高盐处理抗原提呈树突状细胞的分离与过继性转移

摘要

本文介绍了一种通过磁性细胞分选法从小鼠脾脏中分离树突状细胞，并将其过继转移至未致敏小鼠的实验方案。选用高盐激活的树突状细胞模型，以详细说明过继转移及流式细胞术的各个操作步骤。

摘要

过量膳食盐摄入会引发炎症，并在高血压的发生发展中发挥关键作用。我们此前发现，抗原呈递树突状细胞（DCs）能够感知细胞外高钠环境，从而激活NADPH氧化酶并促进异左旋胶毒素（isolevuglandin, IsoLG）-蛋白质加合物的形成。这些IsoLG-蛋白质加合物可与自身蛋白质发生反应，诱导类似自身免疫的状态，进而促进高血压的发生。我们已开发并优化了前沿方法用于研究高血压中DC的功能。本文提供了一套详细的树突状细胞分离、体外培养及功能分析的实验方案。 体外高钠处理及小鼠脾脏CD11c adoptive转移⁺ 将细胞移植到受体小鼠体内，以研究其在高血压中的作用。

引言

过量膳食盐是高血压的主要危险因素。^1,2 美国心脏协会建议，钠（Na）的每日摄入量上限为2,300毫克（mg）⁺每日摄入量，然而；美国仅有不到10%的人口遵循这一建议。^3,4 适度降低 Na⁺ 摄入可降低血压，并使美国冠心病和中风的年度新增病例减少20%。⁵ 过量摄入盐的主要问题在于，50%的高血压人群表现为盐敏感性，即在摄入钠后血压升高10 mmHg⁺ 在Na后出现血压升高或类似的血压下降⁺ 限制与利尿⁶ 盐敏感性在25%的血压正常个体中也存在，并且是死亡和心血管事件的独立预测因子。^7,8 涉及肾脏的高血压盐感知机制已被广泛研究；然而，最近的研究表明，免疫细胞能够感知Na⁺.^9,10

最新证据表明，肾外钠处理的变化可能在高血压的发病机制中起重要作用。⁺ 操作可能导致 Na 的积聚⁺ 在间质中并促进炎症。^11,12 我们的实验室及其他研究团队已证实，先天性和适应性免疫系统的细胞均参与了高血压的加剧过程。^9,13,14,15 多种高血压刺激因素（包括血管紧张素II、去甲肾上腺素和盐）可导致巨噬细胞、单核细胞和T淋巴细胞浸润肾脏和血管系统，并促进钠⁺ 潴留、血管收缩、血压升高和终末器官损伤。^{9,16,17,18,19,20} 在之前的研究中，我们发现树突状细胞（DCs）在多种高血压刺激（包括血管紧张素II和脱氧皮质酮-盐诱导的高血压）作用下会积聚异构左旋前列腺素（IsoLG）-蛋白加合物。¹⁴ IsoLGs 是脂质过氧化的高度活性产物，可快速且共价地加成到蛋白质的赖氨酸残基上，其积累与树突状细胞（DC）的活化相关。¹⁴ 我们近期已证实，升高的 Na⁺ 是小鼠树突状细胞中IsoLG-蛋白质加合物形成的有效刺激物。⁹ Na⁺ 树突状细胞的摄取通过阿米洛利敏感型转运体介导。Na⁺ 随后与钙（Ca）进行交换²⁺)通过Na⁺/Ca²⁺ 交换剂。Ca²⁺ 激活蛋白激酶C（PKC），进而激活NADPH氧化酶，导致超氧化物（O₂⁻）水平升高₂^·-) 和异构绿原酸-蛋白质加合物的形成。⁹ 过继性转移经盐暴露的树突状细胞可使机体对亚升压剂量的血管紧张素II产生高血压反应。⁹

以往对组织中CD11c⁺树突状细胞（DCs）的鉴定仅限于免疫组织化学和RT-PCR，而DCs的分离则仅限于通过流式细胞术进行细胞分选。尽管流式细胞术分选是分离免疫细胞的一种强大方法，但其成本高、耗时长，且获得的活细胞数量较低。因此，我们优化了一步一步的实验方案，包括组织消化、体外刺激以及CD11c⁺ DCs的过继转移，以用于高血压的研究。

方案

范德堡大学机构动物护理和使用委员会已批准本文所述的操作程序。小鼠的饲养和护理均遵循《实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，2010年修订版）。

1. 小鼠脾脏的分离

1. 准备1640 RPMI培养基：含10% FBS、0.10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素。
2. 通过吸入CO₂处死10–12周龄的C57bl/6雄性小鼠。用70%乙醇喷洒小鼠胸部和体侧。在左侧小心切开皮肤和腹膜腔，暴露脾脏。
3. 使用小镊子谨慎将肠道和肝脏移向小鼠左侧，并用精细剪刀轻轻切除脾脏。
   注意：此步骤必须非常小心操作，因为胃肠道损伤可能引起污染。
4. 将每例切除的脾脏置于含有3 mL RPMI 1640培养基的已标记15 mL锥形管中。

2. 从脾脏制备单细胞悬液

注意：可通过结合机械解离和酶消化的方法将脾脏解离为单细胞悬液。

1. 通过将胶原酶 D（1 mg/mL；冻干粉 0.29 U/mg）和 DNase I（0.1 mg/mL）加入已配制的 RPMI 1640 培养基中，制备脾脏消化液（见步骤 1.1）。
2. 使用镊子将脾脏转移至含有 3 mL 脾脏消化液的 C 管（解离管）中。
3. 根据制造商说明书，使用半自动匀浆仪进行机械解离。
   1. 将 C 管放置在半自动匀浆仪上，确保 C 管牢固安装在旋转臂上。放置完毕后，按下匀浆仪上的启动按钮，运行 Spleen 04.01 程序，持续 60 秒。
      注意：也可通过将 40 μm 滤膜置于 50 mL 锥形管上方，轻轻研磨脾脏使其通过滤膜的方式进行机械解离。研磨完成后，用 10 mL RPMI 培养基冲洗 40 μm 滤膜。
4. 机械解离后，将管子从匀浆仪上取下，进行酶消化。将样品在 37 °C 下以持续旋转（20 rpm）条件孵育 15 分钟。
5. 经 40 μm 滤网过滤后，用移液器将溶液转移至 50 mL 锥形管中。用 10 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）冲洗 40 μm 滤网。在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
6. 离心后，彻底吸除上清液，并用 10 mL dPBS 重悬沉淀进行洗涤。在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。

3. 从脾脏单细胞悬液中分离CD11c⁺树突状细胞

1. 用5 mL dPBS重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板和台盼蓝排斥法计数细胞数量。
2. 在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
3. 完全吸除上清液，并将沉淀重悬于400 µL磁性激活细胞分选（MACs）缓冲液中。
4. 每1 × 10⁸个细胞加入100 µL CD11c微珠（见材料表）。
5. 涡旋混匀细胞悬液，在4 °C冰箱中孵育10分钟。
6. 加入10 mL MACs缓冲液洗涤细胞，在4 °C条件下以300 × g离心10分钟。
7. 完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于500 µL MACs缓冲液中。

4. CD11c⁺ 树突状细胞的磁分离

注意：磁分离可使用配备LS柱的手动磁分离器（参见材料表）进行。磁分离也可通过自动磁分离器自动完成（参见材料表）。

1. 将LS柱置于MACs分离器的磁场中，并在每根柱子下方放置一个15 mL锥形管以收集流穿液。
2. 用3 mL缓冲液冲洗LS柱。
3. 将细胞悬液加至每根LS柱上，并收集含有未标记细胞的流穿液。
4. 用3 mL MACs缓冲液洗涤LS柱，收集穿过的未标记细胞。再重复洗涤LS柱两次。
5. 从磁性分离器上取下LS柱。向每根柱中加入5 mL MACs缓冲液，并迅速用力推动柱芯，将磁性标记的细胞冲洗至洁净的15 mL锥形管中。
   注意：为获得高纯度的细胞悬液，必须对CD11c细胞进行两次分离。因此，请重复步骤3.1至4.5，并参考图4中的纯度标准。此步骤可将CD11c⁺细胞的纯度提高至90–95%。
6. 使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上测定CD11c⁺树突状细胞的数量。将细胞样品与0.4%台盼蓝溶液按1:1比例稀释。
   注意：死细胞会被染成蓝色，而活细胞则不着色。
   1. 为此，用10 µL细胞样品稀释液小心地填充血细胞计数板，室温孵育1分钟。
   2. 计数计数室中4个1 x 1 mm²区域的细胞，以确定活细胞数量。

5. CD11c⁺ 树突状细胞的体外高盐处理

1. 在500 mL 1640 RPMI培养基中加入10% FBS、0.1 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素，配制DC培养基。
2. 称取1.17 g NaCl，放入无菌50 mL Falcon离心管中，配制10倍浓缩的高盐DC细胞培养基（400 mM）。向该50 mL Falcon管中加入50 mL无菌DC细胞培养基（按步骤5.1制备），涡旋振荡至NaCl完全溶解。
3. 立即在细胞培养超净台中使用0.2 μm滤器通过真空过滤法对高盐DC培养基进行过滤除菌。
4. 将来自脾脏的各细胞悬液在4ºC条件下以300 × g离心10分钟。将每份细胞沉淀重悬于DC培养基中，调整细胞浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL。
5. 取900 μL DC细胞悬液（约含1 × 10⁶ 个细胞）加入24孔平底Falcon培养板中，每孔加入100 µL高盐DC培养基，使终浓度为190 mM钠离子。标记培养板，并置于37 °C、含加湿CO₂的培养箱中培养48小时。

6. 高盐处理CD11c⁺ DCs的过继性转移

1. 体外刺激 48 小时后，将培养板从 37 °C、含 CO₂ 的湿润培养箱中取出。
2. 用移液器将细胞培养基上下吹打，以重悬 CD11c⁺ 树突状细胞（DC）。将所有 CD11c⁺ DC 悬液转移至相应标记的 1.6 mL 离心管中。对每个培养孔重复此步骤。
3. 将每份 CD11c⁺ DC 悬液在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 10 分钟，吸除上清液。用 100 µL 无菌 dPBS 重悬 DC 沉淀。
4. 用配备 27 G ½ 英寸针头的 1 mL 注射器吸取 DC 悬液。
5. 将 10 周龄未经处理的雄性 C57bl/6 小鼠置于 2% 异氟烷中，以达到稳定的手术麻醉状态。通过脚趾反射消失判断麻醉深度。一旦达到稳定麻醉状态，以约 30° 角度缓慢而小心地将针头插入小鼠眶后腔。
   注意：27 G 针头的斜面应朝下，远离眼球，以避免损伤眼部组织。
6. 缓慢平稳地注射 CD11c⁺ DC 悬液（约 1 x 10⁶ 个细胞）。注射完成后，小心地将针头从眶后腔退出，注意避免损伤眼睛。
   注意：注射后应无或仅有极少出血。CD11c⁺ DC 的过继转移也可通过静脉注射方式（如尾静脉注射）进行。对照组小鼠接受在正常盐溶液培养基中培养的 CD11c⁺ DC。
7. 将小鼠从鼻罩中取出，并在麻醉恢复期间监测约 30 分钟。

7. 14天低剂量血管紧张素II（140 ng/kg/min）的制备

1. 通过加入500 μL的5 M NaCl和300 μL乙酸配制血管紧张素II缓冲液。用去离子H₂O定容至30 mL。
2. 用血管紧张素II缓冲液将血管紧张素II溶解为5 mg/mL的储备液。根据每只小鼠的体重，用额外的缓冲液稀释血管紧张素II储备液，使渗透压微型泵以140 ng/kg/min的速率递送血管紧张素II。
   注意：所需血管紧张素II（mg）=（小鼠体重（g）× 0.2 mg/天 × 14天）/1,000
   配制的血管紧张素II（mg）=（所需血管紧张素II × 260 µL）/ 泵速（0.25 μL/hr）
   血管紧张素II储备液体积（μL）= 配制的血管紧张素II / 储备液浓度（5 mg/mL）× 1,000
   稀释体积（μL）= 270 - 血管紧张素II储备液体积
3. 根据步骤7.2中计算的体积，将相应体积的血管紧张素II储备液加入稀释液（血管紧张素II缓冲液）中。
4. 在无菌细胞培养罩内打开渗透压微型泵。
5. 将稀释后的血管紧张素II溶液加入注射器，排出注射器和针头中的任何空气。将提供的针头插入渗透压微型泵底部，一边缓慢注入血管紧张素II溶液，一边缓慢而小心地将针头从囊腔中抽出。
6. 将渗透压微型泵头部完全插入渗透压囊腔，注意避免将空气带入囊腔中。

8. 植入14天低剂量血管紧张素II渗透压微型泵

1. 在过继转移CD11c⁺ DCs后的第10天，将小鼠放入异氟烷麻醉舱中开始麻醉，随后转移至鼻罩，持续给予2%异氟烷以达到并维持适当的手术麻醉状态。
2. 使用电动剃毛器去除颈部背侧的毛发以准备手术区域。手术开始前，先用70%乙醇清洁剃毛区域，再用7.5%聚维酮碘（betadine）进行消毒。
3. 在皮肤上做一个小切口（约1.5 cm）。将止血钳插入切口，以创建一个皮下囊腔，用于放置渗透压微型泵（osmotic minipump）。
4. 将微型泵插入皮下囊腔中。使用2–3枚外科缝合钉关闭皮肤切口，并在伤口及缝合钉处再次涂抹7.5%聚维酮碘，以预防感染。
5. 将小鼠从麻醉中恢复期间，需监测30–60分钟，之后再将其放回笼中。
   注意：在植入渗透压微型泵后，需持续监测小鼠3–4天。

9. 用于流式细胞术分析的受体小鼠脾脏的分离

1. 经14天低剂量血管紧张素II灌注后，通过过继转移分离接受体外高盐处理的树突状细胞的小鼠脾脏。遵循上述列出的精确步骤（步骤1和步骤2）。

10. 表面染色

1. 将重悬于1× PBS中的脾细胞转移至聚苯乙烯FACS管中，在4 °C条件下以350 × g离心8分钟。离心后吸除上清液。用1 mL MACS缓冲液洗涤两次，每次洗涤后均以350 × g离心8分钟，4 °C。
   1. 根据所需的流式细胞分析面板数量，将脾细胞均等地分装至不同的聚苯乙烯FACS管中。
2. 进行活/死细胞活力染色时，用1× PBS洗涤细胞，以350 × g离心8分钟，4 °C。将细胞重悬于1 mL 1× PBS中，加入1 µL细胞活力染料（见材料表）。用铝箔包裹避光，在4 °C（冰箱或冰上）孵育15分钟。
3. 在细胞活力染料孵育期间，用适量MACS缓冲液配制用于细胞表面染色的抗体混合液。
4. 用1 mL MACS缓冲液洗涤细胞，以350 × g离心8分钟，4 °C，然后将每份细胞沉淀重悬于100 µL抗体混合液中。避光孵育30分钟，4 °C。
   注意：每种流式细胞术抗体均具有特异性，强烈建议通过针对每种抗体进行剂量滴定实验，以确定所需的最佳抗体用量。
5. 用1 mL MACS缓冲液洗涤细胞两次，然后将脾细胞重悬于适量MACS缓冲液中，用于流式细胞分析。

结果

图1 展示了上述步骤的示意图。分离的小鼠脾脏通过磁性细胞分选法分选出CD11c⁺树突状细胞（DCs），并将其接种于正常盐浓度培养基（NS；150 mmol NaCl）或高盐培养基（HS；190 mmol NaCl）中，培养48小时。随后，通过眶后注射将CD11c⁺树突状细胞过继转移至未致敏的受体小鼠。十天后，小鼠植入渗透压微型泵，以低剂量血管紧张素II（140 ng/kg/min）持续输注14天。在血管紧张素II输注的14天期间，通过无线遥测或尾套体积描记法记录血压。

在过继性转移树突状细胞并植入用于低剂量血管紧张素II输注的渗透压微泵后，典型的血压分析结果如图2所示（修改自Barbaro等人的研究⁹）。值得注意的是，该低剂量的血管紧张素II（...

讨论

在本实验方案中，我们优化了从小鼠脾脏中分离CD11c⁺树突状细胞（DCs）并将其过继转移至未致敏动物的方法，以研究DCs在盐诱导性高血压中的作用。该方案可进行调整，用于分离和过继转移其他免疫细胞亚群，包括巨噬细胞、单核细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞等适应性免疫细胞。我们优化了脾脏组织消化过程，以确保细胞存活率以及DC表面标志物表达的稳定性。此外，我们还优化了体外高钠刺激小鼠DC的实验条件，以获得最佳的DC存活状态。

本方案中的一个关键步骤是磁珠分选细胞。磁珠分选是一种强大且便捷的工具，可用于分离特定的小鼠细胞类型，以研究免疫细胞在疾病中的功能。然而，该方法依赖于一些基本的细胞表面标志物（如CD11c），而这些标志物通常在多种免疫细胞类型中均有表达，因此常常导致目标细胞的富集程度不够理想。因此，对于需要高度特异性细胞群体的应用，可能需要使用多种抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分选，以去除污染细胞。此外，使用流式细胞术确认所分离细胞的富集程度和纯度也非常重要，如图3和

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC/Cy7 抗小鼠 CD11c	Biolegend	117324
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c 微珠超纯试剂	Miltenyi Biotec	130-108-338
胶原酶 D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
不含钙和镁的 DPBS	Corning	21-031-CV
FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC 抗小鼠 CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235	使用方案：Spleen 04.01
LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34964
LS 分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 培养基	Gibco	11835-030