本研究报道了使用真空采血管系统结合眼镜式放大镜从小鼠尾静脉采血的方法。该方法易于操作，可用于小鼠的重复采血。
方法文章
使用真空采血系统和眼镜式放大镜对未麻醉小鼠尾静脉进行改良采血
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
血液样本采集是实验动物研究的基础，对于各种研究目的而言，获取足量的血液样本至关重要。小鼠尾静脉较细，采用传统穿刺方法有时难以获得所需的血量。本研究旨在比较初学者和专家分别使用真空采血系统结合眼镜式放大镜（实验组）与传统采血方法（对照组）从小鼠尾静脉重复采集血液样本的优劣。在实验组中，借助眼镜式放大镜，将蝶形针头插入每只小鼠的尾静脉；当成功穿刺静脉后，将蝶形针的橡胶接头插入真空采血管，即可收集血液样本。在对照组中，则使用注射器在无放大辅助的情况下进行采血。结果显示，初学者与专家在实验组中的采血成功率分别为70%与100%（p < 0.01），而在对照组中分别为35%与85%（p < 0.01）。无论初学者还是专家，实验组获取所需血量所需的穿刺次数均显著低于对照组（2.40 ± 0.75 vs. 2.90 ± 0.31，p < 0.05；1.15 ± 0.37 vs. 1.55 ± 0.76，p < 0.05）。综上所述，该采血技术可行、易于掌握，能够从非麻醉小鼠中频繁采集足量血液样本。
引言
实验动物采血是一项基本的研究技术。目前已有多种从小鼠采血的技术，包括断尾法、心脏穿刺、眶后静脉丛穿刺、颈静脉穿刺、尾静脉穿刺以及下腔静脉穿刺。理想情况下，应以最小侵入性的方式采血，并将对动物健康的影响降至最低。然而，目前常用的技术往往会给动物带来应激反应，从而影响研究结果1。通过眶后静脉丛采血可用于从小鼠获取足够的血量2。但该方法可能导致严重的组织损伤，且无法在短时间内重复采血3。
尾静脉是采集小鼠血液的较优部位，因其对小鼠造成的损伤最小。然而，小鼠尾静脉较细，有时难以通过常规穿刺技术获得足够的血量。在某些情况下，需要进行多次穿刺才能获取所需的血液体积。通常建议使用麻醉以方便从小鼠尾静脉采血。 此外，可能需要使用手术刀、直刃剃刀或锋利的剪刀切除尾端以获取所需的血样4。我们此前已报道，采用真空采血系统可成功从非麻醉大鼠的尾静脉采集血液，该方法降低了血液污染的风险，并避免了重复穿刺的需要5。本研究报道了一种类似的非麻醉小鼠尾静脉采血方法。
方案
1. 饲养管理
- 使用12周龄的昆明小鼠。
注意：我们使用了来自实验动物中心的小鼠（n = 40，20只雄性，37–46 g，平均体重42.38 ± 2.39 g） 同济 医学 学院 - 在标准条件下饲养小鼠，自由摄取食物和饮用水。每笼饲养两只小鼠，笼具面积为530 cm²。2 带有木屑垫料的笼具
- 保持室温在21–23℃之间 °C.
- 在整个研究期间，给小鼠饲喂正常盐饮食（0.3% NaCl）。
2. 血液样本采集
- 准备以下设备：真空采血管（1 mL）、蝶形针、眼镜式放大镜和塑料固定器。将它们放置在无菌表面上（图1）。
- 将小鼠放入塑料固定器中，用温水（20–30 °C）清洗其尾部。用70%乙醇浸湿的棉球擦拭尾部，以扩张静脉。选择右侧或左侧尾静脉进行采血。轻轻握住尾部下段，在采血过程中保持尾部伸直。
- 采集血液。若需比较不同方法，将采血分为两组：采用下述本研究建立方法的“实验组”和采用下述传统方法的“对照组”。
- 实验组采血：
- 佩戴眼镜式放大镜，以便更清晰地观察尾静脉穿刺部位。将22 G蝶形针针尖插入尾部一侧的侧尾静脉，穿刺位置距离尾尖约一半长度处，进针角度约为10°，朝向尾根方向，便于多次采样。
- 将蝶形针的橡胶端插入真空采血管以收集血液（图2）。
注意：若采血过程中血液停止流出，应迅速调整针头角度。为避免针内血液凝固，若15秒后仍无血液流出，应更换穿刺位置。
- 对照组方法：
- 将连接注射器的针头插入距离尾尖约三分之一长度处的一侧尾静脉。
- 当血液进入注射器乳头时，缓慢回拉活塞以采集血液（图3）7。
注意：为深入阐明采血经验差异的影响，选择一名初学者和一名专家同时使用实验组和对照组方法进行采血。
- 实验组采血：
- 采血完成后，拔出针头并按压穿刺点以止血。随后将小鼠从塑料固定器中取出，并放回笼中。
注意：已有报道表明，健康动物每隔2周可安全采集不超过其总血容量10%的血液8，因此每次采血约175 µL，符合伦理原则。 - 使用含EDTA的采血管收集血浆，使用不含抗凝剂的采血管收集血清。轻轻颠倒混匀数次，并垂直置于冰上。
- 将采血管在预冷的离心机中以1,000 × g离心10分钟，以分离血浆和血清。
注意：成功采血定义为每次获得175 µL血液。穿刺次数不应超过三次，若第三次穿刺后总采血量仍少于175 µL，则视为采血失败。采样持续时间定义为从尾静脉穿刺开始至采血完成后拔出针头为止的时间。 - 每隔2周采集血液两次8。
3. 统计分析
- 使用市售的统计学软件进行分析。以均值 ± 标准差表示数据，以 p < 0.05 作为统计学显著性的判定阈值。
结果
两组小鼠的体重、采血量及采样时间
每组分别对20只小鼠（其中雄性10只）进行两次采血，间隔时间为2周。初学者和专家操作时，实验组与对照组小鼠的平均体重均相近（分别为42.40 g ± 1.42 g vs. 42.65 g ± 1.14 g，p > 0.05；42.55 g ± 2.91 g vs. 43.20 g ± 2.69 g，p > 0.05）。在专家操作下，两组之间的采血量和采样时间也相似（184.25 µL ± 11.95 µL vs. 171.75 µL ± 25.61 µL，p > 0.05；1.85 min ± 0.68 min vs. 2.17 min ± 0.80 min，p > 0.05）。然而，在初学者操作中，实验组的采血量更高、采样时间更短，优于对照组（172.00 µL ± 15.17 µL vs. 148.50 µL ± 30.22 µL，p < 0.01；3.11 min ± 0.44 min vs. 4.08 min ± 0.61 min，p < 0.01）。与初学者相比，专家无论采用实验方法还是传统方法，均能采集到更多的血液且耗时更短（184.25 µL ± 11.95 µL vs. 172.00 µL ± 15.17 µL，p < 0.01；171.75 µL ± 25.61 µL vs. 148.50 µL ± 30.22 µL，p < 0.05；1.85 min ± 0.68 min vs. 3.11 min ± 0.44 min，p < 0.01；2.17 min ± 0.80 min vs. 4.08 min ± 0.61 min，p < 0.05）（表1）。
两组的成功率与穿刺次数
初学者与专家在实验组的成功率比较分别为70%（14/20）与100%（20/20）（p < 0.01），在对照组分别为35%（7/20）与85%（17/20）（p < 0.01）。初学者在实验组的成功率也显著高于对照组[70%（14/20）vs. 35%（7/20），p < 0.05]。无论初学者还是专家，实验组的穿刺次数均显著低于对照组（2.40 ± 0.75 vs. 2.90 ± 0.31，p < 0.05；1.15 ± 0.37 vs. 1.55 ± 0.76，p < 0.05）。与初学者相比，专家使用实验方法和常规方法均表现出更短的穿刺时间（1.15 ± 0.37 vs. 2.40 ± 0.75，p < 0.01；1.55 ± 0.76 vs. 2.90 ± 0.31，p < 0.01）（表1）。
图 1：设备。图中显示的是 1 mL 真空采血管和 22 G 蝴蝶针（左）、眼镜式放大镜（中）以及塑料固定装置（右）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：实验组成功采血结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：对照组成功采血。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 实验组 | 对照组 | |||
| 初学者 | 专家 | 初学者 | 专家 | |
| 体重 (g) | 42.4±1.42 | 42.55±2.91 | 42.65±1.14 | 43.20±2.69 |
| 采集血量 (µL) | 172.00±15.17 | 184.25±11.95## | 148.50±30.22** | 171.75±25.61# |
| 采血持续时间 (min) | 3.11±0.44 | 1.85±0.68## | 4.08±0.61** | 2.17±0.80## |
| 采血次数 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| 平均穿刺次数 | 2.40±0.75 | 1.15±0.37## | 2.90±0.31* | 1.55±0.76##* |
| 一次穿刺成功 | 3 | 17 | 0 | 12 |
| 两次穿刺成功 | 6 | 3 | 2 | 5 |
| 三次穿刺成功 | 5 | 0 | 5 | 0 |
| 失败 | 6 | 0 | 13 | 3 |
| 成功率 | 70% | 100%## | 35%* | 85%## |
表1：实验组与对照组结果比较。 *p < 0.05，**p < 0.01，实验方法 vs. 常规方法。#p < 0.05，##p < 0.01，初学者 vs. 专家。
讨论
本研究介绍了一种易于掌握的小鼠采血方法，优于传统技术。首先，该方法容易掌握且成功率高。其次，该方法基于真空负压原理，可实现连续采血，减少直接接触血液的风险，从而降低污染和溶血的可能性9。第三，该方法可在短时间内对小鼠进行多次采血，获得足够体积的血液样本，适用于多种研究目的。此外，该操作对小鼠造成的损伤极小，且无需使用麻醉剂即可完成采血，因此可避免应激反应和麻醉剂对血液样本的影响。
根据已批准的方案，尾静脉是采血的理想部位7。然而，对于血流较少且较细的尾静脉，通常难以获得足够的血量。在此情况下，通常需要切开皮肤，再用采血针刺入静脉，或用剃刀迅速切除尾部末端。
本方案旨在改进使用真空采血系统从小鼠采集血液的方法，该方法需要真空采血管、蝶形针头和眼镜式放大镜。这种真空采血系统通常用于日常临床实践中从患者身上采集血样10。借助眼镜式放大镜，更容易定位尾静脉的最佳穿刺点。当针尖插入尾静脉后，由于负压作用，血液将自动流入真空管中。当针头从尾静脉撤出后，滞留在导管中的血液会因真空作用继续流入采血管内。
以下提示对于成功应用该方法至关重要。首先，每只小鼠的体重应达到40 g或以上，以降低穿刺难度并确保获得足够的血液量。其次，若采血失败，实验人员应尝试缓慢回撤针头，直至血液持续流出。第三，必须将小鼠尾巴充分伸展，以避免采血过程中发生移动。轻握针头有助于在小鼠尾巴活动时保持针尖位于静脉内。第四，若采血过程中血液停止流出，应及时调整针头角度。为防止针头内血液凝固，若血液停止流出超过15秒，应选择新的穿刺位置。最后，建议在使用该技术从小鼠采血时，由两名操作人员协作完成。
简而言之，小鼠采用的真空采血方法安全、可行且易于操作。该方法可在未麻醉的小鼠中频繁采集到足量的血液样本。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到中国湖北省自然科学基金项目[项目编号：2018CFB761]的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双尖针 | 上海康农医疗器械有限公司，中国 | 20163151718 | 22G (0.7 mm x 25 mm) |
| 眼镜式放大镜 | Vergroberung | 1.5倍 | |
| 小鼠正常盐饮食 | 实验期间小鼠接受正常盐饮食（0.3% NaCl）。 | ||
| 塑料固定架 | 上海康农医疗器械有限公司，中国 | 35–45 g 大鼠固定架 | |
| 用于统计分析的 SPSS 软件 | SPSS 公司，芝加哥；美国 | 版本 17.0 | |
| 注射器 | 山东威高医用高分子制品股份有限公司，中国 | 20160911A | 1 mL（匹配针头规格：0.45×16RW LB） |
| 真空采血系统 | 武汉智元医药科技有限公司，中国 | 20171222 | 1 mL (Φ12.4×L75) |
参考文献
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