本文介绍了一种细胞培养腔室的构建方案，该腔室可对细胞施加多种类型的电刺激，并可用于处理间充质干细胞以增强其成骨分化能力。
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本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞/基质细胞（MSCs）已广泛应用于组织工程中以促进骨愈合。电刺激（EStim）已被证明可在体外增强MSC的成骨分化，并在临床环境中促进骨愈合。本文描述了一种电刺激细胞培养装置的构建方法，并介绍其用于处理大鼠骨髓来源的MSC以增强其成骨分化的应用。我们发现，对MSC进行7天的电刺激可显著提高其成骨分化水平，更重要的是，这种促成骨效应在电刺激停止后仍可持续较长时间（7天）。这种通过电刺激预处理MSC以增强其成骨分化的方法可用于优化骨组织工程治疗的效果，从而帮助其实现充分的治疗潜力。除本应用外，该电刺激细胞培养装置及实验方案还可用于研究其他对电刺激敏感的细胞行为，如迁移、增殖、凋亡以及支架附着等。
引言
由于创伤和/或疾病导致的骨缺损日益增多，目前正采用细胞治疗与再生医学技术的不同组合进行治疗。间充质干细胞（MSCs）是此类治疗的首选细胞，因其具有相对较高的成骨活性、易于分离与扩增，且安全性良好1。为了最大限度地提高其成骨活性，从而优化治疗效果，已有多种方法被用于在治疗前对MSCs进行调控（Mauney等人的综述中有详细阐述2）。其中一种方法是电刺激（EStim），已被证明可在体外增强MSC的成骨分化3，并在体内促进骨愈合4。尽管越来越多的研究聚焦于使用EStim处理MSCs，但尚未确立能够最大化EStim促成骨效应的最佳干预方案。
其他使用电刺激（EStim）的体外方法采用浸没在培养基中的盐桥，使细胞与金属电极分离5。这种方法的优点在于，通过盐桥传递电刺激可避免引入可能具有细胞毒性的化学副产物（例如，金属电极的腐蚀产物）。尽管具有这一优势，盐桥操作繁琐，且其传递的电刺激与体内模型中的电刺激存在差异，导致在使用这两种系统时获得的结果难以相互关联。通过固定在细胞培养孔内的金属或碳电极传递电刺激的装置（如Hronik-Tupaj和Kaplan所综述6）能更好地模拟体内使用的设备；然而，这些装置在重复使用之间难以清洁和灭菌，且每次实验可研究的细胞数量有限。我们设计了本文所介绍的EStim装置，旨在专门解决上述其他装置的局限性。尽管我们使用该EStim装置的大部分经验集中于含有骨髓和脂肪组织来源的间充质干细胞（MSCs）的二维（2D）和三维（3D）培养3,4，但该装置的一个主要优势在于其具有良好的通用性，仅需进行少量调整，即可适应多种不同条件下其他细胞类型的研究。
本文介绍了电刺激（EStim）细胞培养装置的构建方法，随后通过采用不同电刺激方案处理间充质干细胞（MSCs），并检测其对成骨分化的效应，以演示该装置的使用。MSC的成骨分化通过钙沉积、碱性磷酸酶活性以及成骨标志基因表达进行评估。重要的是，在此前使用该装置的实验中，我们观察到这些促成骨效应在电刺激停止后仍能长期持续。
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方案
1. 电刺激细胞培养室的构建
- 构建电刺激（EStim）装置时，准备两个标准6孔细胞培养板的盖子；99.99%纯度的铂丝，长度60 cm，直径0.5–1 mm；镀银铜丝，长度70 cm，直径0.6 mm；剪线钳；电烙铁套装；一管超导胶；一个电线端子块连接器；六个小型2.2 V发光二极管（LED，可选）；一管无腐蚀性硅胶绝缘涂层（可选）；一卷黑色电工绝缘胶带；标准柔性绝缘铜导线（0.14 mm2），长度2 m（材料表）。
- 在6孔板盖子上，于每个孔靠近外缘处标记并钻出两个直径约1 mm的孔，两孔间距25 mm（共6个孔，总计12个孔），如图1A,B所示。
- 使用剪线钳将铂丝剪成十二段，每段5 cm长。手动将每段铂丝弯成L形，一端保留3 cm，另一端保留2 cm。将镀银铜丝剪成两段，每段35 cm长。
- 将铂丝较长的一端（3 cm）从内向外插入每个钻好的孔中，使末端从盖子外侧突出1–2 mm，用镊子将其弯折固定。使用超导胶将铂丝固定在盖子的孔中，并静置干燥约6小时。
- 将从盖子突出的所有六根铂丝末端（后续作为阴极使用，见图1A）与其中一根镀银铜丝进行焊接。重复该步骤，将剩余六根铂丝（后续作为阳极使用）与另一根镀银铜丝焊接。
- 可在每对阳极-阴极铂电极之间串联一个LED，以在实验过程中确认电路功能（可选）。在每个LED下方贴一小块黑色绝缘胶带，防止LED光线照射到培养板中的细胞（图1C）。
- 将电线端子块连接器粘接在6孔板盖子的左上角，并将两根镀银铜丝分别连接至输入端子，如图1C所示。
- 从第二个6孔板盖子的左上角切下一块20 mm × 20 mm的区域（图1B，盖子编号2），以便容纳第一个盖子上的端子块连接器。将装有电极的第一个盖子与第二个盖子对合并用胶带固定在一起。
- 为增强两个盖子之间的粘合强度，可使用硅胶粘合涂层（可选）。具体操作为：在带有镀银电极的盖子上涂布一层3–5 mm厚的硅胶粘合剂，然后盖上另一个盖子，并静置12小时使其完全干燥。
- 将两根标准绝缘铜导线的一端连接至电线连接器的输出端子，另一端连接至香蕉插头（4 mm）。
注：这些导线的长度应根据细胞在培养箱内放置位置到箱外电源之间的距离确定（图1D）。 - 通过调节直流电源来设定施加于细胞的刺激剂量（电压）和刺激方案。
- 按下前面板上的ON/OFF按钮开启电源，再按下按钮1激活通道1。
- 按下按钮4（V-set）设置电压，然后依次按下按钮2、.和5，将负载输出设定为2.5 V，最后按下Enter确认。
- 根据以下简化公式，确保2.5 V（即2,500 mV）的负载输出对应100 mV/mm的电刺激强度。
VEStim =
；或
V = VEStim × d
其中，V = 电源输出电压（单位：毫伏）；d = 电极间距离（单位：毫米）；VEStim = 刺激电压（单位：毫伏/毫米）。
注：此简化仅适用于恒定直流电压情况。由于电极不直接接触细胞，而是通过培养基向细胞传递电刺激，因此培养基与细胞之间的电阻可忽略不计。
2. 成骨培养基中培养间充质干细胞
- 购买市售的大鼠间充质干细胞（MSCs）（参见材料表），并在液氮中保存至实验当天。或者，根据已发表的实验动物使用方案7,8，按照当地机构关于实验动物使用的相关规定，从其他动物中分离MSCs。
- 实验当天，从液氮中取出一支冻存管（含1 × 106个细胞），并在37 °C预热的水浴中迅速（1分钟内）解冻细胞。
- 在超净台内的无菌条件下，将冻存管内容物转移至50 mL离心管中，加入9 mL预热至37 °C的正常培养基（NM），该培养基由含10%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素溶液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；1×）组成。在300 × g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。
- 在超净台中弃去上清液，小心地将细胞沉淀重悬于12 mL预热至37 °C的正常培养基中。将重悬后的细胞转移至T-75细胞培养瓶中。
- 将细胞在37 °C、5% CO2、5% O2条件下培养，直至细胞融合度达到80%–90%（约需3–5天）。
- 传代细胞。
注意：除离心和孵育外，所有操作均需在超净台内无菌条件下进行。- 当细胞融合度达到80%–90%后，使用细胞解离液收集细胞。吸除细胞培养液，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，加入5 mL 1×细胞解离液，将培养瓶放回培养箱中孵育5分钟。
- 待细胞解离后，加入等体积的完全培养基以中和解离液。将细胞收集至50 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL新鲜正常培养基中。使用台盼蓝染色法检测活细胞数量。
- 将1 × 106个细胞接种至新的T-75培养瓶中，加入12 mL预热的正常培养基。在37 °C、5% CO2、5% O2条件下培养，直至细胞融合度达到80%–90%。
注意：细胞传代（步骤2.4.1–2.4.4）可重复数次，直至获得所需数量的细胞。请勿使用传代次数超过第8代的细胞。
- 在6孔板的每孔中加入3 mL正常培养基（含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM），接种9 × 104个细胞。将细胞在37 °C、5% CO2、5% O2条件下培养1天。
- 次日，吸除培养基，每孔加入3 mL成骨分化诱导培养基（OM；在正常培养基中添加10-7 M地塞米松、10 mM β-甘油磷酸钠和0.05 mM抗坏血酸-2-磷酸）。
- 将接种细胞的6孔板放入培养箱中，在37 °C、5% CO2、5% O2条件下过夜孵育。
3. 使用电刺激处理间充质干细胞
- 在细胞接受电刺激（EStim）处理当天，将电极置于70%乙醇溶液中消毒30分钟，随后在生物安全柜中用紫外光照射干燥30分钟。
- 在超净工作台内，将装有培养中MSCs的6孔板用带有电极的盖子盖好，确保电极完全浸没于培养基中（如有需要，可补充培养基）。将盖好的6孔板（EStim腔室）连同细胞转移至培养箱，并将其导线连接至电源。
- 将电源设置为2.5 V负载输出，对细胞进行1小时的电刺激处理3,9。
- 刺激结束后，断开电源，将EStim腔室从培养箱中取出。在无菌条件下，将带电极的盖子更换为标准的6孔板盖子。
- 将细胞重新放回培养箱中过夜。用PBS清洗电极，再用70%乙醇溶液清洗，并用细砂纸清除电极表面积累的腐蚀产物。
- 连续6天重复步骤3.1–3.5。第4天在施加电刺激前，于无菌条件下更换培养基：吸出1.5 mL旧培养基，加入1.5 mL预热的新鲜成骨诱导培养基（OM）。
- 连续7天施加电刺激后，继续将细胞培养7天，每3–4天更换一次培养基。
4. 成骨分化检测
- 在显微镜下观察细胞形态的变化。
- 为评估电刺激（EStim）对间充质干细胞成骨分化的影响，可测定钙沉积、碱性磷酸酶活性以及成骨标志物基因的表达水平，具体方法见其他文献3,9。
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结果
为了评估100 mV/mm电刺激（EStim）对间充质干细胞（MSCs）成骨分化的影响，分别在电刺激处理3天、7天和14天后以及未处理组（对照组）的细胞于培养第14天进行分析，通过观察形态学变化和钙沉积情况来评价其效果（图2）。具体方法为：采用明场显微镜观察细胞形态变化；或用4%多聚甲醛溶液固定细胞，0.02%茜素红溶液染色后，再利用明场显微镜进行成像以分析钙沉积情况。
在培养的第3、7和14天对成骨标志基因表达变化进行了详细分析（图3）。这是通过测量基因的相对表达水平来实现的 RunX2, 胶原蛋白 I, 骨桥蛋白，以及 Osterix 通过RT-qPCR及比较Ct值（循环阈值）法10，其中管家基...
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讨论
本文介绍了一种用于对间充质干细胞进行电刺激（EStim）处理的装置构建方法，该方法可增强成骨分化。
本文介绍的电刺激（EStim）装置无需特殊设备或专业知识，初级研究人员在标准的干细胞生物学/生物化学实验室中即可完成操作。然而，在构建和使用EStim装置时，有几个关键步骤需格外谨慎。处理铂电极时应特别小心，因为该金属质地柔软且易损。虽然也可使用其他金属（如钢或钨），但不推荐使用，因其容易发生腐蚀，可能产生细胞毒性13。此外，必须严格按照方案中所述方法对带电极的盖子进行清洗和灭菌，该方法已多次验证，能有效避免污染问题。最后，尽管该装置可用于研究其他对电刺激敏感的细胞活动，如细胞迁移14,15、增殖、凋亡16、细胞膜电位17以及支架黏附19，但本文所述的电刺激方案（100 mV/m...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了德国美因河畔法兰克福的AO基金会启动资助（S-14-03H）和弗里德里希斯海姆基金会（Stiftung Friedrichsheim）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Estim 装置制备 | |||
| 香蕉插头/插孔适配器 | Poppstars | 1008554 | 2 件 |
| 剪线钳 | Knipex | 78 03 125 | |
| 直流电源（0–30 V/0–3 A） | B&K Precision | Model 9130B | 任何类似型号均可使用 |
| 绝缘柔性导线（0.14 mm2） | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 件 |
| 非腐蚀性硅橡胶 | Dow Corning | 3140 RTV | *可在多家商店购买 |
| 铂丝（999.5/1000；1 mm ø） | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 每个 Estim 装置需 0.6 m |
| 70% 乙醇溶液 | 任意品牌 | Estim 装置的灭菌 | |
| 镀银铜线（0.6 mm ø） | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈每个 Estim 装置需 70 cm |
| 电烙铁套装 | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | 任何类似型号均可使用 |
| TPP 6 孔板盖 | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 每个 Estim 装置需 2 个盖 |
| 2.2 V 有线圆形 LED 灯 | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 件 |
| UHU 超强胶 | UHU GmbH & Co. KG | n/a | *可在多家商店购买 |
| 间充质干细胞培养 | |||
| β-甘油磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | G9422 | 成骨细胞培养 |
| DMEM，低糖，含 GlutaMAX 补充剂和丙酮酸钠 | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | 细胞培养 |
| 不含钙、镁的 DPBS | Thermo-Fischer Scientific | 14190144 | 细胞培养 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | 成骨细胞培养 |
| 胎牛血清 | Thermo-Fischer Scientific | 10500064 | 细胞培养 |
| 50 ml Falcon 管 | Sarstedt | 62,547,004 | 细胞培养 |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4544 | 成骨细胞培养 |
| 青霉素/链霉素 | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | 细胞培养 |
| Sprague-Dawley（SD）大鼠骨髓来源间充质干细胞 | Cyagen | RASMX-01001 | 细胞培养 |
| 细胞解离液 | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | 细胞培养，细胞解离 |
| 组织培养瓶，T75 | Sarstedt | 833911302 | 细胞培养 |
| TPP 6 孔板 | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 细胞培养 |
| 台盼蓝染料，0.4% 溶液 | Bio-Rad | 1450021 | 细胞计数 |
参考文献
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