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一种利用深度测序辅助的裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe自发抑制子筛选方法

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DOI：

10.3791/59133

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2019年3月7日

 ,  , 
1Department of Biology, Wake Forest University, 2Center for Molecular Communication and Signaling, Wake Forest University

本文内容

摘要

我们介绍一种在裂殖酵母中进行的简单抑制子筛选方案。该方法高效且无需诱变，  选择性  用于  突变  经常  发生于   a  单个  基因组的  位点  该方案适用于分离能够缓解由突变或药物引起的液体培养中生长缺陷的抑制子。

摘要

通过遗传筛选能够抑制由突变引起的表型缺陷的突变等位基因，是鉴定属于密切相关生化通路基因的一种强有力方法。以往的方法，如合成遗传阵列（SGA）分析，以及使用紫外线（UV）或甲基磺酸乙酯（EMS）、N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）等化学试剂进行的随机诱变技术，虽已被广泛使用，但通常成本较高且费时费力。此外，这些基于诱变的筛选方法常对生物体产生严重副作用，引发多个突变，从而增加了分离抑制子的复杂性。本文介绍一种简单而有效的方案，用于鉴定在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中导致生长缺陷的突变体中的抑制性突变。可通过自动化96孔板读数仪在较长时间内监测细胞在标准丰富液体培养基或合成液体培养基中生长缺陷的恢复情况。当细胞在培养过程中获得抑制性突变后，其后代将优于亲本细胞而占据竞争优势。随后可分离出相对于亲本细胞具有生长竞争优势的恢复细胞，并与亲本细胞回交。再通过全基因组测序鉴定抑制性突变。利用该方法，我们已成功分离出多个抑制子，可缓解因Elf1缺失导致的严重生长缺陷；Elf1是一种AAA+家族ATP酶，在细胞核mRNA转运和基因组稳定性维持中具有重要作用。目前已有超过400个裂殖酵母（S. pombe）基因的突变体会导致生长缺陷。由于其中许多基因尚未被功能表征，我们提出，这一用户友好、高通量的方法将加速发现新的功能相互作用。

引言

理解基因之间功能联系的基础在于能够识别复杂遗传性状产生多样化表型的分子机制1。在裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe（S. pombe）中，大多数编码蛋白质的基因对细胞存活而言是非必需的2。这一结果并不意味着这些基因不重要，而是反映了这些基因所属生化通路中存在复杂的补偿机制。解析这些补偿机制已生成上位性图谱，揭示了全面的遗传相互作用，拓展了我们对功能性生化通路的理解3,4。

高通量方法（例如，合成遗传阵列分析，即 SGA）已开发用于在芽殖酵母中鉴定全基因组范围的遗传相互作用，并已扩展应用于裂殖酵母5,6此类方法通常依赖于一个包含所有可存活的单蛋白编码基因缺失株的文库（约3,300个单倍体缺失突变株，覆盖裂殖酵母基因组的92%以上），并需要使用机械臂将目标菌株与文库中所有可能的菌株进行遗传杂交6。此外，SGA技术依赖于文库菌株具备正常且高效的交配能力，而这一表型在目前已有描述的444个基因中存在异常 S. pombe2.

尽管基因相互作用具有复杂性，但将携带两个基因突变的菌株表型与分别携带单个基因突变的两种菌株表型进行比较，通常会出现两种显著结果：1）双突变体的表型比预期的乘积性亲本表型更差，表现为生长缺陷，甚至在最极端情况下导致致死，这被称为负向遗传相互作用，通常表明这两个基因作用于平行的生物学通路；2）双突变体的表型优于预期的亲本表型组合，也称为正向遗传相互作用。正向遗传相互作用尤其具有研究意义，因为它提示这两个基因参与同一生物学过程。两个呈现正向相互作用的基因可能存在三种潜在关系：某一突变基因可能上调另一条平行通路中基因的表达，这两个基因可能在同一通路中协同作用且位于彼此的下游，或者这两个基因编码的蛋白质可直接相互作用。因此，正向遗传相互作用可用于绘制基因调控节点，并将功能未知的基因归类到特定的生化通路中7,8。

抑制子是一种能够缓解另一基因突变所导致的生长缺陷表型的突变，通常代表了两个基因之间的正向遗传相互作用9,10。位于被抑制突变位点之外的抑制子突变被称为基因间抑制子。这类抑制子在研究致死性遗传突变时具有特别重要的价值，可通过合成性挽救致死表型（也称为拉撒路效应）实现研究目的11。此外，它们在治疗遗传性疾病方面也具有潜在的治疗应用前景12,13。

基于上述各种原因，在多种模式生物中鉴定抑制性突变已被广泛用于促进人们对各种生物化学通路的理解14,15,16。筛选抑制性突变通常基于目标突变的表型，并需要通过随机诱变来分离能够缓解该表型的突变。几乎所有模式生物都已建立了随机诱变方法。例如，N-乙基-N-亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea, ENU）和甲基磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate, EMS）是两种能够诱导DNA中发生点突变的诱变剂，已在从细菌到小鼠的多种模型中广泛应用17,18,19。此外，氯化锰长期以来被用于酵母，因其锰离子具有抑制DNA修复通路的能力20。另一种常用方法是紫外线诱导的诱变，可产生全基因组范围的致突变性嘧啶二聚体21,22。

尽管利用化学诱变来鉴定抑制性突变的方法已被广泛使用，但该方法存在诸多缺点，包括需要使用危险化学品、成功率差异较大，以及诱变剂对多种细胞过程产生负面影响而引入额外的干扰因素23,24。此外，化学诱变通常在基因组中引发多个突变，这增加了利用遗传学和测序技术鉴定出导致生物体产生抑制表型的确切突变的复杂性25。

为解决现有诱变方法的局限性，我们提出一种在裂殖酵母中筛选自发抑制突变的方法，该方法不依赖任何诱变剂或基因敲除文库。该方法通过正向选择实验分离抑制突变体。其原理基于突变抑制亚群在液体培养中具有生长优势，可通过自动化酶标仪进行监测。仅当需要清除遗传背景或在全基因组测序前确认抑制子的单基因等位形式时，才使用交配和减数分裂。如果抑制表型由单个突变引起，则在与亲本菌株回交后，抑制表型将以2:2的比例分离。随后可通过全基因组测序鉴定抑制突变。我们建议该方法适用于所有能在液体培养中生长至大群体的微生物中的抑制子筛选。

方案

1. 菌株构建与准备

  1. 使用之前所述的标准定点突变（SDM）方法26，对目标基因（yfm, your favorite mutation）产生突变或缺失。
  2. 在开始筛选前，（最佳做法是）将突变菌株与野生型菌株回交，以清除遗传背景中的干扰因素，并获得新生的突变细胞作为亲本菌株。将亲本菌株在标准富集培养基平板上划线，分离为单菌落。随机挑选8至16个具有目标突变的独立菌落（生物学重复），用于酶标仪检测（见3.1）。
    注意：本方案仅在亲本菌株于液体培养基（基本培养基或富集培养基，无论是否含有药物，或在引起生长缺陷的温度变化条件下）中表现出生长缺陷时有效。所有亲本菌株均应为单倍体，因而能够与具有互补交配型的其他单倍体菌株进行遗传杂交。

2. 酶标仪检测

  1. 使用无菌接种棒，从第1.1步制备的各个菌落中取少量（无需精确量）接种至96孔聚苯乙烯微孔板中。将每个菌落悬浮于200 µL适当的液体培养基中（丰富或最低培养基，含或不含药物）。在每行微孔板中设置一个空白孔，加入200 µL相同培养基（不含细胞）。
  2. 在连接自动微孔板读数仪的微孔板检测软件上运行以下程序：设置动力学程序持续24小时，温度为30 °C，持续快速轨道振荡（425 cpm，振幅3 mm）。设置光信号读取模式为600 nm波长下的光散射，以测定光密度（OD），并设置从微孔板底部读取信号，读取频率为每2分钟一次（每孔在24小时内共读取721次）。
  3. 24小时后，记录经空白校正后的最终光密度读数（校正后OD600），并使用以下公式计算将各样品稀释至O.D. = 0.1所需的稀释体积：
    分光光度分析中的光密度稀释公式。
    注：从微孔板读数仪软件导出数据，并使用电子表格软件将上述公式设为函数，批量处理各实验孔所需的稀释体积。
  4. 每隔24小时，使用与第0天相同的培养基，根据第2.3步所示公式将各样品稀释至O.D. = 0.1（约1.5 × 106 个细胞/mL）。保存每日生成的生长曲线，并记录任何表现出生长速率增加的单个菌落，判断依据为最终O.D.显著高于同基因背景的其他菌落，或其生长曲线与野生型菌落相似。
    注：该实验通常持续约7–14天。所有操作均需在无菌条件下进行。

3. 抑制菌落的筛选及表型验证。

  1. 从酶标仪检测的最后一天（步骤 2.4）起，保存那些生长速率明显恢复的液体培养物，这些菌株可能获得了抑制突变，从而缓解了亲本突变的表型。将 250 µL 液体培养物转移并混匀至含有 250 µL 50% 甘油的冻存管中。用液氮速冻细胞，并将菌株长期保存于 -80°C。
  2. 为确认该抑制突变是可遗传的遗传元件，采用标准的遗传杂交方法将 yfm P（P 代表亲本，即酶标仪检测开始时使用的菌株）与 yfm S（S 代表抑制子，即酶标仪检测结束时保存的菌株）进行杂交。如果该抑制突变确实是可遗传的遗传元件，则 yfm P × yfm S 的杂交结果应产生四分体，其中两个菌落表现出亲本菌株的生长缺陷表型，另外两个菌落则表现出抑制子菌株的恢复生长速率。
  3. 从步骤 3.2 的杂交结果中，选取同一杂交组合内具有抑制表型的三个菌落（S 菌株）和具有亲本表型的三个菌落（P 菌株）（每组各三个生物学重复），并继续进行以下基因组 DNA 提取和测序步骤。
    注意：强烈建议执行步骤 3.2 和 3.3，但并非必需。替代方案是将步骤 3.1 中收集到的恢复生长的液体培养物涂布于丰富培养基上，获得单菌落后随机挑选三个菌落作为生物学三重复进行全基因组测序，而无需进一步的遗传学验证。在此情况下，应同时使用亲本菌株的三个生物学重复进行基因组测序以作比较。

4. 基因组DNA提取、文库构建与测序。

  1. 进行DNA提取、文库构建和测序时，从遗传杂交（步骤3.2）或用于获得S型菌株单克隆的平板（步骤3.3注释）中，每种yfm P菌株随机选取三个生物学重复，每种独立出现的yfm S菌株也各选取三个生物学重复。
  2. 将菌株在10 mL丰富培养基中培养至对数中期（O.D. = 0.5–0.8，约0.75–1.2 × 107 个细胞/mL），使用摇床在30 °C、250 rpm持续振荡条件下培养液体培养物。在4 °C下以1000 × g离心5分钟收集细胞。
  3. 将沉淀的细胞重悬于400 µL DNA提取缓冲液（2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris-Cl（pH 8.0）、1 mM Na2-EDTA）中，然后加入400 µL玻璃珠和400 µL 25:24:1酚:氯仿:异戊醇。在4 °C下剧烈涡旋振荡2分钟。
  4. 额外加入200 µL DNA提取缓冲液，通过反复倒置混匀。在4 °C下以20,000 × g离心5分钟。
  5. 将水相转移至洁净离心管中，加入20 µg RNase A/T1混合液，在37 °C孵育15分钟。
  6. 加入等体积的25:24:1酚:氯仿:异戊醇，于4 °C下以20,000 × g离心5分钟，然后将水相转移至新的洁净离心管中。
  7. 加入等体积氯仿，反复倒置混匀，再于4 °C下以20,000 × g离心5分钟，随后将水相转移至另一洁净离心管中。
  8. 加入两倍体积的100%乙醇和十分之一体积的3 M NaOAC（pH 4.3），在-20 °C沉淀至少2小时，然后在4 °C下以20,000 × g离心5分钟，收集DNA沉淀。
  9. 用预冷的70%乙醇洗涤沉淀（即沉淀的DNA）两次（20,000 × g，4 °C，离心5分钟），并将沉淀重悬于50 µL 10 mM Tris缓冲液（pH 7.4）中。
  10. 按照制造商说明使用文库构建试剂盒（见材料表）制备全基因组测序文库。
    注：我们推荐使用材料表中列出的试剂盒，因为它可在无需PCR扩增的情况下构建基因组文库，从而最大限度减少PCR扩增过程中引入的错误突变。此外，在基因组文库构建过程中，应避免磁珠完全干燥，建议将磁珠干燥时间缩短至1–2分钟。
  11. 文库构建过程中的片段化参数设置如下：使用聚焦式超声仪（见材料表），设定占空比为20%，峰值功率为175 W，每脉冲200个循环，频率扫描模式，温度控制在5.5 °C至6 °C，处理时间为45秒。或者，使用DNA与染色质片段化系统（见材料表），设置为4 °C下50%振幅，脉冲模式（开15秒，关15秒），持续10分钟，总处理时间为20分钟。
  12. 本步骤中使用的危险化学品必须谨慎操作。请查阅相应的材料安全数据表（MSDS）以及所在机构的环境健康与安全部门指南，以正确处理NaOAC、乙醇、25:24:1酚:氯仿:异戊醇和氯仿。
  13. 对所得基因组文库进行测序。测序读长应覆盖整个基因组至少三倍，分辨率达到单核苷酸水平。推荐采用双端测序（或最新技术）。

5. 鉴定抑制性突变的生物信息学分析

  1. 进行生物信息学分析，重点关注亲本株与抑制株之间一致鉴定出的基因组变化 yfm 所有生物学重复中的菌株。
    注意：完整的流程如下所述，此外，还提供了两个纯文本 BASH 脚本文件 fastq_to_vcf.sh 和 vcfprocess.sh 作为补充材料，分别用于展示从测序读段处理到 VCF 变异文件的流程，以及 VCF 文件的处理与交集分析流程。
  2. 使用 SHEAR（https://github.com/jbpease/shear）对短序列读段进行修剪，执行以下命令行（其余选项均为默认设置）：
    shear.py --fq1 $FASTQ1 --fq2 $FASTQ2 --out1 $OUTFQ1 --out2 $OUTFQ2 \
    --barcodes1 $BARCODE --platform TruSeq --trimqual 20:20 \
    --trimpolyat 0 --trimambig --filterlength 50 --filterunpaired
  3. 将测序读段比对到参考序列 S. pombe 参考基因组 v2.30 来自 PomBase（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/fasta/），使用 BWA v0.7.15 进行比对27. 使用以下命令行（其余选项均为默认值）：
    bwa mem -t 8 $GENOME $OUTFQ1 $OUTFQ2 > $SAM1
  4. 将比对后的SAM文件通过GATK最佳实践流程处理28 使用 GATK v3.6 进行变异检测29、PicardTools v2.5.0（http://broadinstitute.github.io/picard）、SAMtools v1.3.130使用以下命令行和参数（其余选项均为默认设置）：
    java -Xmx30g -jar picard.jar AddOrReplaceReadGroups INPUT=$SAM1 \
    OUTPUT=$BAMMARKED RGID=1 RGLB=lib01 RGPL=illumina \
    RGPU=$BARCODE RGSM=$SAMPLENUMBER
    samtools fixmate -O bam $BAMMARKED $BAMFIXED
    samtools sort -O bam -o $BAMSORTED -T /home/peasejb/tmp $BAMFIXED
    samtools index $BAMSORTED
    java -Xmx30g -jar GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller \
    -R $GENOME -I $BAMSORTED --genotyping_mode DISCOVERY \
    -stand_emit_conf 10 -stand_call_conf 30 -o $VCFRAW
  5. 使用 tabix 压缩和索引 VCF 文件：
    bgzip $VCFRAW.vcf
    tabix $VCFRAW.vcf.gz
  6. 使用 BCFtools v1.3.1 比较亲本株与抑制子株测序重复样本的 VCF 文件27使用以下命令行和参数（所有其他选项保持默认）：
    bcftools isec -n+1 $VCFPARENTAL1.gz $VCFPARENTAL2.gz $VCFPARENTAL3.gz \
    $VCFMUTANT1.gz $VCFMUTANT2.gz $VCFMUTANT3.gz > common_variants.list
    注意：该命令生成的文件采用二进制编码，其中仅在第一个突变体中出现的序列变异被编码为“000100”，仅在第二个突变体中出现的编码为“000010”，三个突变体中均出现的编码为“000111”，依此类推。针对每组亲本和突变体重复的VCF文件均生成了相应的文件。
  7. 使用 UNIX grep 命令将变异位点交集列表文件合并，并在每一行末尾附加对应的文件名：
    grep "." *.list > 全部列表
  8. 使用自定义 Python 脚本（variant_characterize.py）将完整的变异位点列表与当前的 GFF3 注释文件（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/pombase/pombe/Chromosome_Dumps/gff3/schizosaccharomyces_pombe.chr.gff3）进行比对，以鉴定蛋白质编码区（同义和非同义 SNP）、5′ 和 3′ 非翻译区（UTR）以及非编码 RNA（ncRNA）中的稳定 SNP 位点。
    python3 variant_characterize.py --list common_variants.list
    --gff 裂殖酵母染色体.gff3
    --fasta Schizosaccharomyces_pombe.ASM294v2.30.dna.genome.fa
    --pattern 000100 --out all.list.filter.000100
    重复执行此脚本，使用二进制文件修改 --pattern 参数以及输出文件的后缀（--out）
    模式：000010、000001、000110、000011、000101 和 000111
  9. 将所有这些脚本运行的输出结果合并为一个制表符分隔的文件，以便作为电子表格查看。标注的变异位点表格包含相对于背景菌株在单个或两个以上突变菌株中出现的变异。二进制标志字段表示变异位点出现在单个突变菌株（000100、000010、000001）、两个突变菌株（000011、000101、000110）或全部三个突变菌株（000111）中的情况。
  10. 分析在亲本样本中未发现但在一个、两个或全部三个突变样本中出现的变异注释列表。注释信息包括变异的基因组位置及其类型（如编码区的同义/非同义变异、3'/5'非翻译区、非编码区等）。从候选突变列表中，一个高度相关的候选变异示例是在全部三个菌株中 consistently 出现的非同义编码区变异。另一类强候选情况是在突变菌株中出现在相近区域或同一基因内的多个非同义变异或推测的调控区变异的富集。

结果

生长缓慢的突变体在液体培养中表现出表型恢复
我们选取了三个涉及不同生物学通路、具有生长不良、生长缓慢表型的突变体：AAA家族ATP酶Elf1、组蛋白去乙酰化酶Clr6以及外显子连接复合物组分Fal1。将野生型菌株及这三个基因突变体菌株（均已与野生型菌株回交）划线分离为单菌落，随机挑选16个单菌落，按照前述方法在96孔板中进行液体丰富培养基培养。使用酶标仪连续监测初始时间点（第0天）及之后6天的生长曲线。正如预期，野生型菌落在整个实验过程中其生长曲线未出现明显变化31（图1）。值得注意的是，四个具有elf1∆背景的菌落和一个fal1∆菌落表现出显著的生长转变，从生长缓慢恢复至不同程度的生长状态，接近或类似于野生型菌落的生长水平。尤为显著的是，所有clr6-1突变体均表现出一致的表型恢复，在实验结束时生长速度明显加快31（图1）。为了区分不同表型，我们将原本生长缓慢的原始菌株称为“P菌株”（或亲本菌株），将表现出表型恢复的菌株称为“S菌株”（或抑制菌株）。请注意，图1仅为一轮筛选实验的示例，不代表后续代表性结果中鉴定并测序的所有非互补性抑制突变体。

表型恢复归因于可遗传的性状
S. pombe 可在丰富培养基中以单倍体形式生长，但在氮源饥饿条件下，两种具有互补交配型的单倍体菌株会进行交配。裂殖酵母的减数分裂包括一次DNA复制，随后进行两次细胞分裂。有性生殖周期最终形成四个单倍体孢子，这些孢子携带亲本菌株的遗传物质，并遵循经典的孟德尔遗传规律，实现遗传性状的2:2分离（图2A）。当将所有被抑制的菌株（S菌株）与其亲本菌株（P菌株）在同一平板上培养相同时间后，我们验证了2:2的分离模式，结果均产生两个小型菌落（生长缺陷型）和两个大型菌落（抑制子表型）。被抑制的elf1∆、clr6-1和fal1∆细胞的个别实例如图2B所示。我们已确认，所有分离得到的S菌株均携带一个单基因遗传元件，该元件可抑制其P菌株的缓慢生长表型（数据未显示）。

全基因组测序成功鉴定出抑制突变
例如，我们采用成对末端全基因组测序来鉴定导致 elf1∆ S 菌株表型恢复的遗传元件。更完整的数据分析方法可在线获取31。简而言之，我们使用了两株独立构建的 elf1∆ P 菌株的生物学三重复，以及五组非互补的 elf1∆ S 菌株的生物学两重复，每组均含有不同的抑制因子。在通过生物信息学分析获得注释变异列表（6.1–10）后，我们优先筛选出与分析相关的特定类型变异。我们重点关注在各个 elf1∆ S 菌株的生物学重复中一致存在、且与其亲本 elf1∆ P 菌株相比完全相同的基因组改变（图3 和 补充表1–4）。我们在五种不同的 elf1∆ S 菌株中均鉴定出五个在CDS区域的非同义突变，分别位于 rli1+、SPBPJ4664.02、cue2+ 和 rpl2702+ 基因中。S-A1 和 S-A2 均含有突变的 SPBPJ4664.02，尽管突变发生在不同的氨基酸位点。由于 SPBPJ4664.02 是一个长基因（11,916个核苷酸），含有数百个重复序列，因此无法通过PCR扩增后测序的方式确认这些突变。S-A3 含有一个在 rli1 基因中的缺失突变，在两个生物学重复中均一致存在，但在 elf1∆ 背景下该突变未与S表型共分离。我们在S-B1中鉴定出一个 cue2 突变体（cue2-1），其第396–400位氨基酸缺失。S-B2含有一个 rpl2702 突变体（rpl2702-1），导致第45位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸31。如下所示，cue2-1 和 rpl2702-1 均已被证实为 elf1∆ 的抑制突变。

通过遗传学验证确认所鉴定的抑制性突变，证实了表型恢复的可遗传性
利用定点突变的标准实验方案，实验室中重建了两个鉴定出的非同义突变cue2-1和rpl2702-1。将双突变菌株cue2-1 elf1∆ P和rpl2702-1 elf1∆ P与互补的elf1∆ P菌株进行杂交31（图4）。如果通过本筛选鉴定出的非同义突变足以抑制elf1∆ P的表型，那么所产生的四分体中，来自每个四分体四个孢子形成的菌落应呈现出2:2的小菌落与大菌落比例。实验结果表明，遗传杂交证实所鉴定的抑制性突变能够有效抑制elf1∆ P的生长迟缓表型，并且该抑制效应具有可遗传性。

figure-results-1
图1：可通过酶标仪记录生长曲线来监测表型恢复情况。 将野生型（WT）、elf1∆、clr6-1 和 fal1∆ 的16个单菌落接种于96孔板中，在24小时期间记录生长曲线，并每天将菌落重新稀释至丰富培养基中。在第0天24小时时间点末端的低吸光度（O.D.）明显反映出生长缺陷。表型恢复的菌株是指在第6天24小时期间其生长曲线与野生型相似或接近的菌株。经过6天后，elf1∆ 中有4个菌落、fal1∆ 中有1个菌落，以及所有 clr6-1 菌落均表现出不同程度的表型恢复。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：遗传杂交可证实表型恢复归因于单个可遗传等位基因。（A）当裂殖酵母细胞经历氮源饥饿时，两个具有互补交配型的单倍体细胞可形成合子，该合子经孢子形成产生包含4个孢子的四分体。亲本遗传物质在减数分裂过程中将遵循孟德尔遗传规律发生分离。（B）将表型恢复的菌落（标记为S，表示被抑制）与对应的亲本菌落（无表型恢复，标记为P，表示亲本）进行回交。遗传杂交结果显示2:2的小菌落（生长劣势）与大菌落（恢复生长）分离模式，表明表型恢复具有可遗传性，并可归因于单个遗传元件。红色框表示携带抑制子等位基因的菌落，蓝色框表示携带亲本等位基因的菌落。该图经 Marayati 等，201831 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-3
图3：全基因组测序数据分析以鉴定导致表型恢复的遗传元件。 对两种亲本“P”菌株（P-A 和 P-B）的三个生物学重复，以及五种表型恢复的转换“S”菌株（S-A1、S-A2 和 S-A3 来自 P-A；S-B1 和 S-B2 来自 P-B）的两个生物学重复进行测序，并将突变整理为每个恢复菌株相对于其来源亲本菌株基因组的突变列表（例如 P-A 与 S-A1 比较等）。在所有此类成对比较的全基因组范围内检测到的突变总数为 660 个。当仅筛选在同一“S”菌株的两个生物学重复中均出现的突变时，共鉴定出 44 个突变。在 44 个突变中，有 12 个为插入/缺失（INDEL）或非同义突变。在这 12 个 INDEL 或非同义突变中，有 5 个位于蛋白质编码序列内。这 5 个突变可能与导致表型恢复菌株的单一遗传元件相关：在 S-A1 和 S-A2 中发现的 SPBPJ4664.02 基因的非同义突变、在 S-A3 中发现的 rli1 基因的 INDEL、在 S-B1 中发现的 cue2 基因的 INDEL，以及在 S-B2 中发现的 rpl2702 基因的非同义突变。有关这些突变及筛选背景的详细序列信息见 补充表1-4。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：通过全基因组测序鉴定出的抑制因子的验证。 全基因组测序结果通过独立构建突变体并进行遗传杂交实验得以验证，通过杂交恢复表型以确认突变的遗传效应 elf1∆ cue2-1 菌株与一个 elf1∆ P 菌株，以及 elf1∆ rpl2702-1 与 elf1∆ P 菌株。展示了三个典型的垂直四分体。红色框内为双突变体菌落（elf1 cue2-1，或 elf1 rpl2702-1）；蓝色方框为 elf1∆ 菌落。该图改编自 Marayati 等，201831. 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充表 1。 请点击此处下载该表格。

补充表 2. 请点击此处下载该表格。

补充表 3。 请点击此处下载该表格。

补充表 4。 请点击此处下载该表格。

补充编码文件。 请点击此处下载 文件。

讨论

本文所述方案代表了一种新颖且简单的筛选方法，可用于检测通过表型恢复而显现的自发抑制突变。该方法基于裂殖酵母中导致生长缓慢的突变进行筛选，这种表型与粟酒裂殖酵母（S. pombe）中超过400个基因相关，其中许多基因的功能仍不清楚2,32。以往的方法采用其他策略来筛选微生物中的抑制突变，包括使用诱变剂21，或在温度敏感型突变背景下施加温度转换33。相比之下，本方案表明，无需额外的环境或化学干预即可实现表型恢复，并突显了抑制突变在液体培养中逐渐占据可用资源所获得的适应性优势。该筛选方法能够分离出旁路抑制子或相互作用抑制子，因其对无功能突变（如 elf1∆ 或 fal1∆）和点突变（如 clr6-1）均有效，只要这些突变体在液体培养中表现出适应性缺陷即可。

迄今为止，我们研究的所有恢复型S菌株均表现出不同程度的表型恢复。通过遗传杂交检测发现，该恢复表型由单一遗传元件所致，并可遗传（示例见图2）。与基于化学诱变或紫外线诱变的抑制子筛选方法相比，这是本方法最显著的优势之一，因为后者通常作用于多个基因组位点。通常情况下，在16个菌落/菌株中可观察到一至两个菌落恢复（约占10%），且在一周内即可发现。然而，我们注意到某些突变体，例如核特异性外切体亚基Rrp6的功能缺失突变体，始终无法恢复至elf1Δ细胞中几乎接近野生型的生长速率31。这可能是因为Rrp6的功能只能被抑制子部分补偿，而其他测试的突变体（包括fal1∆）则不同，后者因其在调控性剪接中的重要作用已被证明会导致严重的减数分裂缺陷34。我们认为，当yfg在细胞生长中具有独特且不可替代的功能时，其他抑制子筛选方法也会面临同样的问题。

在进行基因组测序之前，最好将从酶标仪上鉴定出的表型恢复菌落与亲本菌株进行回交，以清除遗传背景并获得生物学重复样本。此外，深度全基因组测序可鉴定出数百个单核苷酸变异，其中大多数在生物学重复样本之间并不一致，因此对筛选意义不大。例如，我们在两个 elf1Δ P 菌株和五个不同的 S 菌株之间，共发现位于全部三条染色体上的 660 个基因组变异（图 3）。我们并未在每个菌株的测序生物学重复样本之间普遍观察到相同的突变，这表明这些突变可能是在构建基因组文库前培养 elf1Δ 细胞过程中新产生的，或是在文库构建和测序过程中引入的随机错误。因此，在生物学重复样本中一致存在的突变的鉴定，是利用全基因组测序成功识别抑制子的关键环节。

我们在5个测序的S型菌株中鉴定并确认了两个位于编码区（CDS）的抑制子。尽管在S-A1和S-A2菌株中均检测到SPBPJ4664.02基因的突变，但SPBPJ4664.02不太可能是有效的抑制子，因为S-A1和S-A2菌株在相同基因上并不携带互补的抑制子（数据未显示）。此外，我们未在S-A3菌株中确认rli1的突变，因其在与elf1Δ回交时未与S表型共分离。另一方面，我们在S-A1、S-A2和S-A3菌株的非编码区发现了特异性突变。这些突变的非编码基因组区域可能缓解了elf1Δ的表型，这将在我们未来的研究中进一步探讨。与传统的遗传连锁分析等方法相比（该方法可能需要数年时间才能定位一个基因突变），我们在确认单基因元件导致S表型后的两个月内即鉴定了两个抑制子。随着全基因组测序技术的快速发展，我们有理由相信，在可预见的未来，该方法将更高效地用于鉴定一致的遗传突变。

综上所述，本实验方案提供了逐步操作指南，可成功筛选出在液体培养中具有生长缓慢缺陷的任意目的基因的抑制性突变。该检测方法操作简便，仅需较少的实践培训即可对多种感兴趣的遗传背景进行大规模筛选。该流程尚有进一步自动化的空间，例如使用液体处理机器人完成每日的稀释操作。由于微生物的实验室操作不可避免地需要在液体培养中进行，而这一过程本身具有对适应性的选择作用，因此我们建议本方案可广泛应用于其他大群体模式生物，如细菌及其他酵母物种。

披露

作者声明未获得本方法中所用仪器制造商的任何支持，且不存在竞争性经济利益。

致谢

本工作由美国普通医学科学研究所资助，项目编号1R15GM119105-01，授予K.Z.。我们感谢所有审稿人提出的富有见地的评论。同时感谢James Tucker、Alicia Anderson、Elizabeth Black和Glen Marrs对本手稿的讨论和意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
腺嘌呤，粉末Acros Organics147441000以 75 mg/L 浓度用于制备液体和固体富集培养基（YEA）
细菌学培养皿Corning, FalconC351029100 ×15 mm，用于在固体富集培养基上培养菌株至单菌落
D-葡萄糖无水物，粉末Fisher ChemicalD16-1以 30 g/L 浓度用于制备液体和固体富集培养基（YEA）
Difco 琼脂，颗粒状Becton, Dickinson and Co.214530以 20 g/L 浓度用于制备固体富集培养基（YEA）
DNA 提取缓冲液2% Triton X-100，1% SDS，100 mM NaCl，10 mM Tris-Cl（pH 8.0），1 mM Na2-EDTA
聚焦式超声破碎仪Covaris Inc.S220可选 QSonica Q800R 超声仪/DNA 和染色质剪切系统
Gen5 数据采集与分析软件Biotek, Inc.GEN5SECURE或同等产品，必须与微孔板读板仪兼容，用于从微孔板读板仪导出数据
盐酸 1N，液体Fisher ChemicalSA48-4用于将液体和固体富集培养基的 pH 调整至 5.5
液体富集培养基（液体 YEA）30 g/L D-葡萄糖，5 g/L 酵母提取物，75 mg/L 腺嘌呤，用 1 M HCl 将 pH 调至 5.5
微孔板读板仪，Synergy H1 混合模式多功能读板仪Biotek, Inc.BTH1MG或同等产品，必须能检测 600 nm 波长范围的可见光
富集培养基琼脂平板（YEA 平板）30 g/L D-葡萄糖，5 g/L 酵母提取物，75 mg/L 腺嘌呤，20 g/L 琼脂，用 1 M HCl 将 pH 调至 5.5
RNase A/T1 混合酶Thermo Fisher ScientificEN0551按制造商推荐方法使用
无菌聚苯乙烯接种环Corning, Inc.OS101或同等产品，用于将菌落从琼脂平板转移至 96 孔板
无菌操作空间及酒精灯
组织培养板，96 孔光学平底带低蒸发盖Corning, FalconC353072或同等产品，必须具有光学平底以适用于微孔板读板仪
TruSeq DNA PCR-Free LT/HT 文库制备试剂盒Illumina, Inc.20015962用于制备全基因组测序文库
酵母提取物，粉末Fisher ChemicalBP1422-500以 5 g/L 浓度用于制备液体和固体富集培养基（YEA）

参考文献

  1. McKay, J. K., Latta, R. G. Adaptive population divergence: Markers, QTL and traits. Trends in Ecology and Evolution. 17 (6), 285-291 (2002).
  2. Wood, V., Harris, M. A., et al. PomBase: A comprehensive online resource for fission yeast. Nucleic Acids Research. 40 (D1), (2012).
  3. de Visser, J. A. G. M., Cooper, T. F., Elena, S. F. The causes of epistasis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1725), 3617-3624 (2011).
  4. Sailer, Z. R., Harms, M. J. Detecting high-order epistasis in nonlinear genotype-phenotype maps. Genetics. 205 (3), 107911088(2017).
  5. Kuzmin, E., Costanzo, M., Andrews, B., Boone, C. Synthetic genetic arrays: Automation of yeast genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 326-332 (2016).
  6. Tong, A. H. Y., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 313 (1), 171-192 (2006).
  7. Dixon, S. J., Costanzo, M., Baryshnikova, A., Andrews, B., Boone, C. Systematic Mapping of Genetic Interaction Networks. Annual Review of Genetics. 43 (1), 601-625 (2009).
  8. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  9. Bai, X., Yang, Z., Jiang, H., Lin, S., Zon, L. I. Genetic suppressor screens in haploids. Methods in Cell Biology. , 129-136 (2011).
  10. Manson, M. D. Allele-specific suppression as a tool to study protein-protein interactions in bacteria. Methods. 20 (1), 18-34 (2000).
  11. Motter, A. E., Gulbahce, N., Almaas, E., Barabási, A. L. Predicting synthetic rescues in metabolic networks. Molecular Systems Biology. 4, 168(2008).
  12. Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nature Biotechnology. 22 (5), 595-599 (2004).
  13. Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, S. C., Muchowski, P. J. A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease. Nature Genetics. 37 (5), 526-531 (2005).
  14. Forsburg, S. L., Patton, E., et al. The art and design of genetic screens. Nature reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  15. Johnston, D. S. The art and design of genetic screens. Genetics. 3 (March), 176-188 (2002).
  16. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  17. Gocke, E., Müller, L. In vivo studies in the mouse to define a threshold for the genotoxicity of EMS and ENU. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 678 (2), 101-107 (2009).
  18. Suzuki, T., Hayashi, M., et al. A comparison of the genotoxicity of ethylnitrosourea and ethyl methanesulfonate in lacZ transgenic mice (Muta(TM)Mouse). Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 395 (1), 75-82 (1997).
  19. Uttam, J., Alberico, C., De Stasio, E. ENU Mutagenesis. International C. elegans Meeting. , (1995).
  20. Putrament, A., Baranowska, H., Ejchart, A., Prazmo, W. Manganese Mutagenesis in Yeast. Methods in Cell Biology. 20, 25-34 (1978).
  21. Bose, J. L. Chemical and UV mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 1373, 111-115 (2016).
  22. Ikehata, H., Ono, T. The Mechanisms of UV Mutagenesis. Journal of Radiation Research. 52 (2), 115-125 (2011).
  23. Shrivastav, N., Li, D., Essigmann, J. M. Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation. Carcinogenesis. 31 (1), 59-70 (2010).
  24. De Stasio, E. A., Dorman, S. Optimization of ENU mutagenesis of Caenorhabditis elegans. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 495 (1-2), 81-88 (2001).
  25. Probst, F. J., Justice, M. J. Mouse mutagenesis with the chemical supermutagen ENU. Methods in Enzymology. 477 (C), 297-312 (2010).
  26. Bähler, J., Wu, J. Q., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  27. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows – Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  28. Van der Auwera, G. A., Carneiro, M. O., et al. From fastQ data to high-confidence variant calls: The genome analysis toolkit best practices pipeline. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11.10.1-11.10.33 (2013).
  29. Mckenna, A., Hanna, M., et al. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research. 20, 1297-1303 (2010).
  30. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Marayati, B. F., Drayton, A. L., et al. Loss of Elongation-Like Factor 1 Spontaneously Induces Diverse, RNase H-Related Suppressor Mutations in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 209 (4), 967-981 (2018).
  32. Harris, M. A., Lock, A., Bähler, J., Oliver, S. G., Wood, V. FYPO: The fission yeast phenotype ontology. Bioinformatics. 29 (13), 1671-1678 (2013).
  33. Xu, X., Wang, L., Yanagida, M. Whole-Genome Sequencing of Suppressor DNA Mixtures Identifies Pathways That Compensate for Chromosome Segregation Defects in Schizosaccharomyces pombe. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (3), 1031-1038 (2018).
  34. Marayati, B. F., Hoskins, V., et al. The fission yeast MTREC and EJC orthologs ensure the maturation of meiotic transcripts during meiosis. RNA. 22 (9), 1349-1359 (2016).

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