方法文章

基于性光谱的眼微血管蛋白质组学样品制备

DOI：

10.3791/59140

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2019年2月22日

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1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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眼微血管床的蛋白质组特征是深入了解人类许多眼部病理的关键。本研究展示了一种有效、快速、稳健的方法, 用于利用猪短的后睫毛动脉作为基于质谱的蛋白质组学分析的模型血管, 从小血管中提取蛋白质和制备样品。

摘要

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利用体外孤立的眼血管, 用先进的技术方法破译眼睛的病理生理状态, 极大地扩大了我们对某些疾病的认识。质谱 (ms) 的蛋白质组学已成为一个强有力的工具, 以解开改变分子机制和蛋白质信号通路的血管床在健康和疾病。然而, 在 ms 分析之前的样品制备步骤对于获得可重现的结果和深入阐明复杂蛋白质组至关重要。这对于眼科微血管的制备尤其重要, 因为在眼科微血管中, 可用于分析的样品数量往往有限, 因此对最佳蛋白质提取构成了挑战。本文试图提供一个有效的, 快速和可靠的方案, 样品制备从一个示范后腰椎眼血管床使用猪短后睫毛动脉。本方法的重点是从样品的上清液和颗粒的蛋白质提取程序后, 均质化, 样品清洗前的离心过滤装置和肽纯化在液相色谱-电喷雾电离-线性离子陷阱-轨道记录 ms 系统中的无标签量化步骤。虽然这种方法是专门为眼科微血管的蛋白质组学分析开发的, 但我们也提供了令人信服的证据, 证明它也可以很容易地用于其他组织基样品。

引言

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蛋白质组学领域的进步, 使综合和无与伦比的数据收集能力, 极大地改变了我们对某些疾病条件背后的分子机制的理解, 以及在反映特定细胞群或组织的生理状态1、2、3、4。蛋白质组学也被证明是眼科研究的一个重要平台, 因为对不同的眼睛样本进行了敏感性和无偏见的分析, 有助于确定潜在的疾病标志物, 以便最终诊断和预后。近年来的许多研究都很有证明, 包括我们的一些研究 1、5、6、7、8、9、10.然而, 由于伦理原因, 通常很难获得用于蛋白质组学分析的人体样本, 特别是考虑到需要健康的个人提供控制材料进行可靠的比较分析。另一方面, 获得足够数量的样品以进行最佳和可靠的质谱分析也具有挑战性。这对于数量有限的生物材料, 如眼睛的微血....

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方案

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所有使用动物样本的实验程序都是严格按照视力和眼科研究协会 (arvo) 《关于在眼科和视力研究中使用动物的声明》和机构指南进行的。这项研究是在美因茨大学医疗中心眼科进行和批准的。

请注意:猪的眼睛与视神经和眼外组织是新鲜的从当地屠宰场立即死亡。用冰凉磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 将有钙化的眼睛输送到实验室, 并立即使用。所使用的工作流的示意图概述如图 1所示。

1. 解决方案

  1. 要制备 krebs-henseleit (k-h) 缓冲液, 请将下列化学品 (27.68 克氯化钠、8.4 克氯化钠、1.4 克 kcl、1.18 克 mgso4和0.64 克 kh2 po 4) 称重为干燥清洁的 50 ml 锥形离心管和, 1.47 克的 ccl2和8.0 克的葡萄糖进入另一个管。
    请注意:这些化学品的粉末混合物应存放在阴凉干燥的地方。cacl 2和葡萄糖粉混合物是最好的新鲜, 以防止吸收水分和聚集。
  2. 要制备每个颗粒样品的200μl 萃取缓冲液 2a, 请从跨膜蛋白质提取试剂盒中混合100μl 的萃取缓冲液2和100μl 试剂 ....

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结果

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样本有限是眼科研究的主要缺陷之一。相应地, 从少量样本 (如眼睛血管) 中提取最佳蛋白质产量的方法也常常值得商榷。到目前为止, 特别是从反疣血管中提取蛋白质的方法很少。因此, 作为方法优化的第一步, 并作为一项原则证明, 将几种常用的蛋白质提取剂的疗效和鲁棒性与相对较新的试剂 t-per 进行了试点研究, 并利用心脏组织进行了研究小鼠的情况 (由于优化步骤的样品可用性很高)。我们通过比较使用以下试剂确定的总蛋白质浓度和总蛋白质来比较蛋白质的产量: t-per, 0.02% 正十二烷基β-d-麦芽苷 (ddm), 1%-[(3-胆基丙基)-二甲基氨酸]-1-丙烷磺酸盐 (chaps),1% 氨基磺胺酶-14 (asb-14) 和 acn 和 tfa 的混合物 (20% acna/1% tfa)。用每种洗涤剂提取的样品中的蛋白质总量如图 6a所示, 从用 t-per (50.4μgmg 组织) 提取的组织中提取的蛋白质总产量最高, 其次是 ddm (22.88 微克/毛组织)、cha.......

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讨论

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对各种眼样本进行全面的蛋白质组分析是阐明健康和疾病中涉及的分子机制和信号通路的重要和不可或缺的第一步。为了获得高质量的数据并确保从这些分析中获得的结果的重现性, 前面的样品制备步骤至关重要, manal 等人在深入讨论样品处理程序的审查中强调了这一点。对于眼睛的不同部位采用二维凝胶电泳和质谱策略 1。在这些研究中, 我们目前的研究提供了一个优化的逐步协议, 使用猪 spca 作为模型眼微血管进行快速、可靠和高效的 ms 兼容样品制备。这项研究是在缺乏从数量有限的动脉样本中提取足够数量的蛋白质以产生高质量的 ms 数据的特定方法之后开始的。我们的方法也是一个努力, 以促进现有的知识, 使用微尺度技术, 使优秀的蛋白质组映射18。

在这个实验协议中, 有几个关键的方面需要考虑, 以获得定量蛋白质组分析的最佳性能。首先, 重要的是, 样品, 无论数量, 都要进行完全的同质化, 以确保最佳的蛋白质提取。在我们的方法中, 使用不同尺寸的珠子和子弹搅拌机均质机的混合物有助于完全的组织裂解。所使用的珠.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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manicam 博士得到了美因法约翰内斯古腾堡大学医学中心的内部大学研究资助 (stufe 1) 和德国 mforschungsgemeinschaft 的资助 (ma 800 6/1-1) 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>A. 化学品
1,4-二硫苏糖醇 （DTT）Sigma-Aldrich1.11474
氯化钙二水合物 （CaCl2）  卡尔·罗斯 5239.12.5 毫米 
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 赛默飞世尔科技14190169
甲酸 （CH2O2）AppliChemA0748
HPLC 级乙腈（ACN，C2H3N）AppliChemA1605
HPLC 级甲醇 （CH3OH）Fisher ScientificM/4056/17
HPLC 级水 AppliChemA1589
碘乙酰胺 （IAA）Sigma-AldrichI6125
氯化钾 （KCl）  卡尔·罗斯 6781.14.7 毫米 
磷酸二氢钾 （KH2PO4） 卡尔·罗斯 3904.21.2 毫米 
LC-MS 级乙酸 卡尔·罗斯 AE69.1
硫酸镁 （MgSO4）   卡尔·罗斯 261.21.2 毫米 
NuPAGE 抗氧化剂Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）NP0005
NuPAGE LDS 样品缓冲液 Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）NP00074x
NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）NP000220x
NuPAGE 样品还原剂 Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）NP000410x
SeeBlue Plus2 预染蛋白质标准品 Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）LC5925
测序级改良胰蛋白酶PromegaV5111
氯化钠 （NaCl） 卡尔·罗斯 9265.2118.3 毫米 
碳酸氢钠 （NaHCO3） 卡尔·罗斯 965.325 毫米 
三氟乙酸 （TFA， C2HF3O2）默克米利波尔108178
&α;-（D）-（+）- 葡萄糖一水合 卡尔·罗斯 6780.111 毫米 
B 试剂和试剂盒
0.5 mm 氧化锆珠 Next AdvanceZROB05
1.0 mm 氧化锆珠 Next AdvanceZROB10
胶体蓝染色 试剂盒Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）LC6025每试剂盒可染色 25 块小型凝胶
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri 凝胶Thermo Fisher Scientific （Invitrogen NP0321BOX1.0 mm， 10 孔
Pierce 二辛可宁酸 （BCA） 蛋白检测试剂盒 Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract 跨膜蛋白提取试剂盒，TM-PEKMerck Millipore71772-3每试剂盒 20 次反应
组织蛋白提取试剂 （T-PER）Thermo Scientific78510
C. 工具
96 孔 V 型底板Greiner Bio-One651180
康宁 96 孔平底板Sigma-AldrichCLS3595-50EA
一次性切片机刀片pfm 医用207500014
一次性手术刀 #21pfm 医用200130021
解剖针 Carl RothPK47.1
超细波恩剪刀 Fine Science Tools14084-08
Falcon锥形离心管（50毫升）Fisher Scientific14-432-22
奥剪刀，坚韧剪裁 精细科学工具14130-17
精密镊子 Fine Science Tools11251-105型
精密镊子，直型，带超细尖端Carl RothLH53.15型
微孔板自粘密封膜Ratiolab （vWR）RATI6018412
标准图案镊子 精细科学工具11000-12
学生Vannas弹簧剪刀 精细科学工具91501-09
Vannas 囊切开剪刀  Geuder19760 直型，77 mm
ZipTipC18移液器吸头Merck MilliporeZTC18S096
D. 设备和装置
150 & 次 0.5 mm BioBasic C18 色谱柱Thermo Scientific，美国罗克福德72105-150565
30 &次; 0.5 mm BioBasic C18 预柱 Thermo Scientific，罗克福德，美国72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K 离心过滤器设备 Merck MilliporeUFC500396包 96 个。
SartoriusH51
自动进样器分析天平 CTC Analytics AG，瑞士茨温根HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Eppendorf 浓缩仪，型号 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf 微量离心机，型号 5424Fisher Scientific05-403-93非冷冻
Heraeus Primo R 离心机Thermo Scientific75005440冷冻
Labsonic M 超声波均质器 SartoriusBBI-8535027
LC-MS 泵，型号 Rheos AllegroThermo Scientific，美国罗克福德22080
LTQ Orbitrap XL 质谱仪 Thermo Scientific，德国
Multiskan Ascent 微孔板检测仪 Thermo Labsystemsv2.6
旋转器带涡流 neoLab7-0045
钛探头（Ø 0.5 mm，80 mm 长）SartoriusBBI-8535612
超声波浴，RK 31 型Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001
物梅不来梅

参考文献

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  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down....

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