高盐抗原表达树突状细胞的分离和采用转移

过量的食盐是高血压的主要危险因素。^1,2然而, 美国心脏协会建议每天最多摄入 2, 300 毫克钠 (na⁺);不到10% 的美国人遵守了这一建议。^{3 个,4}适度降低 na⁺摄入量可降低血压, 并使美国每年新增的冠心病和中风病例减少20%。⁵过量食盐消费的一个主要问题是, 50% 的高血压人群表现出盐敏感性, 即 na⁺负荷后血压增加10毫米汞柱或 na + 后血压类似下降限制和利尿。⁶盐敏感性也发生在25% 的正常个体, 是死亡和心血管事件的独立预测指标。^7.,8.对涉及肾脏的高血压的盐传感机制进行了很好的研究;然而, 最近的研究表明, 免疫细胞可以感觉到 na⁺。^9,10

最近的证据表明, 肾外钠⁺处理的变化可导致间质^{中 na +}的积累, 并促进炎症。^11,12我们的实验室和其他实验室已经表明, 先天和适应性免疫系统的细胞都是导致高血压加重的原因之一。^9,13,14,15各种高血压刺激, 包括血管紧张素 ii.、去甲肾上腺素和盐, 会引起巨噬细胞、单核细胞和 t 淋巴细胞浸润肾脏和血管, 促进 na⁺保留、血管收缩、血压高度和终末期器官损伤。^{9,16,17,18,19,20}在先前的研究中, 我们发现 dc 积累了异丙基蛋白 (isolg)-蛋白质加合物, 以应对各种高血压刺激, 包括血管紧张素 ii. 和 doca-salt 高血压。^14等长为脂质过氧化的高反应产物, 可迅速和共价地与赖氨酸结合在蛋白质上, 它们的积累与 dc 活化有关。¹⁴我们最近已经确定, 升高的 na⁺是对小鼠 dc 中等升蛋白的有效刺激. 9^{na +}进入 dc 是通过氨基氯酰胺敏感转运体介导的.然后通过 na⁺/ca^{2 +}交换器将 na⁺交换为钙 (ca^{2 +})。ca^{2 +}激活蛋白激酶 c (pkc), 激活 nadph 氧化酶, 导致超氧化物 (o2·-) 和异丙基蛋白合管的形成。⁹含盐 dc 的收养转移是对血管紧张素 ii. 的反应的高血压的主要表现。⁹

以前, 从组织中识别 cd11c + dc^仅限于免疫组织化学和 rt-pcr, 而 dc 的分离仅限于流式细胞仪的细胞分选。虽然流式细胞仪细胞分选是分离免疫细胞的有力方法, 但它成本高昂、耗时, 并导致活细胞产量低。因此, 我们对组织消化、体外刺激和采用 cd11c + dc^转移的组织消化、体外刺激和采用转移来研究高血压进行了一步一步的优化。

范德比尔特大学的机构动物护理和使用委员会已经批准了本文所述的程序。老鼠是根据《实验动物护理和使用指南》 (国家科学院出版社) 安置和照顾的。2010年修订)。

1. 从小鼠身上分离脾脏

1. 制备 1640 rpmi:10% fbs、0.10 mm hepes、1 mm 丙酮酸钠、50μm β-硫醇和1% 青霉素。
2. 用二氧化碳吸入10–12周龄的 c57bl·6只雄性小鼠 。用70% 的乙醇喷洒小鼠的胸部和两侧。在左侧, 小心地打开皮肤和腹腔, 露出脾脏。
3. 使用小钳子, 谨慎地将肠道和肝脏移动到老鼠的左侧, 并使用精细的剪刀轻轻切除脾脏。
   请注意:这一步必须非常小心地进行, 因为对胃肠道的损害会诱发污染。
4. 将每个切除的脾脏放置在标记为 15 ml 锥形管, 其中含有3毫升 rpmi 1640 培养基。

2. 脾脏单细胞悬浮液的产生

请注意:脾脏可以通过机械离解加酶消化相结合, 分解成单个细胞悬浮液。

1. 通过添加胶原酶 d (1 mg/ml; 0.29 usg 冻干) 和 dnase i (0.1 mg/ml) 制备 rpmi 1640 培养基来制备脾脏消化液 (见步骤 1.1)
2. 使用钳子将脾脏转移到含有3毫升脾脏消化液的 c 管 (解离管) 中。
3. 根据制造商的说明, 使用半自动均质机进行机械分离。
   1. 将 c 管放置在半自动均质机上, 确保 c 管紧密放置在旋转臂上。放置 c 管后, 按半自动均质机上的启动按钮, 运行脾脏04.01协议60秒。
      请注意:机械离解也可以通过在50毫升锥形管的顶部放置40μm 的过滤器, 并通过过滤器轻轻研磨脾脏来实现。研磨脾脏后, 通过冲洗40μm 滤镜与10毫升的 rpmi 介质。
4. 机械解离后, 将管材与均质机分离, 进行酶消化。在连续旋转 (20 转/分) 下, 在37°c 下将样品培养15分钟。
5. 通过40μm 过滤器过滤后, 通过移液将溶液转移到50毫升锥形管中。用10毫升的 dulbecco pbs (dpbs) 清洗40μm 过滤器。在4°c 条件下, 以 300 x g离心细胞10分钟。
6. 离心后, 将上清液完全吸气, 并在10毫升的 dpbs 中重新悬浮清洗颗粒。在4°c 下, 以 300 x g 离心10分钟。

3. 从脾脏单细胞悬浮液中分离 cd11c⁺ dc

1. 在 dpbs 的5毫升中重新移植细胞颗粒, 并使用血细胞计和色氨酸蓝排除计数细胞数量。
2. 在 300 x g 的温度下离心细胞, 在4°c 下进行10分钟的离心。
3. 将上清液完全吸气, 并在400μl 的磁性活化细胞分选 (mac) 缓冲液中重新悬浮颗粒。
4. 每 1 x 10 8个细胞添加100μl 的 cd11c 微珠 (见材料表).
5. 在4°c 条件下, 在冰箱中旋转细胞悬浮液并孵育10分钟。
6. 加入10毫升的 mac 缓冲液来清洗细胞。在4°c 下, 以 300 x g 离心10分钟。
7. 完全吸动上清液, 并在500μl 的 mac 缓冲液中重新悬浮。

4. cd11c + dc^的磁选

请注意:磁分离是手动完成的磁选机 (见材料表) 配备 ls 柱。还可以使用自动磁选机自动进行磁选。(请参见材料表)。

1. 将 ls 柱放置在 mac 分离器的磁场中, 并在每根柱下放置一个 15 ml 锥形管, 以收集流动。
2. 用3毫升的缓冲液冲洗 ls 列。
3. 将细胞悬浮液放在每个 ls 列上, 并收集包含未标记单元格的流经。
4. 用3毫升的 mac 缓冲区清洗 ls 柱, 收集通过的未标记单元格。再清洗两次 ls 列。
5. 从磁选机上取下 ls 柱。在每根柱中加入5毫升的 mac 缓冲液, 并通过将 ls 柱牢固地投入到干净的 15 ml 锥形管中, 立即将磁标记的细胞冲洗干净。
   请注意:重要的是要进行 cd11c 细胞的双重分离, 以获得高纯度的细胞悬浮液。因此, 重复步骤3.1 到4.5。和参考图 4的纯度标准。此步骤可将 cd11c⁺细胞的纯度提高到90–95%。
6. 使用色氨酸蓝色排除确定血细胞计上的 cd11c + dc 号。在0.4% 的色氨酸蓝色溶液中稀释细胞样品, 稀释为1:1。
   注:不可行的细胞将被染成蓝色, 而有活力的细胞将保持不被染色。
   1. 要做到这一点, 仔细填充血细胞仪10μl 的细胞样本稀释和孵育1分钟。
   2. 在已加载的腔内 4个 1 x 1毫米2的方块中计数细胞, 以确定活细胞数。

5. cd11c⁺ dc 的体外高盐处理

1. 加入10% 的 fbs、0.1 mm hepes、1 mm 丙酮酸钠、50μm β-硫醇和1% 的青霉素/链霉素到500毫升 1640 rpmi, 制备直流培养基。
2. 通过称量1.17 克的氯化钠并将其放入无菌50毫升猎鹰管, 制备 10倍 dc 高盐细胞培养基 (400 mm)。在50毫升猎鹰管和涡旋中加入50毫升无菌 dc 细胞培养基 (在步骤5.1 中制备), 直到氯化钠溶液中。
3. 立即过滤高盐直流培养基, 通过在细胞培养罩中的0.2μm 过滤器真空过滤。
4. 在4°c 条件下, 以 300 x g的速度将脾脏中的每个细胞悬浮液离心10分钟。在浓度为 1 x 10 6 细胞的情况下, 在直流培养基中对每个细胞颗粒进行再利用。
5. 在24井平底猎鹰板中的直流悬浮液 900μl (约 1 x¹⁰ 6 个电池)。在每口井中加入100μl 高盐直流培养基, 最终钠浓度为 190 mm。将板材贴上标签, 并将其放置在 37°c的腐殖质 co2 孵化器中48小时。

6. 采用高盐转移处理 cd11c⁺ dc

1. 体外刺激48小时后, 将板从37°c 腐殖质 co2 孵化器中取出 。
2. 移液器细胞培养介质上下向上和向下重新悬挂 cd11c⁺ dc. 移液器将所有 cd11c⁺ dc 悬浮液放入相应的标记 1.6 ml 管中。对每个镀金的个体重复此步骤。
3. 在4°c 条件下, 以 300 x^{g 离心}每个 cd11c + dc悬浮液10分钟。吸收上清液。用100μl 的无菌 dpbs 重新使用直流颗粒。
4. 将直流悬架放入装有 27 g 半英寸针的1毫升注射器中。
5. 将10周大的男性 C57bl/6 小鼠置于2% 异氟醚以下, 以实现稳定的手术平面。检查麻醉水平与缺乏踏板反射。一旦实现了稳定的手术平面, 缓慢而仔细地将针头以大约30°的角度引入后眼眶空间。
   请注意:27 g 针的斜面应该指向向下, 远离眼睛, 以防止眼睛损伤。
6. 缓慢而平稳地注入 cd11c⁺ dc 悬浮液 (约 1 x^{10 6 细胞})。注射完成后, 小心取出针头, 使后眼眶空间意识到不会损害眼睛。
   请注意:注射后, 应该有很少或没有出血。采用 cd11c + dc^的采用转移也可以使用 i. v. 注射法 (例如尾静脉)。对照小鼠接受在正常盐培养基中培养的 cd11c + dc^.
7. 从鼻锥中取出小鼠, 并在麻醉恢复过程中对它们进行大约30分钟的监测。

7. 制备14天低剂量血管紧张素 ii (140 ng\ kggmin)

1. 加入500μl 的5m 氯化钠和300μl 的醋酸, 制备血管紧张素 ii. 缓冲液。量子 satis (qs) 高达30毫升的去电离 h₂0。
2. 用血管紧张素 ii. 的缓冲液溶解血管紧张素 ii. ~ 5 mgml 的库存溶液。稀释血管紧张素 ii. 库存溶液与额外的缓冲液, 以达到最终的浓度, 使渗透小泵将提供血管紧张素 ii 的速度为 140 ng\ kg\ min 根据每个小鼠的体重。
   请注意:必需血管紧张素 ii. (毫克) = (小鼠体重 (g) x 0.2 mg day x 14 days)/1,000
   准备血管紧张素 ii (mg) = (必需血管紧张素 ii x 266μl)/泵率 (0.25 μlhr)
   血管紧张素 ii 库存量 (μl) = 制备的血管紧张素 ii/库存浓度 (5 mg/ml) x 1, 000
   稀释体积 (μl) = 270-血管紧张素 ii 库存体积
3. 根据步骤7.2 中计算的交易量, 将血管紧张素 ii. 库存量加入稀释 (血管紧张素 ii. 缓冲液)。
4. 在无菌细胞培养罩下, 开放渗透小管。
5. 加入稀释的血管紧张素 ii 溶液, 并从注射器和针头排出任何空气。将提供的针头插入渗透小管池的底部, 慢慢注射血管紧张素 ii. 溶液, 同时缓慢而仔细地将针头从膀胱中收回。
6. 将渗透小管头完全插入渗透膀胱, 注意不要将任何空气进入膀胱。

8. 14天低剂量血管紧张素 ii 型渗透小管

1. 在采用 cd11c + dc^转移后十天内, 将小鼠放置在异氟烷腔中启动麻醉, 然后将小鼠转移到鼻锥, 不断获得2% 的异氟烷, 以实现和维持适当的手术平面。
2. 用剪子取下颈部背侧的毛皮, 准备手术部位。在手术开始前, 用70% 的乙醇清洁剃须区域, 然后用7.5% 的 betadine 清洗。
3. 在皮肤上创建一个小切口 (约1.5 厘米)。将止血器插入切口, 创建一个皮下口袋, 用于放置渗透小管。
4. 将小管插入皮下口袋。用2-3 个手术钉缝合皮肤伤口, 并对伤口和订书针应用7.5% 的 betadine, 以防止感染。
5. 在麻醉恢复过程中对小鼠进行30-60分钟的监测, 然后将它们送回笼子。
   请注意:小鼠植入渗透小管植入后最多需要监测3-4天。

9. 供血小鼠脾脏的分离进行流式细胞仪分析

1. 经过14天的低剂量血管紧张素 ii. 输注后, 采用收养转移法分离接受体外高盐处理的 dc 的小鼠的脾脏。按照上面列出的精确步骤操作 (步骤1和 2)。

10. 表面染色

1. 将在 1x pbs 中重新悬浮的脾细胞转移到聚苯乙烯流式细胞仪管和离心机中, 在 4°c 下以 350 x g 的速度, 在8分钟内。离心后吸入上清液。用1毫升的 mac 缓冲和离心 (350 x g,8分钟, 4°c) 清洗两次。
   1. 根据所需的流式细胞仪板的数量, 将脾细胞平均分为不同的聚苯乙烯流式细胞仪管。
2. 要进行活体死亡细胞的粘度染色, 用 1x pbs 和离心机 (350 x g, 8分钟, 4°c) 清洗细胞。在 1x pbs 的1毫升中重新注射, 并添加1μl 的细胞活力染色 (见材料表)。在 4°c (冰箱或冰上) 用铝箔覆盖 15分钟, 以防止光线照射。
3. 在细胞活力染色的培养过程中, 在适当的 macs 缓冲量中制备细胞表面染色的抗体混合物。
4. 用1毫升的 acs 缓冲器离心机 (350 x g, 8分钟, 4°c) 清洗细胞, 并用100μl 的抗体鸡尾酒重新悬浮每个细胞颗粒。在4°c 下, 防止光线照射30分钟。
   请注意:每个流式细胞仪抗体都是独一无二的, 它是非常有用的, 建议通过对每个特定抗体执行剂量滴定曲线来确定所需的最佳抗体量。
5. 用1毫升的 acs 缓冲液清洗细胞两次, 并在适当数量的 acs 缓冲液中重新悬浮脾细胞, 进行流式细胞仪分析。

图 1表示上述步骤的示意图。分离的小鼠脾脏通过磁性细胞分选进行分类,并在正常盐介质 (ns; 150 mmol ncl) 或高盐培养基 (hs; 190 mmol ncl) 中进行偏重基化细胞 + dc 的分类, 时间为 48小时. 然后通过反轨道通过 cd11c+ dc 进行收养转移注射到天真的受卵小鼠。十天后, 小鼠被植入渗透小细胞, 用于低剂量血管紧张素 ii (140 ng/kg/min) 输注14天。在14天的血管紧张素 ii. 输注过程中, 血压通过无线电遥测或尾袖胸腔造影记录。

典型的血压分析表现在图 2 (修改为 barbaro 等人. 9)后, 采用转移的 dc 和渗透小泵的低剂量血管紧张素 ii. 输液植入。值得注意的是, 这种低剂量的血管紧张素 ii. (140 ng/kg/min) 是一种亚压剂量, 不会增加正常小鼠的血压。接受正常盐治疗的小鼠 cd11c+ dc (黑眼圈) 在血管紧张素 ii ii 输液期间保持正常血压, 而接受高盐治疗的小鼠 cd11c+ dc (红眼圈) 表现出收缩压的增加。图 2显示高盐治疗 cd11c+ dc 原发性高血压是对血管紧张素 ii. 的亚压剂量的反应。

为了确定分离的 cd11c+细胞的纯度, 我们使用门控策略进行流式细胞仪分析, 如图 3a 所示。我们发现, 与总脾细胞相比, 我们实现了 cd11c+细胞的增加富集 (图 3b)。我们使用不同的 cd11c 微珠浓度对图4中制造商的协议进行故障排除。使用 100μl (图 4a)、200μl (图 4 b) 或 300μl (图 4c) 对脾细胞进行磁分离后, cd11c微珠的产量约为65%、55% 和 50% cd11c + 正细胞。然后, 我们加入了 fcr 阻滞剂 (5μl？脾脏) + 100μl 的 cd11c 微珠, 磁分离, 并发现封锁 fcr 产生约 65% cd11c 阳性细胞 (图 4d)。在其他实验中, 我们在 100μl cd11c 微珠中培养脾脏细胞, 并通过 ls 柱进行磁分离。然后, 我们用另外100μl 的 cd11c 微珠孵育分离的细胞, 并通过 ls 柱再次分离。脾细胞的双重分离产生了92% 的 cd11c+细胞 (图 4e)。

图 1: 体外治疗 cd11c 的采用转移的说明+区议会.cd11c + dc从小鼠脾脏中分离出来, 在正常盐或高盐培养基中镀金 24小时, 然后将 cd11c + dc后带转移到天真的受体小鼠体内。植入低剂量血管紧张素 ii. 的渗透小泵头, 并对血压进行14天的监测。这一数字改编自 barbaro 等人。9.请点击此处查看此图的较大版本.

图 2: 高盐处理 cd11c 的效果+dc 对收缩压的影响.树突状细胞在正常盐 (ns) 或高盐 (hs) 中分离培养 48小时, dc 被采用转移到野生型天真小鼠体内。植入 ang ii 微型泵 (140 ng/min), 并通过无线电遥测监测血压。用无线电遥测 (平均±sem) 测量的收缩压 (sbp)。这个数字改编自 barbaro 等人. 9请点击这里查看这个数字的更大版本.

图 3: 磁分离的脾细胞的流动细胞学分析.(a) 分叉策略定义 cd11c+ dc 种群的分析。细胞与碎片分离, 在排除活体死亡细胞染色的基础上选择活细胞。选择单元单元, 然后对 cd45 的阳性进行分析。然后对 cd45 细胞进行 cd11c. (b) 磁选后, cd11c+ 细胞有显著的富集。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 在不同的分离方案下, 对磁性分离的 cd11c+脾细胞进行流动细胞学分析.细胞与碎片和活细胞分离。对活细胞进行了 i-ab 和 cd11c 阳性反应分析。(a) 用100μl、(b) 200μl、(c) 300μl 的 cd11c 微珠分离的磁选后 cd11c+细胞的%。(d) 磁分离后分离的 cd11c+细胞的% 与 fcr (抗 fcr; 5μl) + 100μl cd11c 微珠隔离。(e) 磁分离后的 cd11c + 细胞的%,用双磁性细胞分选分离。请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。