眼微血管床的蛋白质组表征对于深入理解人类多种眼病具有重要意义。本研究展示了一种高效、快速且稳健的方法，用于从小血管中提取蛋白质并进行样品制备，以开展基于质谱的蛋白质组学分析，采用猪短后睫状动脉作为模型血管。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
利用体外分离的眼部血管，结合先进的技术手段来解析眼部的病理生理状态，极大地加深了我们对某些疾病的认识。基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为揭示健康与疾病状态下血管床中分子机制及蛋白质信号通路变化的有力工具。然而，在质谱分析前的样品制备步骤对于获得可重复的结果以及深入解析复杂的蛋白质组至关重要。这对于眼部微血管样品的制备尤为重要，因为可用于分析的样品量通常十分有限，从而给高效的蛋白质提取带来了挑战。本文旨在提供一种高效、快速且稳健的样品制备方案，以猪短后睫状动脉为代表的眶后眼部血管床为示例材料。本方法重点包括组织匀浆后从样品上清和沉淀中提取蛋白质的操作，使用离心滤膜装置进行样品净化，随后进行一维凝胶电泳及肽段纯化步骤，最终实现液相色谱-电喷雾电离-线性离子阱-Orbitrap质谱系统中的非标记定量分析。尽管该方法是专为眼部微血管的蛋白质组学分析而开发，但我们亦提供了充分证据表明，该方法亦可便捷地应用于其他基于组织的样品。
引言
蛋白质组学领域的进步使得整合且无与伦比的数据采集能力成为可能，极大地革新了我们对某些疾病状态下分子机制的理解，同时也反映了特定细胞群体或组织的生理状态1,2,3,4。由于其对不同类型眼部样本具有高灵敏度和无偏倚的分析能力，蛋白质组学已被证明是眼科研究中的一个重要平台，有助于识别潜在的疾病标志物，从而实现最终的诊断与预后评估；近年来许多研究（包括我们的一些研究）已对此提供了有力证据1,5,6,7,8,9,10。然而，由于伦理原因，通常难以获取用于蛋白质组学分析的人体样本，尤其是在需要来自健康个体的对照材料以进行可靠比较分析的情况下。另一方面，获得足量样本以进行最佳且可靠的质谱分析也具有挑战性。这对于眼内微小血管等生物样本量受限的材料尤为关键。其中一条在调控眼部血流中起关键作用的主要眶后血管是短后睫状动脉（sPCA）。该血管床的任何扰动或异常都可能导致严重的临床后果，进而引发多种威胁视力的疾病，如青光眼和非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）11,12。然而，由于上述限制，目前尚缺乏阐明该动脉床蛋白质组变化的研究。因此，近年来家猪（Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758）因其在形态学和系统发育上与人类的高度相似性，已成为眼科研究中一种良好的动物模型13,14,15。猪的眼部样本易于获取，且最重要的是，其组织更接近于人类组织的真实情况。
鉴于这些眼内血管的重要作用，以及目前尚缺乏针对这些微血管进行高效蛋白质提取与分析的方法，我们此前已利用自行建立的实验方案对猪sPCA的蛋白质组进行了表征，并成功鉴定了大量蛋白质16。在此研究基础上，本文进一步优化并深入描述了该方法，使其能够利用微量样本进行蛋白质组分析，并以猪sPCA作为模型组织。尽管本研究的主要目标是建立一种适用于样本量受限的眼部血管、且与质谱兼容的实验方法，但我们已提供充分的实验证据，表明所描述的工作流程亦可广泛应用于多种基于组织的样本。
预计该工作流程将有助于从小量材料中制备高质量的质谱兼容样品，用于全面的蛋白质组分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有使用动物样本的实验操作均严格遵循眼科与视觉研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及机构指南。本研究在美因茨大学医学中心眼科系进行，并获得批准。
注意：猪眼连同视神经和眼外组织在动物宰杀后立即从当地屠宰场新鲜获取。摘除的眼球置于冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中运送到实验室，并立即使用。所采用工作流程的示意图如图1所示。
1. 溶液
- 配制 Krebs-Henseleit (K-H) 缓冲液时，将以下化学试剂称量至一个干燥洁净的 50 mL 锥形离心管中：27.68 g NaCl、8.4 g NaHCO3、1.4 g KCl、1.18 g MgSO4 和 0.64 g KH2PO4；另取一管加入 1.47 g CaCl2 和 8.0 g 葡萄糖。
注意：这些化学试剂的粉末混合物应储存在阴凉干燥处。CaCl2 与葡萄糖的粉末混合物建议现配，以防止吸潮结块。 - 为每份沉淀样品配制 200 µL 提取缓冲液 2A，需将 100 µL 提取缓冲液 2 与 100 µL 跨膜蛋白提取试剂盒中的试剂 A 混合（参见材料表中的 B6）。
注意：将跨膜蛋白提取试剂盒中的提取缓冲液 2、试剂 A 和蛋白酶抑制剂混合液分装成工作用量，于 -20 °C 保存以长期使用。避免反复冻融。在开始沉淀提取程序前，将试剂解冻至室温（RT）。 - 配制 100 mM 碳酸氢铵（ABC）溶液：将 0.39 g ABC 溶解于 50 mL 去离子水中。
- 配制 10 mM 1,4-二硫苏糖醇（DTT）溶液：将 30 mg DTT 溶解于 20 mL 100 mM ABC 溶液中。
- 配制 55 mM 碘乙酰胺（IAA）溶液：将 200 mg IAA 溶解于 20 mL 100 mM ABC 溶液中。
注意：IAA 必须避光保存。使用铝箔包裹含有光敏溶液的离心管。 - 配制含 10 mM ABC 和 10%（体积/体积）乙腈（ACN）的胰蛋白酶缓冲液。向一支含有 20 µg 胰蛋白酶的西林瓶中加入 1.5 mL 胰蛋白酶缓冲液，溶解后配制成浓度为 13 ng/µL 的胰蛋白酶工作液。
注意：测序级修饰胰蛋白酶为冻干粉形式，需在 -20 °C 保存直至使用。 - 配制肽段提取缓冲液：将 5% 甲酸与 ACN 按 1:2（v/v）比例混合。
注意：步骤 1.3–1.7 中所有溶液均需在使用前新鲜配制，并丢弃任何未用完的剩余溶液。 - 配制 0.1% 三氟乙酸（TFA）溶液：将 10 µL TFA 与 10 mL 去离子水混合。
2. 短后睫状动脉的分离
注意： 猪眼基本分为前部（图2A）和后部（图2B）。
- 将眼球置于含有冰冻K-H缓冲液的解剖皿中。使用一对锋利的Mayo剪刀小心剪除周围肌肉和组织。
- 用手术刀做切口，再用锋利的Mayo剪刀沿赤道平面剪开眼球，直至将眼球分为前半部和后半部。使用标准型镊子尽可能去除眼球后半部的玻璃体。
注意：将眼球分为两半有助于更方便地分离短后睫状动脉（sPCA），避免解剖过程中眼球移动。但此步骤并非必需，也可在不切开眼球的情况下进行血管分离。 - 使用解剖针将眼球后半部固定，使视网膜面朝下，视神经朝上面对实验操作者。
- 用学生型Vannas弹簧剪刀轻轻剪除视神经周围的结缔组织，以暴露其下方的球后血管系统。
- 短后睫状动脉（sPCA）可见为数条短分支血管（通常为5–8条分支），穿入巩膜并环绕视神经乳头呈环状分布（图2C）。使用5号精密镊子和Vannas囊膜剪刀，连同周围结缔组织一起分离视神经旁及远端的sPCA（图2D）。
注意：在整个分离过程中，务必保持K-H缓冲液处于冰冻状态。建议根据环境温度每20–30分钟更换一次缓冲液。
3. 样品制备
- 在体视显微镜下，使用超细尖头5号精密镊子和Vannas囊膜剪轻轻去除动脉段的结缔组织，并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗分离的动脉，以去除污染物和血液残留物。
注意：如果样品不能立即进行后续步骤，应将其在液氮中速冻，并储存于-80 °C，直至进一步使用。 - 将来自两只眼睛的动脉合并，以获得一个生物学重复样本，转移至1.5 mL微量离心管中，并使用分析天平称量样品。
- 向每根离心管中加入0.5 mm和1.0 mm氧化锆珠的混合物，随后加入组织蛋白提取试剂（T-PER；见材料表中的B7）。
注意： T-PER的体积取决于每管样品的重量，试剂与样品的比例为1 mL试剂对应50 mg样品。进行匀浆管装载时的一般原则是保持1:1:2的体积比，即样品:珠子:T-PER（图3A）。提取缓冲液的体积不宜过大，珠子的量也不宜过少，以免导致匀浆效率低下。 - 将样品管装入搅拌式匀浆器（见材料表中的D6）。设定时间为2分钟，速度为6级，开始匀浆。运行结束后检查样品是否完全匀浆，若未完全匀浆则重复运行，直至样品完全匀浆（图3B）。
注意： 一次运行最多可同时匀浆24个样品管。在匀浆过程中必须保持样品低温，以尽量减少蛋白质变性。本研究所用的子弹式匀浆器具有内置冷却功能，可保持样品低温。若所用匀浆器无内置冷却功能，则可在每次运行之间将样品置于冰上保存。 - 小心地将匀浆液转移至新的微量离心管中。在4 °C条件下，以10,000 x g离心20分钟，使不溶性蛋白质沉淀，并分离含有可溶性蛋白质的上清液。小心吸取上清液至新的微量离心管中，避免接触沉淀层（图3C）。
注意： 上清液和沉淀均可在-80 °C保存，直至进一步使用。
4. 沉淀物消化
- 加入200 µL 提取缓冲液 2A 和 5 µ加入适量蛋白酶抑制剂混合物至每个沉淀样品中，用移液器反复吹打悬浮沉淀。
注意： 在将提取试剂加入沉淀前，需充分混匀。在整个提取过程中，提取缓冲液2A应置于冰上，蛋白酶抑制剂则保持在室温。 - 使用超声波均质器将沉淀完全均质化。
- 将振幅设置为60，循环次数设置为1。使用钛金属制成的探头（Ø 0.5 毫米，80 毫米长），适用于小体积样品（10–500 µL).
- 将探头浸入沉淀物与提取缓冲液的混合物中，按下启动按钮，使样品暴露于超声波。
- 将样品超声处理，直至沉淀团块完全均质化。每次超声之间暂停数秒。
- 目视检查是否完全匀浆。用移液器反复吹打数次，确保无团块存在。
注意： 沉淀物提取步骤应在冰上进行，以防止因匀浆过程中产生热量而导致蛋白质变性（图4).
5. 样品纯化与缓冲液置换
- 根据制造商说明（必要时进行适当修改），使用截留分子量为3 kDa的离心过滤装置（参见材料表中的D3）进行本操作。首先，将过滤单元插入微量离心管中（过滤装置配套提供）。
- 用移液器将200 µL样品匀浆液加入一个过滤装置中，并向同一过滤器中加入200 µL去离子水。盖紧管盖（图5A）。
- 将过滤装置放入离心机中，在4 °C条件下以14,000 x g离心15分钟。
- 从离心机中取出装置，将含有样品浓缩液的过滤单元与含有滤液的微量离心管分离。弃去滤液（图5B）。
- 向过滤单元中加入400 µL去离子水，重悬浓缩物。重复步骤5.3和5.4共三次。小心地将“净化后”的样品浓缩液移入干净的微量管中。
注意：通常情况下，200 µL粗提样品经过滤后可获得约50–70 µL浓缩液。 - 对剩余的样品匀浆液重复步骤5.1–5.5。
6. 蛋白质测定
- 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒（参见材料表中的B5项），在酶标仪上测定sPCA样品上清液和沉淀组分的蛋白浓度。
- 根据制造商说明书，从一支含有2 mg/mL BSA的1 mL安瓿中配制牛血清白蛋白（BSA）标准品稀释液（最终BSA浓度范围为25至2,000 µg/mL）。
- 将每种BSA标准品稀释液及样品重复样（包括上清液和沉淀）各10 µL，用移液器加入96孔平底微孔板的各个孔中。
- 通过将50份BCA试剂A与1份BCA试剂B混合，配制BCA工作液。
注意：在配制前应先计算每次测定所需工作液的总体积，并根据待测样品数和标准品稀释点的数量，新鲜配制足够体积的工作液。 - 小心向每个孔中加入200 µL BCA工作液。盖好微孔板，在37 °C孵育30分钟。待板冷却至室温后，在酶标仪上测定562 nm处的吸光度（参见材料表中的D13项）。
- 根据各BSA标准品浓度（µg/mL）生成的标准曲线，确定样品的蛋白浓度。
7. 一维凝胶电泳（1DE）
- 按照表1所示准备用于一维凝胶电泳（1DE）的样品（以一个样品为例）。使用移液器充分混匀样品混合物。在70 °C加热15分钟，然后冷却至室温。
- 通过将50 mL MES SDS运行缓冲液加入950 mL去离子水中，配制1x运行缓冲液。充分混匀。
- 准备预制的4-12% Bis-Tris蛋白凝胶（见材料表中的B4）。
- 剪开塑料袋取出凝胶盒，并用去离子水冲洗凝胶盒。
- 以流畅的动作将梳子从凝胶盒中取出，注意不要损坏加样孔。
- 使用移液器用1x运行缓冲液轻轻冲洗加样孔2-3次。倒置凝胶盒并轻轻振荡以去除缓冲液，确保加样孔中无气泡残留。
- 撕去凝胶盒底部的白色胶带。
- 将凝胶（最多两个凝胶盒）插入电泳槽中，完全组装后锁紧凝胶固定楔块。
- 向上层（阴极）缓冲液室中加入200 mL运行缓冲液，直至加样孔完全浸没。检查是否存在泄漏。
- 向运行缓冲液中加入500 µL抗氧化剂（见材料表中的A14）。
注意：该抗氧化剂为专有试剂，必须与使用还原剂处理的样品（参见表1）联合使用，以在电泳过程中维持还原条件，并防止色氨酸和甲硫氨酸等敏感氨基酸发生再氧化。 - 使用移液器小心地每道加入50 µg样品。随后加入预染蛋白标准品作为分子质量标记（见材料表中的A18）。
- 向底层（阳极）缓冲液室中加入600 mL运行缓冲液。
- 在恒定电压175 V下电泳约60分钟。电泳结束后，使用凝胶刀小心地从凝胶板中取出凝胶。
- 小心将凝胶转移至凝胶染色盒中。
- 根据需要染色的凝胶总数，按照表2中所述的厂家说明，新鲜配制固定液。
- 在摇床上于室温下将凝胶在固定液中震荡10分钟。
- 弃去固定液，并使用胶体蓝染色试剂盒对凝胶进行染色。
- 根据需要染色的凝胶总数，按照表3中所述的厂家说明，新鲜配制染色液。
- 首先根据所需体积量取并直接在凝胶染色盒中混合标有星号（*）的组分。在摇床上于室温下将凝胶在不含Stainer B的染色液中震荡10分钟。
- 将Stainer B直接加入含有*染色液的染色盒中。使用前务必充分振荡Stainer B。
注意：步骤7.10.1和7.11.1应在通风橱内操作。
- 为获得最佳整体染色效果，将凝胶在染色液中震荡过夜。
注意：加入Stainer B后10分钟内即可观察到染色条带。染色至少需要3小时，若延长染色时间，条带强度不会进一步变化。 - 小心倾去染色液，替换为200 mL去离子水。将凝胶在水中震荡至少7-8小时以降低背景染色。
注意：脱色过程中需多次更换去离子水，以更有效地去除过量染料。凝胶也可在水中保存长达3天，而不会影响蛋白条带强度。若凝胶不立即进行后续步骤，可将其长期保存于4 °C的20%硫酸铵溶液中。
8. 胶内胰蛋白酶消化
注意：本方案依据 Shevchenko 等人17 的方法稍作修改。该操作应在超净工作台中进行，并使用专用于此目的的移液器、吸头、离心管和玻璃器皿。全程佩戴手套和适当的实验服，以防止角蛋白及其他污染。所有本操作中使用的溶液和试剂均应在使用前临时配制。
- 使用洁净且全新的切片机刀片从凝胶中切除蛋白条带。将条带切成小块（约 1 mm × 1 mm 至 2 mm × 2 mm）。小心地将凝胶小块转移至 1.5 mL 微离心管中。
注意：过小的凝胶块可能堵塞移液器吸头，而过大的块则会降低肽段回收率。使用极为锋利的切片机刀片时应格外小心。 - 脱色
- 加入 500 μL 脱色液（含 100 mM ABC 溶液/乙腈（1:1, v/v）），在室温下孵育 30 分钟，期间偶尔振荡或涡旋。
- 小心吸出脱色液。目视检查各管中是否有残留染料。若凝胶小块仍呈蓝色，则重复步骤 8.2.1。
- 还原与烷基化
- 加入约 400 µL 新鲜配制的 DTT 溶液，在 56 °C 下孵育 30 分钟。确保溶液完全覆盖凝胶小块。小心吸出还原液并弃去。
- 加入约 400 µL 新鲜配制的 IAA 溶液，在避光条件下室温孵育 30 分钟。用移液器吸除烷基化缓冲液并弃去。
- 酶解
- 在室温下加入 500 µL 纯乙腈，孵育 10–15 分钟，直至凝胶小块收缩并变为不透明。吸出乙腈，并在通风橱中将凝胶小块空气干燥 5–10 分钟。
- 向每根管中加入 50 µL 胰蛋白酶溶液，确保完全覆盖凝胶小块。将管子在 4 °C 下孵育 30 分钟。
- 30 分钟后，检查每根管中胰蛋白酶溶液是否已被凝胶小块完全吸收。如有必要，加入适量胰蛋白酶缓冲液（50–100 µL，根据管内体积而定），确保完全覆盖凝胶小块。在 37 °C 下过夜孵育。
- 肽段提取
- 小心吸出各管中的肽段提取液，转移至洁净的微量管中。在离心式真空浓缩仪中将上清液干燥。
注意：请勿丢弃剩余的凝胶小块。 - 向每根管中加入 100 µL 提取缓冲液（参见步骤 1.7），在 37 °C 下振荡孵育 30 分钟。
- 将上清液吸出，加入对应蛋白条带的同一微量管中（含已提取的肽段），并在真空离心浓缩仪中干燥。
注意：若不立即使用，干燥后的肽段提取物可在 -20 °C 下保存数月，以备后续使用。
- 小心吸出各管中的肽段提取液，转移至洁净的微量管中。在离心式真空浓缩仪中将上清液干燥。
9. 肽段纯化
注意：本多肽样品脱盐与纯化步骤使用 C18 吸头（参见材料表中的 C15）。每个样品需使用新的吸头。
- 在锥形离心管中新鲜配制以下溶液，并按 表4 所示分装至 2 mL 微量离心管中，用于肽段纯化步骤。肽段纯化所用各管的汇总如下：A 管（样品溶液）、B 管（润洗液）、C 管（平衡液）、D 管（洗涤液）、E 管（洗脱液）、F 管（空的 2 mL 或 5 mL 微量离心管，根据待纯化样品数量选择，用于废液收集）以及 G 管（洁净的空微量管，容量 0.2 mL）。
- 用 10 µL 的 0.1% TFA 重新溶解第 8.6.3 步骤中获得的干燥肽提取物。此管标记为 A 管。
- 将 A 管置于含冰的超声水浴中进行超声处理 5 分钟。
- 在台式离心机中以 1,000 x g 离心 1 分钟，使样品溶液沉降。
- 将 P10 移液器调至最大体积 10 µL，并牢固安装 C18 移液枪头。
- 将移液枪头浸入润洗液（B 管）中，小心吸取液体使其通过填料。缓慢将废液排入 F 管。重复此步骤至少 7–8 次。
注意：在整个操作过程中，将移液器按钮压至死点并缓慢释放或排出。移液时需注意避免引入气泡，以确保肽段与 C18 柱的最大结合效率。 - 通过吸取 C 管中的 10 µL 平衡液对枪头进行平衡，以利于肽段结合。弃去液体后重复该步骤 3 至 4 次。
- 随后，根据相应凝胶条带的厚度，多次吸取和排出 A 管中的样品溶液，使肽段结合到枪头柱上。
注意：结合过程中的吸取和排出操作（步骤 9.8）均在 A 管内进行。切勿将样品溶液排入废液管中。 - 通过吸取 D 管中的洗涤液并将其排入废液管（F 管）4 至 5 次，清洗 C18 移液枪头。
- 最后，用移液器吸取洗脱液（E 管），并将洗脱液排入 G 管，以洗脱已结合的肽段。
- 每个样品重复上述步骤 2 至 3 个循环，以提高样品回收率。
- 每个样品纯化后即弃去枪头，下一个样品使用新的枪头。
- 使用真空浓缩仪将纯化的肽段洗脱液干燥。
注意：纯化后的样品现已准备好用于 LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS 系统的 LC-MS/MS 分析。将干燥后的样品储存于 -20 °C，待后续使用。
10. 液相色谱-电喷雾电离-MS/MS 分析
注意：采用液相色谱-电喷雾电离-线性离子阱-Orbitrap（LC-ESI-LTQ-Orbitrap）质谱系统进行非标记定量蛋白质组学分析。液相色谱系统由配备在线脱气装置的Rheos Allegro四元泵组成，与HTS PAL自动进样器连接，系统包含一根30 mm × 0.5 mm的C18预柱和一根150 mm × 0.5 mm的C18分析柱。流动相A为含0.1%（v/v）甲酸的LC-MS级水溶液，流动相B为含0.1%（v/v）甲酸的LC-MS级乙腈溶液，采用反相色谱模式。梯度洗脱程序运行时间为每胶条60分钟，具体参数详见我们之前的研究6,16。
- 将纯化的肽样品溶解于 10 µL 的 0.1% TFA 中。在冰上超声处理样品 5 分钟。
- 用移液器将 10 µL 样品转移至 V 型底 96 孔板中，并用透明自粘封板膜密封。
- 将板转移至自动进样器中。
- 采用以下梯度程序，每次运行时间为 60 分钟：0–35 分钟（15–40% 溶剂 B），35–40 分钟（40–60% 溶剂 B），40–45 分钟（60–90% 溶剂 B），45–50 分钟（90% 溶剂 B），50–53 分钟（90–10% 溶剂 B），以及 53–60 分钟（10% 溶剂 B）。
- 使用以下质谱仪参数：正离子电喷雾电离模式，喷雾电压（2.15 kV），毛细管温度（220 °C），数据依赖性采集模式，Orbitrap-MS 与 LTQ MS/MS 之间的自动采集切换，Orbitrap 分辨率（30,000），m/z 范围（300 至 1,600），目标自动增益控制（AGC，1.0 × 106 离子），内部实时校准（聚二甲基环硅氧烷 [PCM]，m/z 445.120025 离子），质谱模式下启用锁质量选项，通过选择信号强度最高的前五个母离子获取串联数据，进一步采用碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，归一化碰撞能量（NCE，35%，激活时间 30 ms，重复次数 3），动态排斥时间（600 s）。
注意：产生的碎片离子在 LTQ 中记录。 - 每份样品至少运行三个生物学重复。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
样本获取受限是眼科研究中的主要难题之一。相应地，如何从视网膜血管等微量样本中获得最佳蛋白质得率，其提取方法常存在争议。迄今为止，专门针对球后血管蛋白提取的方法仍十分匮乏。因此，作为方法优化的第一步，并为了验证一种相对较新的试剂T-PER与几种常用蛋白提取去垢剂在提取效率和稳健性方面的差异，我们首先利用小鼠心脏组织开展了预实验（因心脏组织易于获取且样本量充足，适合优化步骤）。我们通过比较以下试剂提取后的总蛋白浓度及鉴定到的总蛋白数量，评估其蛋白得率：T-PER、0.02% n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸（CHAPS）、1% 氨基磺基甜菜碱-14（ASB-14），以及乙腈与三氟乙酸的混合液（20% ACN / 1% TFA）。使用上述每种去垢剂提取的样本中总蛋白含量如图6A所示，其中T-PER提取组织的蛋白得率最高（56.4 µg/mg组织），其次为DDM（22.88 µg/mg组织）、CHAPS（16.01 µg/mg...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
对多种眼部样本进行全面的蛋白质组分析，是阐明健康与疾病状态下相关分子机制和信号通路的重要且不可或缺的第一步。为了获得高质量的数据并确保这些分析结果的可重复性，前期的样品制备步骤至关重要。Mandal 等人的一篇综述详细讨论了利用二维凝胶电泳和质谱策略对眼球不同部位进行样本处理的流程1，突显了这一点。在此类研究的基础上，本研究提供了一种优化的、逐步操作的实验方案，以猪的视网膜小动脉（sPCA）作为模型眼微血管，实现快速、稳健且高度高效的质谱兼容样品制备。本研究的开展源于目前缺乏特异性方法，难以从数量有限的动脉样本中提取足量蛋白质以生成高质量的质谱数据。本方法也旨在为现有微尺度技术的应用知识体系做出贡献，此类技术可实现优异的蛋白质组图谱绘制18。
在定量蛋白质组分析的实验方案中，有几个关键方面需要考虑，以确保最佳的实验效果。首先，无论样品量多少，都必须进行充分的均质化处理，以保证蛋白质的最佳提取效果。在本研究的方法中，使用不同尺寸的珠子混合物并结合子弹式匀浆仪，对实现组织的完全裂解起到了关键...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Manicam 博士获得了约翰内斯·古腾堡大学美因茨大学医学中心校内大学研究基金（Stufe 1）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号 MA 8006/1-1）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A. 化学品 | |||
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| 二水合氯化钙（CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| 甲酸（CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| 高效液相色谱级乙腈（ACN，C2H3N） | AppliChem | A1605 | |
| 高效液相色谱级甲醇（CH3OH） | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 高效液相色谱级水 | AppliChem | A1589 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| 氯化钾（KCl） | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| 液相色谱-质谱级乙酸 | Carl Roth | AE69.1 | |
| 硫酸镁（MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE 抗氧化剂 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE 样品还原剂 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 预染蛋白标准品 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 氯化钠（NaCl） | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| 碳酸氢钠（NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| 三氟乙酸（TFA， C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)-一水葡萄糖 | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. 试剂与试剂盒 | |||
| 0.5 mm 氧化锆珠 | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm 氧化锆珠 | Next Advance | ZROB10 | |
| 胶体蓝染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | 每盒可染色 25 块小型凝胶 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tri 凝胶 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm，10 孔 |
| 派斯生物二喹啉酸（BCA）蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract 跨膜蛋白提取试剂盒（TM-PEK） | Merck Millipore | 71772-3 | 每盒 20 次反应 |
| 组织蛋白提取试剂（T-PER） | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. 工具 | |||
| 96 孔 V 型底板 | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96 孔平底板 | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| 一次性切片刀片 | pfm Medical | 207500014 | |
| 一次性手术刀 #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| 解剖针 | Carl Roth | PK47.1 | |
| 超精细 Bonn 剪刀 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon 圆锥形离心管（50 mL） | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo 剪刀，坚韧型 | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| 精密镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 5 型 |
| 精密镊子，直头超细尖端 | Carl Roth | LH53.1 | 5 型 |
| 微孔板自粘密封膜 | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| 标准型持针钳 | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 学生型 Vannas 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas 囊膜切开剪刀 | Geuder | 19760 | 直头，77 mm |
| ZipTipC18 吸头 | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. 仪器与设备 | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 色谱柱 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 预柱 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K 离心过滤装置 | Merck Millipore | UFC500396 | 每包 96 个 |
| 分析天平 | Sartorius | H51 | |
| 自动进样器 | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf 浓缩仪，型号 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf 微型离心机，型号 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | 非制冷型 |
| Heraeus Primo R 离心机 | Thermo Scientific | 75005440 | 制冷型 |
| Labsonic M 超声波均质器 | Sartorius | BBI-8535027 | |
| 液相色谱-质谱泵，Rheos Allegro 型号 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL 质谱仪 | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent 微孔板读板仪 | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| 带涡旋功能的旋转器 | neoLab | 7-0045 | |
| 钛探针（Ø 0.5 mm，长 80 mm） | Sartorius | BBI-8535612 | |
| 超声波清洗器，RK 31 型 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
参考文献
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
