以避免破坏密度介质中的细胞层。
3. 使用细颈移液管从密度介质与血浆界面收集富集的CD4+ T细胞。将收集的细胞转移至一个新的50 mL锥形管中。在....

结果

从15 mL新鲜全血中，本方案可平均获得100万个CD4+ T细胞。这些细胞可冷冻保存以备后续处理，也可立即使用。无论新鲜或冻融后的CD4+ T细胞，其活力均保持稳定 >95%。该CD4+ T细胞分离方法在样本来源和采集时间上具有较高的灵活性。改进后的ATAC-seq实验流程所获得的最终文库产量超过1 ng/µL 用于测序。使用市售系统进行质量控制时，应显示DNA片段大小在200至1,000 bp之间（图2）。测序应仅使用高质量的文库进行。

所有文库的测序深度均达到平均每样本超过4000万条读段。尽管这一标准常被采用 ATAC-seq 实验方案常受到线粒体DNA污染的挑战，其测序读段可占总测序读段的50%–60%¹ 此改进后的方案消除了该问题。按照本方案制备的文库中，线粒体读段平均仅占3%（

讨论

本文介绍的改进型ATAC-seq方案可获得可重复的结果，并将线粒体DNA污染降至最低。该方案已成功用于表征人原代外周血单个核细胞（PBMCs）¹⁰、人单核细胞、小鼠树突状细胞（未发表）以及培养的黑色素瘤细胞系¹¹的染色质结构。我们预计这种优化的裂解条件也有望适用于其他细胞类型。同时预计，该细胞核分离方案可与单细胞核ATAC-seq方案兼容，通过减少线粒体DNA污染来提升测序结果质量。

该改良方案的另一个优势在于，可根据患者样本的可获得性，在不同时间点分批冻存从PBMCs中分离的CD4+ T细胞。由于随后可对所有样本同时进行ATAC-seq，从而最大限度地减少了转座酶反应和测序过程中潜在的批次效应偏差¹⁰。每次使用时必须新鲜配制冻存液，以维持该冻融方案所能达到的高细胞活力。为避免转座酶反应中出现非特异性消化，分离所得CD4+ T细胞的活力应保持在90%以上¹。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS，无菌	Gibco	10010023	可使用其他同类产品。
5810/5810 R 制冷摆桶式离心机，配备 50 mL、15 mL 和 1.5 mL 离心管桶	Eppendorf	22625501	可使用其他同类产品。
96 孔圆底板	Thermo Scientific	163320	可使用其他同类产品。
Agilent 4200 TapeStation 系统	Agilent	G2991AA	建议用于质量评估。
冻存管	Thermo Scientific	374081	可使用其他同类产品。
DMSO	Sigma	D8418	可使用其他同类产品。
Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	关键组分
Dynabeads 未接触人 CD4 T 细胞分离试剂盒	Invitrogen Life Technologies	11346D	关键组分
Dynamagnet 磁力架	Invitrogen Life Technologies	12321D	关键组分
FCS	Gemini Bio Products	100-500	可使用其他同类产品。
高灵敏度 DNA 检测试剂盒	Agilent	50674626	建议用于质量评估。
氯化镁六水合物，分子生物学级	Sigma	M2393	可使用其他同类产品。
MinElute PCR 纯化试剂盒（PB 缓冲液、PE 缓冲液、洗脱缓冲液）	Qiagen	28004	关键组分
Mr. Frosty 冻存盒	Thermo Scientific	5100-0001	可使用其他同类产品。
氯化钠，分子生物学级	Sigma	S3014	可使用其他同类产品。
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液	New England BioLabs	M0541	关键组分
Nextera DNA 文库制备试剂盒（2x TD 缓冲液、Tn5 酶）	Illumina	FC1211030	关键组分
无核酸酶无菌 dH2O	Gibco	10977015	可使用其他同类产品。
聚山梨酯 20（Tween20）	Sigma	P9416	可使用其他同类产品。
PowerUp SYBR Green 预混液	Applied Biosystems	A25780	关键组分
精密水浴锅	Thermo Scientific	TSGP02	可使用其他同类产品。
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	关键组分
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen Life Technologies	Q32851	建议用于质量评估。
Qubit 荧光计	Invitrogen Life Technologies	Q33226	建议用于质量评估。
RosetteSep 人 CD4+ 密度分离介质	Stem Cell Technologies	15705	关键组分
RosetteSep 人 CD4+ 富集混合液	Stem Cell Technologies	15022	关键组分
RPMI-1640 培养基	Gibco	11875093	可使用其他同类产品。
无菌储液槽	Thermo Scientific	8096-11	可使用其他同类产品。
带加热盖的 T100 梯度 PCR 仪	BioRad	1861096	可使用其他同类产品。
Tris-HCl	Sigma	T5941	可使用其他同类产品。