基于性光谱的眼微血管蛋白质组学样品制备

摘要

眼微血管床的蛋白质组特征是深入了解人类许多眼部病理的关键。本研究展示了一种有效、快速、稳健的方法, 用于利用猪短的后睫毛动脉作为基于质谱的蛋白质组学分析的模型血管, 从小血管中提取蛋白质和制备样品。

摘要

利用体外孤立的眼血管, 用先进的技术方法破译眼睛的病理生理状态, 极大地扩大了我们对某些疾病的认识。质谱 (ms) 的蛋白质组学已成为一个强有力的工具, 以解开改变分子机制和蛋白质信号通路的血管床在健康和疾病。然而, 在 ms 分析之前的样品制备步骤对于获得可重现的结果和深入阐明复杂蛋白质组至关重要。这对于眼科微血管的制备尤其重要, 因为在眼科微血管中, 可用于分析的样品数量往往有限, 因此对最佳蛋白质提取构成了挑战。本文试图提供一个有效的, 快速和可靠的方案, 样品制备从一个示范后腰椎眼血管床使用猪短后睫毛动脉。本方法的重点是从样品的上清液和颗粒的蛋白质提取程序后, 均质化, 样品清洗前的离心过滤装置和肽纯化在液相色谱-电喷雾电离-线性离子陷阱-轨道记录 ms 系统中的无标签量化步骤。虽然这种方法是专门为眼科微血管的蛋白质组学分析开发的, 但我们也提供了令人信服的证据, 证明它也可以很容易地用于其他组织基样品。

引言

蛋白质组学领域的进步, 使综合和无与伦比的数据收集能力, 极大地改变了我们对某些疾病条件背后的分子机制的理解, 以及在反映特定细胞群或组织的生理状态^{1、2、3、4}。蛋白质组学也被证明是眼科研究的一个重要平台, 因为对不同的眼睛样本进行了敏感性和无偏见的分析, 有助于确定潜在的疾病标志物, 以便最终诊断和预后。近年来的许多研究都很有证明, 包括我们的一些^{研究 1、5、6、7}、^8、9、10.然而, 由于伦理原因, 通常很难获得用于蛋白质组学分析的人体样本, 特别是考虑到需要健康的个人提供控制材料进行可靠的比较分析。另一方面, 获得足够数量的样品以进行最佳和可靠的质谱分析也具有挑战性。这对于数量有限的生物材料, 如眼睛的微血管尤其重要。其中一个主要的反流血管, 发挥调节眼血流的关键作用是短后睫毛动脉 (scca)。这个维管床上的任何扰动或异常都可能导致严重的临床影响, 从而导致青光眼和非动脉前缺血性视神经病变 (naion)^等几种有视觉症状的疾病的发病机制11^,12. 然而, 由于上述缺点, 缺乏阐明该动脉床蛋白质组变化的研究。因此, 近年来, 由于人类和猪13之间的形态和系统发育相似性很高, 家猪 (家养林奈, 1758) 已成为眼科研究中的一个很好的动物模型 ^{。 14,15}。猪眼样本很容易获得, 最重要的是, 更准确地表示人体组织。

考虑到这些血管在眼睛中的重要作用, 以及缺乏有效提取蛋白质的方法和从这些微血管中分析的方法, 我们以前已经用内部的方法对猪 pca 的蛋白质组进行了表征。协议, 导致识别了大量的蛋白质¹⁶。在这项研究的基础上, 我们在本文中进一步优化和深入地描述了我们的方法, 允许使用猪 scca 作为模型组织从微小数量的样本中进行蛋白质组分析。尽管这项研究的主要目的是建立一个 ms 兼容的方法, 质量有限的眼血管, 我们提供了大量的实验证据, 所述的工作流程也可以广泛地适用于各种组织为基础的样本。

根据设想, 这一工作流程将有助于从少量材料中制备高质量的 ms 兼容样品, 以便进行全面的蛋白质组分析。

方案

所有使用动物样本的实验程序都是严格按照视力和眼科研究协会 (arvo) 《关于在眼科和视力研究中使用动物的声明》和机构指南进行的。这项研究是在美因茨大学医疗中心眼科进行和批准的。

请注意:猪的眼睛与视神经和眼外组织是新鲜的从当地屠宰场立即死亡。用冰凉磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 将有钙化的眼睛输送到实验室, 并立即使用。所使用的工作流的示意图概述如图 1所示。

1. 解决方案

1. 要制备 krebs-henseleit (k-h) 缓冲液, 请将下列化学品 (27.68 克氯化钠、8.4 克氯化钠_、1.4 克 kcl、1.18 克 mgso₄和0.64 克 kh_{2 po 4}) 称重为干燥清洁的 50 ml 锥形离心管和, 1.47 克的 ccl₂和8.0 克的葡萄糖进入另一个管。
   请注意:这些化学品的粉末混合物应存放在阴凉干燥的地方。cacl 2和葡萄糖粉混合物是最好的新鲜, 以防止吸收水分和聚集。
2. 要制备每个颗粒样品的200μl 萃取缓冲液 2a, 请从跨膜蛋白质提取试剂盒中混合100μl 的萃取缓冲液2和100μl 试剂 a (见材料表中的 b6)。
   请注意:将跨膜蛋白提取试剂盒的成分, 包括萃取缓冲液2、试剂 a 和蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 放入工作部分, 并储存在-20°c, 供长期使用。避免反复冻结和解冻。在颗粒提取过程开始之前, 将试剂解冻至室温 (rt)。
3. 制备碳酸氢铵 (abc, 100 mm) 溶液, 在50毫升的去离子水中溶解0.39 克。
4. 制备 10 mm 1, 4-二硫醇 (dtt) 溶液, 在 100 mabc 的20毫升中溶解30毫克的 dtt。
5. 制备 55 mm 碘乙酰胺 (iaa) 溶液, 在 100 mm abc 的20毫升中溶解200毫克 iaa。
   请注意:iaa 必须被蒙在鼓里。使用铝箔用感光溶液包裹管材。
6. 制备含有 10 mm abc 和 10% (vol/vol) 乙腈 (acn) 的胰蛋白酶缓冲液。在一个20μg 的胰蛋白酶小瓶中加入1.5 毫升的胰蛋白酶, 溶解其含量, 制备13ngμμl 胰蛋白酶的工作溶液。
   请注意:测序级改性胰蛋白酶是提供冻干的, 必须储存在-20°c, 直到使用。
7. 制备肽提取缓冲液, 将5% 甲酸的 1:2 (v2) 与 acn 混合。
   请注意:在使用前准备步骤1.3-1.7 中的所有解决方案, 并丢弃任何未使用的卷。
8. 要制备0.1% 的三氟乙酸 (tfa), 请将10μl 的 tfa 与10毫升的去离子水混合。

2. 隔弧后动脉的分离

请注意:猪眼基本上分为前段 (图 2a) 和后部 (图 2b)。

1. 将眼睛地球放置在含有冰凉 k-h 缓冲液的解剖室中。用一双锋利的梅奥剪刀小心地切断周围的肌肉和组织。
2. 用手术刀做一个切口, 用一把锋利的梅奥剪刀沿着赤道平面切割地球, 直到眼睛被分成前半和后半部。使用一对标准的花纹钳从眼睛后半部取出尽可能多的玻璃体。
   请注意:将眼睛地球分离成两半, 便于在解剖盘中没有移动的眼睛的情况下轻松隔离 scca。但是, 此步骤不是强制性的。这些船只也可以在不打开眼界的情况下被隔离。
3. 使用解剖针仔细固定眼睛的后半部分与视网膜一侧向下和视神经面向实验者。
4. 轻轻切断视神经周围的结缔组织, 用一对学生 vannas 弹簧剪刀暴露潜在的逆行血管。
5. pca 可以被看作是血管的短分支 (5-8 支之间), 穿透锁骨, 并绕着视神经头 (图 2c)。用一对5型精密推拿器和 vannas 胶囊切刀剪刀分离准视和远端 pca 以及周围的结缔组织 (图 2d)。
   请注意:确保 k-h 缓冲区在整个隔离过程中保持低温。强烈建议每20-30 更换一次缓冲液, 具体取决于环境温度。

3. 样品制备

1. 使用额外的细尖5型精密推拿器和 vannas 胶囊切刀剪刀在立体显微镜下轻轻去除动脉部分的结缔组织, 并在冰寒 pbs 中冲洗隔离动脉, 以去除污染物和血液残留物。
   请注意:如果样品没有立即受到下一步的影响, 请将其冻结在液氮中, 并储存在-80°c 中, 直到进一步使用。
2. 池动脉从两只眼睛获得一个生物复制, 他们转移到1.5 毫升的微离心管, 并使用分析天平称重样品。
3. 在每个管中加入0.5 毫米和 1.0 mm 氧化锆珠的混合物, 然后加入组织蛋白提取试剂 (t-per; 见材料表中的 b7)。
   请注意:t-per 的体积取决于每个管中样品的重量, 试剂的比例为1毫升, 样本为50毫克。加载用于均质的管道时应遵循的一般规则是 1: 1:2 = 样品: 珠子: t-per (图 3a)。不要使用过多的提取缓冲液和太少的珠子, 以防止低效的均质化。
4. 将样品管装入搅拌机均质机 (参见材料表中的 d6)。将定时器设置为 2分钟, 速度级别为 6, 并开始均质化。运行后, 检查样品是否完全同质化和重复循环, 直到样品完全同质化 (图 3b)。
   请注意:总共24个样品管可以一次进行均质化。在均质过程中保持样品的低温是很重要的, 以最大限度地减少蛋白质变性。本研究中使用的子弹搅拌机均质机具有固有的冷却特性, 可使样品保持低温。在均质机中没有内部冷却功能的情况下, 样品可以保存在每次运行之间的冰上。
5. 小心移液器均匀度, 进入新鲜的微离心管。在4°c 条件下, 以 10 , 000 x g离心样品 20分钟, 以颗粒不溶性蛋白质和分离含有可溶性蛋白质的上清液。在不接触颗粒层的情况下, 小心地将上清液移入新鲜的微离心管 (图 3c)。
   请注意:上清液和颗粒均可储存在-80°c, 直至进一步使用。

4. 颗粒消化

1. 在每个颗粒样品中加入200μl 的萃取缓冲液2a 和5μl 蛋白酶抑制剂鸡尾酒。用移液器多次悬挂颗粒。
   请注意:在加入颗粒之前, 请将提取试剂充分混合。在整个提取过程中, 在冰上保持萃取缓冲液 2a, 并在 rt 上保留蛋白酶抑制剂。
2. 使用超声波均质机完全将颗粒均质化。
   1. 将振幅设置为 60, 并将周期设置为1。使用由钛制成的探头 (直径 0.5 mm, 80 毫米长), 该探头适用于小体积 (10-500μl) 样品的均质化。
   2. 将探头浸入颗粒和萃取缓冲液混合物中, 然后按启动按钮将样品暴露在超声波中。
   3. 将样品合成, 直到颗粒团块完全均匀。在每个声音之间暂停几秒钟。
   4. 直观地检查完全同质化。将均匀度与移液器混合几次, 以确保没有团块。
      请注意:颗粒提取过程应在冰上进行, 以防止蛋白质因均匀化过程中产生的热量而变性 (图 4)。

5. 样品清洗和缓冲交换

1. 根据制造商的说明, 在适用的情况下进行修改后, 使用带有 3 kda 截止点的离心过滤装置 (请参阅材料表中的 d3)。首先, 将过滤单元插入微离心管 (提供在过滤器包中)。
2. 将样品的200μl 均匀地添加到一个过滤装置中, 并将200μl 的去离子水添加到同一过滤器中。安全地封盖 (图 5a)。
3. 将过滤装置放入离心机中, 在4°c 下旋转 14 , 000 x 克 15分钟。
4. 从离心机中取出该装置, 并将含有浓缩样品的过滤装置与含有滤液的微离心管分离。丢弃滤液 (图 5b)。
5. 通过在过滤装置中加入400μl 的去离子水, 重新合成精矿。重复步骤5.3 和5.4 三次。小心地将 "清洁" 样品集中到一个干净的微管中。
   请注意:通常情况下, 200μl 粗样品在过滤后可产生 ~ 50-70μl 的精矿。
6. 对剩余样品均质重复步骤5.1-5.5。

6. 蛋白质测量

1. 使用双链酸 (bca) 蛋白检测试剂盒 (见材料表中的 b5) 来确定板读取器上的 pca 样品上清液和颗粒组分的蛋白质浓度。
2. 根据制造商的说明, 从一个由 2 mg/ml bsa 组成的1毫升安培制备白蛋白标准 (bsa) 稀释剂 (最终 bsa 浓度范围在25至 2, 000μg/ml 之间)。
3. 每个 bsa 标准稀释和样品的移液器10μl 复制到96孔平底微板的每个井中。
4. 通过将 bca 试剂 a 添加到 bca 试剂 b 的1个部分来制备 bca 工作试剂。
   请注意:在制备之前计算每次测量所需的工作试剂的总量, 并根据要检测的样品数量和标准稀释量重新准备足够的体积。
5. 小心将 bca 工作试剂输送到每口井200μl。覆盖微板, 在37°c 孵育30分钟。冷却板冷却到 rt 后, 测量板读取器上 562 nm 的吸收率 (请参见材料表中的 d13)。
6. 根据为每个 bsa 标准浓度 (μg/ml) 生成的标准曲线, 确定样品的蛋白质浓度。

7. 一维凝胶电泳 (1de)

1. 如表 1所示 (对于一个样品), 为1de 准备样品。将样品混合物与移液器很好地混合。在70°c 下加热样品 15分钟, 冷却至 rt。
2. 在950毫升去离子水中加入50毫升 mes sds 运行缓冲器, 准备1x 运行缓冲器。混合好。
3. 制备前4-12 的 bis-tris 蛋白凝胶 (见材料表中的 b4)。
   1. 切开塑料袋, 取出凝胶盒, 用去离子水冲洗盒。
   2. 在一次流体运动中取出凝胶盒中的梳子, 注意不要损坏水井。
   3. 用液器用1x 运行缓冲器轻轻冲洗装载井2-3 次。反转并轻轻摇晃凝胶盒, 以去除缓冲液, 确保井内没有气泡。
   4. 取下凝胶盒底部的白色胶带。
4. 将凝胶 (最多两个盒式磁带) 插入凝胶运行槽中, 一旦完全组装, 锁定凝胶张力楔子。
5. 用200毫升的运行缓冲器填充上 (阴极) 缓冲室, 直到井完全覆盖。检查是否有任何泄漏。
6. 在运行缓冲区中添加500μl 的抗氧化剂 (请参阅材料表中的 a14)。
   请注意:该抗氧化剂是一种适当的试剂, 必须与还原剂还原样品一起使用 (见表 1), 以维持电泳过程中的还原条件, 并防止色氨酸和蛋 氨 酸。
7. 使用移液器在每个车道上小心地加载50微克的样品。然后, 加载预染色蛋白标准作为分子质量标记 (见材料表中的 a18)。
8. 用600毫升的运行缓冲器填充较低的 (阳极) 缓冲室。
9. 在 175 v 的恒定电压下运行凝胶约60分钟。跑步结束时, 用凝胶刀小心地从盒式磁带板上取出凝胶。
10. 小心地将凝胶转移到凝胶染色盒中。
    1. 根据制造商的说明, 根据制造商的说明, 根据制造商的说明, 根据需要染色的凝胶总数, 准备新的固定解决方案。
    2. 在一个摇摆平台上的 rt 上, 在固定溶液中摇匀10分钟。
11. 丢弃固定溶液, 并用胶体蓝染色试剂盒对凝胶进行染色。
    1. 根据制造商的说明, 根据表 3中所述的制造商的说明, 根据需要染色的凝胶总数, 准备新鲜的染色解决方案。
    2. 首先, 测量适当的体积, 并直接混合凝胶染色盒中标有星号 (*) 的成分。在一个摇摆平台上的 rt 上, 在没有染色程序 b 的情况下, 在没有染色程序 b 的情况下摇匀染色溶液中的凝胶10分钟。
    3. 将染色 b 直接添加到包含 * 染色溶液的染色盒中。请务必在使用前很好地摇晃不锈钢 b。
       注意事项:7.10.1 和7.11.1 在烟罩下进行准备步骤。
12. 隔夜摇晃染色溶液中的凝胶, 以获得最佳的整体效果。
    请注意:染色带将在添加染色程序 b 后10分钟内显现, 染色带至少需要 3小时, 如果在染色溶液中留长时间, 强度不会发生变化。
13. 小心地装饰染色液, 并更换200毫升的去离子水。在水中晃动凝胶至少 7-8, 以清除背景。
    请注意:在脱粒过程中, 必须多次更换脱水, 以更好地去除过多的污渍。凝胶也可以在水中保留长达 3天, 而不会影响蛋白质带强度。如果凝胶没有立即受到下一步的影响, 它可以在4°c 的20% 硫酸铵溶液中储存, 以便长期储存。

8. 凝胶胰蛋白酶消化

请注意:该协议是根据 shevchenko 等人的方法进行的,略作修改。此过程应在层流罩中进行, 并专门为此目的使用一套专用的移液器、吸头、管道和玻璃器皿。在任何时候都要戴上手套和适当的实验室服装, 以防止角蛋白和其他污染。在使用前不久准备好此过程中使用的所有解决方案和试剂。

1. 用干净的新型微孔刀片从凝胶中清除蛋白质带。将带切成小块 (约1毫米 x 1 毫米至2毫米 x 2 毫米)。小心地将凝胶片转移到 1.5 ml 的微离心管中。
   请注意:太小的碎片可能会堵塞移液器的尖端, 较大的碎片会减少肽的恢复。使用非常锋利的微孔刀片时要小心。
2. 德尽置
   1. 加入含有 100 mm abc 溶液的500μl 的去落液, 并在 rt 孵育样品 30分钟, 偶尔晃动或涡流。
   2. 小心地移液出减压溶液。目视检查是否有残留污渍的管子。如果凝胶片仍被染成蓝色, 请重复步骤8.2.1。
3. 还原和烷基化
   1. 加入 ~ 400μl 的新鲜制备的 dtt 溶液, 在56°c 孵育 30分钟. 确保溶液完全覆盖凝胶件。小心地移液液, 然后丢弃。
   2. 加入 ~ 400μl 的新鲜制备的 iaa 溶液, 在 rt 黑暗中孵育 30分钟. 用移液器取出烷基化缓冲液并丢弃。
4. 消化
   1. 在 rt 处添加500μl 的整洁 acn, 时间为 10-15, 直到凝胶片收缩并变得不透明。移液器出来的 acn 和空气干燥凝胶件5-10 引擎盖下。
   2. 将液相50μl 的胰蛋白酶溶液放入每个管中, 将凝胶片完全覆盖。在4°c 中将管材取出30分钟。
   3. 30分钟后, 检查每个管是否所有胰蛋白酶溶液都被凝胶片吸收。如有必要, 添加足够体积的胰蛋白酶缓冲液 (50-100μl, 具体取决于管内的体积), 以完全覆盖凝胶片。在37°c 下隔夜培养样品。
5. 多肽提取
   1. 小心移液从试管中提取的肽溶液, 并转移到清洁微管。在离心真空蒸发器中干燥上清液。
      请注意:不要丢弃剩余的凝胶件。
   2. 在每个试管中加入100μl 的萃取缓冲液 (参见步骤 1.7), 在37°c 下孵育 30分钟, 并在晃动的情况下孵育。
   3. 将上清液移入含有所提取肽的相同微管中, 并在真空离心机中干燥。
      请注意:如果不立即使用, 干肽提取物可以存储在-20°c, 直到几个月, 直到进一步使用。

9. 多肽的纯化

请注意:这种肽样品的脱盐和纯化过程是使用 c18 移液器吸头进行的 (见材料表中的 c15)。对每个样本使用新的提示。

1. 准备以下溶液新鲜的锥形离心管和脂肪到2毫升微离心管的肽纯化程序, 如表 4所示。多肽纯化管的摘要如下: 管 a (样品溶液)、管 b (润湿溶液)、管 c (平衡溶液)、管 d (洗涤溶液)、管 e (洗脱溶液)、管 f (空 2 ml 或 5 ml 微离心管, 取决于要清洗的样品数量, 用于废物处理) 和管 g (清洁, 空微管, 容量0.2 毫升)。
2. 用 10μl 0.1% tfa 重新8.6.3 的干肽提取物。这根管子被指定为 a 管。
3. 在加冰的超声波浴池中使用超声管 a 5分钟。
4. 在 1, 000 x克的台式离心机中旋转样品溶液1分钟。
5. 将 p10 微型移液器设置为10μl 的最大体积设置, 并安全地连接 c18 移液器尖端。
6. 将移液器尖端浸入润湿溶液 (管 b) 中, 并小心地吸入包装材料中。慢慢地将废物放入管道 f 中, 重复此步骤至少7-8 次。
   请注意:将移液器柱塞按下死角, 在整个过程中慢慢释放或分配柱塞。请注意, 在移液过程中, 不要将气泡引入吸头, 以确保最大程度的肽与 c18 柱结合。
7. 通过在管内吸气10μl 平衡溶液, 平衡肽结合的尖端, 放弃该溶液, 并重复此过程3至4次。
8. 接下来, 在 a 管中抽吸和分配样品溶液几次 (取决于相应的凝胶带厚度), 将肽与尖端柱结合。
   注意事项:结合过程中的抽吸和分配步骤 (步骤 9.8) 在 a 管内进行。不要将样品溶液分发给废物。
9. 将 c₁₈移液器尖端洗净, 方法是在 d 管中吸气清洗溶液, 并将其丢弃到废物 (管 f) 4 至5次。
10. 最后, 通过将洗脱溶液 (管 e) 移液并将洗脱液分配到管 g 来洗脱结合的肽。
11. 重复每个样品的整个步骤2至3个周期, 以提高样品的回收率。
12. 在一个样品纯化后丢弃提示, 并为下一个样品使用新的尖端。
13. 在真空集中器中干燥纯化后的肽。
    请注意:纯化后的样品现已准备就绪, 可用于 lc-esi-ltq-orbitrabjms 系统中的 lc-mmsms 分析。将干燥的样品存放在-20°c, 直至进一步使用。

10. 液体色谱-电喷雾离子-msm 分析

请注意:在液体色谱-电喷雾电离-线性离子陷阱-轨道陷阱 (lc-esi-ltq-orbitrap) ms 系统上进行无标签定量蛋白质组学分析。lc 由带有在线脱气器的 rheos allegro 四元泵组成 (耦合到 hts pal 自动采样器, 该系统包括连接到150毫米 x 0.5 mm c 18 柱的30毫米 x 0.5 mm c₁₈柱.采用反向相水溶液 a, 由 lc-ms 级水和0.1% 甲酸 (v/v) 和有机溶剂 b 组成, 由 lc-ms 级乙腈与 0.1% (v/v) 甲酸组成。使用每个凝胶带60分钟的运行时间的渐变, 如我们以前的研究^6,16中详细介绍的那样。

1. 将纯化后的肽样品溶解在10μl 的 0.1% tfa 中。将样品在冰上取样5分钟。
2. 移液器10μl 样品进入 v 底部96孔板, 并密封用透明的、不干胶的盖膜。
3. 将板材转移到自动采样器。
4. 每次运行时间 60分钟, 请使用以下渐变: 0-35 (15-40 溶剂 b)、35-40分钟 (40-60% 溶剂 b)、40-45分钟 (60-90% 溶剂 b)、45-50分钟 (90% 溶剂 b)、50-53 (90% 溶剂 b) 和 53-60分钟 (10% 溶剂 b)。
5. 使用仪器的以下质谱条件: 正离子电喷雾电离模式、喷雾电压 (2.15 kv)、毛细管温度 (220°c)、数据相关采集模式、orbitrap-ms 和ltq m/z, 轨道说唱分辨率 (30, 000), m/z 范围 (300 至 1, 600), 目标自动增益控制 (agc, 1.0 x 10^{6 离子}), 内部重新校准 (多二甲基环硅氧烷 [pcm] 在 m/z 441 5.1 20025 离子的实时), 在 ms 模式下启用锁定质量选项,通过选择前五个最强烈的前体离子、碰撞诱导的离解 (cid) 进一步碎裂、归一化碰撞能量 (nce)、激活时间为30毫秒、重复计数为3的 35%) 和动态排除持续时间获得串联数据(600秒)。
   请注意:由此产生的碎片离子记录在 ltq 中。
6. 为每个样本运行至少三个生物副本。

结果

样本有限是眼科研究的主要缺陷之一。相应地, 从少量样本 (如眼睛血管) 中提取最佳蛋白质产量的方法也常常值得商榷。到目前为止, 特别是从反疣血管中提取蛋白质的方法很少。因此, 作为方法优化的第一步, 并作为一项原则证明, 将几种常用的蛋白质提取剂的疗效和鲁棒性与相对较新的试剂 t-per 进行了试点研究, 并利用心脏组织进行了研究小鼠的情况 (由于优化步骤的样品可用性很高)。我们通过比较使用以下试剂确定的总蛋白质浓度和总蛋白质来比较蛋白质的产量: t-per, 0.02% 正十二烷基β-d-麦芽苷 (ddm), 1%-[(3-胆基丙基)-二甲基氨酸]-1-丙烷磺酸盐 (chaps),1% 氨基磺胺酶-14 (asb-14) 和 acn 和 tfa 的混合物 (20% acna/1% tfa)。用每种洗涤剂提取的样品中的蛋白质总量如图 6a所示, 从用 t-per (50.4μgmg 组织) 提取的组织中提取的蛋白质总产量最高, 其次是 ddm (22.88 微克/毛组织)、cha...

讨论

对各种眼样本进行全面的蛋白质组分析是阐明健康和疾病中涉及的分子机制和信号通路的重要和不可或缺的第一步。为了获得高质量的数据并确保从这些分析中获得的结果的重现性, 前面的样品制备步骤至关重要, manal 等人在深入讨论样品处理程序的审查中强调了这一点。对于眼睛的不同部位采用二维凝胶电泳和质谱^{策略 1}。在这些研究中, 我们目前的研究提供了一个优化的逐步协议, 使用猪 spca 作为模型眼微血管进行快速、可靠和高效的 ms 兼容样品制备。这项研究是在缺乏从数量有限的动脉样本中提取足够数量的蛋白质以产生高质量的 ms 数据的特定方法之后开始的。我们的方法也是一个努力, 以促进现有的知识, 使用微尺度技术, 使优秀的蛋白质组映射¹⁸。

在这个实验协议中, 有几个关键的方面需要考虑, 以获得定量蛋白质组分析的最佳性能。首先, 重要的是, 样品, 无论数量, 都要进行完全的同质化, 以确保最佳的蛋白质提取。在我们的方法中, 使用不同尺寸的珠子和子弹搅拌机均质机的混合物有助于完全的组织裂解。所使用的珠...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>A. 化学品
1,4-二硫苏糖醇 （DTT）	Sigma-Aldrich	1.11474
氯化钙二水合物 （CaCl2）	卡尔·罗斯	5239.1	2.5 毫米
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	赛默飞世尔科技	14190169
甲酸 （CH2O2）	AppliChem	A0748
HPLC 级乙腈（ACN，C2H3N）	AppliChem	A1605
HPLC 级甲醇 （CH3OH）	Fisher Scientific	M/4056/17
HPLC 级水	AppliChem	A1589
碘乙酰胺 （IAA）	Sigma-Aldrich	I6125
氯化钾 （KCl）	卡尔·罗斯	6781.1	4.7 毫米
磷酸二氢钾 （KH2PO4）	卡尔·罗斯	3904.2	1.2 毫米
LC-MS 级乙酸	卡尔·罗斯	AE69.1
硫酸镁 （MgSO4）	卡尔·罗斯	261.2	1.2 毫米
NuPAGE 抗氧化剂	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）	NP0005
NuPAGE LDS 样品缓冲液	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）	NP0007	4x
NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）	NP0002	20x
NuPAGE 样品还原剂	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）	NP0004	10x
SeeBlue Plus2 预染蛋白质标准品	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）	LC5925
测序级改良胰蛋白酶	Promega	V5111
氯化钠 （NaCl）	卡尔·罗斯	9265.2	118.3 毫米
碳酸氢钠 （NaHCO3）	卡尔·罗斯	965.3	25 毫米
三氟乙酸 （TFA， C2HF3O2）	默克米利波	尔108178
&α;-（D）-（+）- 葡萄糖一水合	卡尔·罗斯	6780.1	11 毫米
B 试剂和试剂盒
0.5 mm 氧化锆珠	Next Advance	ZROB05
1.0 mm 氧化锆珠	Next Advance	ZROB10
胶体蓝染色 试剂盒	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）	LC6025	每试剂盒可染色 25 块小型凝胶
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri 凝胶	Thermo Fisher Scientific （Invitrogen NP0321BOX		1.0 mm， 10 孔
Pierce 二辛可宁酸 （BCA） 蛋白检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23227
ProteoExtract 跨膜蛋白提取试剂盒，TM-PEK	Merck Millipore	71772-3	每试剂盒 20 次反应
组织蛋白提取试剂 （T-PER）	Thermo Scientific	78510
C. 工具
96 孔 V 型底板	Greiner Bio-One	651180
康宁 96 孔平底板	Sigma-Aldrich	CLS3595-50EA
一次性切片机刀片	pfm 医用	207500014
一次性手术刀 #21	pfm 医用	200130021
解剖针	Carl Roth	PK47.1
超细波恩剪刀	Fine Science Tools	14084-08
Falcon锥形离心管（50毫升）	Fisher Scientific	14-432-22
奥剪刀，坚韧剪裁	精细科学工具	14130-17
精密镊子	Fine Science Tools	11251-10	5型
精密镊子，直型，带超细尖端	Carl Roth	LH53.1	5型
微孔板自粘密封膜	Ratiolab （vWR）	RATI6018412
标准图案镊子	精细科学工具	11000-12
学生Vannas弹簧剪刀	精细科学工具	91501-09
Vannas 囊切开剪刀	Geuder	19760	直型，77 mm
ZipTipC18移液器吸头	Merck Millipore	ZTC18S096
D. 设备和装置
150 & 次 0.5 mm BioBasic C18 色谱柱	Thermo Scientific，美国罗克福德	72105-150565
30 &次; 0.5 mm BioBasic C18 预柱	Thermo Scientific，罗克福德，美国	72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K 离心过滤器设备	Merck Millipore	UFC500396	包 96 个。
	Sartorius	H51
自动进样器分析天平	CTC Analytics AG，瑞士茨温根	HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm	Next Advance	NA-BB-25
Eppendorf 浓缩仪，型号 5301	Sigma-Aldrich	Z368172
Eppendorf 微量离心机，型号 5424	Fisher Scientific	05-403-93	非冷冻
Heraeus Primo R 离心机	Thermo Scientific	75005440	冷冻
Labsonic M 超声波均质器	Sartorius	BBI-8535027
LC-MS 泵，型号 Rheos Allegro	Thermo Scientific，美国罗克福德	22080
LTQ Orbitrap XL 质谱仪	Thermo Scientific，德国
Multiskan Ascent 微孔板检测仪	Thermo Labsystems	v2.6
旋转器带涡流	neoLab	7-0045
钛探头（Ø 0.5 mm，80 mm 长）	Sartorius	BBI-8535612
超声波浴，RK 31 型	Bandelin	329
Xcell Surelock Mini Cell	Life Technologies	El0001