高盐处理抗原提呈树突状细胞的分离与过继性转移

摘要

本文介绍了一种通过磁性细胞分选法从小鼠脾脏中分离树突状细胞，并将其过继转移至未致敏小鼠的实验方案。选用高盐激活的树突状细胞模型，以详细说明过继转移及流式细胞术的各个操作步骤。

摘要

过量膳食盐摄入会引发炎症，并在高血压的发生发展中发挥关键作用。我们此前发现，抗原呈递树突状细胞（DCs）能够感知细胞外高钠环境，从而激活NADPH氧化酶并促进异左旋胶毒素（isolevuglandin, IsoLG）-蛋白质加合物的形成。这些IsoLG-蛋白质加合物可与自身蛋白质发生反应，诱导类似自身免疫的状态，进而促进高血压的发生。我们已开发并优化了前沿方法用于研究高血压中DC的功能。本文提供了一套详细的树突状细胞分离、体外培养及功能分析的实验方案。 体外高钠处理及小鼠脾脏CD11c adoptive转移⁺ 将细胞移植到受体小鼠体内，以研究其在高血压中的作用。

引言

过量膳食盐是高血压的主要危险因素。^1,2 美国心脏协会建议，钠（Na）的每日摄入量上限为2,300毫克（mg）⁺每日摄入量，然而；美国仅有不到10%的人口遵循这一建议。^3,4 适度降低 Na⁺ 摄入可降低血压，并使美国冠心病和中风的年度新增病例减少20%。⁵ 过量摄入盐的主要问题在于，50%的高血压人群表现为盐敏感性，即在摄入钠后血压升高10 mmHg⁺ 在Na后出现血压升高或类似的血压下降⁺ 限制与利尿⁶ 盐敏感性在25%的血压正常个体中也存在，并且是死亡和心血管事件的独立预测因子。^7,8 涉及肾脏的高血压盐感知机制已被广泛研究；然而，最近的研究表明，免疫细胞能够感知Na⁺.^9,10

最新证据表明，肾外钠处理....

方案

范德堡大学机构动物护理和使用委员会已批准本文所述的操作程序。小鼠的饲养和护理均遵循《实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，2010年修订版）。

1. 小鼠脾脏的分离

1. 准备1640 RPMI培养基：含10% FBS、0.10 mM HEPES、1 mM丙酮酸钠、50 µM β-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素。
2. 通过吸入CO₂处死10–12周龄的C57bl/6雄性小鼠。用70%乙醇喷洒小鼠胸部和体侧。在左侧小心切开皮肤和腹膜腔，暴露脾脏。
3. 使用小镊子谨慎将肠道和肝脏移向小鼠左侧，并用精细剪刀轻轻切除脾脏。
   注意：此步骤必须非常小心操作，因为胃肠道损伤可能引起污染。
4. 将每例切除的脾脏置于含有3 mL RPMI 1640培养基的已标记15 mL锥形管中。

2. 从脾脏制备单细胞悬液

注意：可通过结合机械解离和酶消化的方法将脾脏解离为单细胞悬液。

1. 通过将胶原酶 D（1 mg/mL；冻干粉 0.29 U/mg）和 DNase I（0.1 mg/mL）加入已配制的 RPMI 1640 培养基中，制备脾脏消化液（见步骤 1.1）。
2. 使用....

结果

图1 为上述步骤的示意图。分离的小鼠脾脏通过磁性细胞分选法分选出 CD11c⁺ 树突状细胞（DCs），并将其接种于正常盐浓度培养基（NS；150 mmol NaCl）或高盐培养基（HS；190 mmol NaCl）中，培养 48 小时。随后，通过眶后注射将 CD11c⁺ DCs 过继转移至未经处理的受体小鼠体内。十天后，小鼠植入渗透压微型泵，以低剂量血管紧张素 II（140 ng/kg/min）持续输注 14 天。在血管紧张素 II 输注的 14 天期间，通过遥测法或尾套体积描记法记录小鼠血压。

在过继性转移树突状细胞并植入用于低剂量血管紧张素II输注的渗透压微泵后，典型的血压分析结果如图2所示（修改自Barbaro等人的研究⁹）。值得注意的是.......

讨论

在本实验方案中，我们优化了从小鼠脾脏中分离CD11c⁺树突状细胞（DCs）并将其过继转移至未致敏动物的方法，以研究DCs在盐诱导性高血压中的作用。该方案可进行调整，用于分离和过继转移其他免疫细胞亚群，包括巨噬细胞、单核细胞以及T淋巴细胞和B淋巴细胞等适应性免疫细胞。我们优化了脾脏组织消化过程，以确保细胞存活率以及DC表面标志物表达的稳定性。此外，我们还优化了体外高钠刺激小鼠DC的实验条件，以获得最佳的DC存活状态。

本方案中的一个关键步骤是磁珠分选细胞。磁珠分选是一种强大且便捷的工具，可用于分离特定的小鼠细胞类型，以研究免疫细胞在疾病中的功能。然而，该方法依赖于一些基本的细胞表面标志物（如CD11c），而这些标志物通常在多种免疫细胞类型中均有表达，因此常常导致目标细胞的富集程度不够理想。因此，对于需要高度特异性细胞群体的应用，可能需要使用多种抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分选，以去除污染细胞。此外，使用流式细胞术确认所分离细胞的富集程度和纯度也非常重要，如图3和

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC/Cy7 抗小鼠 CD11c	Biolegend	117324
autoMACS 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c 微珠超纯试剂	Miltenyi Biotec	130-108-338
胶原酶 D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
不含钙和镁的 DPBS	Corning	21-031-CV
FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC 抗小鼠 CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235	使用方案：Spleen 04.01
LIVE/DEAD 可固定紫红色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34964
LS 分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 培养基	Gibco	11835-030