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方法文章

从完整组织中提取细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/59143

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2019年2月7日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Florida State University College of Medicine

本文内容

摘要

本文提供了一种从完整组织（包括脑组织和肿瘤样本）中分离小细胞外囊泡（EVs）的详细方案。该方法可重复地从实体组织中提取EVs，用于后续下游分析。

摘要

循环系统和组织间液中的小型膜结合细胞外囊泡（EVs）是开发新型诊断或预后生物标志物检测方法的潜在靶标，并可能在多种疾病的发生发展中发挥重要作用。目前的研究致力于表征来自不同细胞和组织类型的囊泡，以更深入地理解EVs在神经退行性疾病、炎症和癌症等疾病发病机制中的作用。然而，全球范围内尚缺乏统一且可重复的囊泡分离与纯化技术。此外，关于从实体组织中体外（ex vivo）提取EVs的方法报道甚少。本文提供了一种详细的实验方案，用于从完整的新鲜或冷冻组织（包括脑组织和肿瘤样本）中提取目标小EVs，以便进一步分析。我们展示了该方法适用于多种下游分析的灵活性，包括囊泡的电子显微镜观察和免疫表型鉴定，以及EV蛋白的定量质谱分析。

引言

小型细胞外囊泡（EVs）包括内体来源的外泌体和小型膜脱落微囊泡，具有广泛的生物医学研究价值。小型EVs由一群异质性的、直径为50–250 nm的膜结合囊泡组成，含有具有生物活性的蛋白质、脂质和核酸，普遍认为它们在多种疾病过程中发挥重要作用。不断深入的研究尤其表明，这些囊泡参与神经退行性疾病和朊病毒病、感染过程、自身免疫或炎症性疾病，以及肿瘤生长与转移1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。随着EVs在疾病发病机制中重要性的生物医学研究迅速发展，人们也日益关注建立可重复且严谨的小型EVs分离与纯化方法。

在细胞外囊泡（EV）表征领域，一个历史性和当前的挑战是无法完全分离出小型EV亚群。这一挑战主要源于我们对不同囊泡生成过程中所涉及的分子机制差异了解有限。不同亚群之间在大小、密度以及生物 cargo 上的重叠进一步加剧了这些区分的复杂性。此外，该挑战的部分原因还在于广泛使用了差异较大的富集技术，导致各实验室在分离囊泡后的下游分析结果不一致，从而削弱了全球范围内对EV类别化群体进行阐明的共同努力。

值得注意的是，目前大多数细胞外囊泡（EV）的表征研究均基于体外培养细胞上清液的收集；而近期越来越多的体内研究则描述了从动物或人体体液（包括血浆、尿液和唾液）中分离囊泡的技术。尽管循环系统中含有大量EV，但人们也认识到这些囊泡在细胞间通讯过程中发挥着重要作用，并存在于细胞组织的间质中。在癌症背景下，间质中的EV可能在调控肿瘤微环境以促进癌细胞定植和转移性生长方面具有特别重要的意义14,15。因此，开发并优化从实体组织样本中提取囊泡的技术具有重要价值。这些方法将为直接研究来源于临床样本（包括小活检组织以及部分或完整器官切除标本）的器官或肿瘤来源EV提供途径。

在本研究以及我们实验室此前发表的一篇报告16中，我们旨在解决当前细胞外囊泡（EV）富集方法中的几个主要问题：1）描述一种可重复的技术，以按照目前该领域普遍接受的最高标准分离和纯化EV；2）尝试分离出富含早期内体来源外泌体的小型EV亚群；3）提供一种从固体组织样本中提取这些囊泡的方案，以便进一步表征。

最近，Kowal 及其同事描述了一种相对小规模的碘克沙醇密度梯度法，用于分离和纯化细胞外囊泡（EV）亚群，其效果优于类似的蔗糖密度梯度法17。在该研究中，树突状细胞来源的EV被捕获于密度相对较低的组分中，其密度约为1.1 g/mL，该组分富含内体蛋白，提示其中含有较高比例的外泌体。作者指出，这些"真正意义上的"外泌体蛋白包括肿瘤易感基因101（TSG101）、syntenin-1、CD81、ADAM10、EHD4以及多种annexin蛋白17。我们随后改进了该技术，将其应用于Perez-Gonzalez等人描述的组织解离方法18，并结合后续的差速离心方案，以分离全脑来源的EV16。我们还通过结合实验室先前报道的下游定量和比较性囊泡蛋白质谱分析的连续操作流程，验证了该方法在表征EV蛋白质组方面的实用性19。此项工作与Hill实验室的研究相呼应，后者从脑组织的额叶皮层中富集了EV20。

在本研究中，我们详细阐述了这一技术，并将本实验室近期发表的实验方案拓展应用于从实体肺肿瘤中分离细胞外囊泡（EVs）。据我们所知，这是首次报道从离体肿瘤标本中富集EVs的实验方法。鉴于EVs作为新型诊断生物标志物及其在肿瘤发生中作用的研究日益广泛，该方法可能对越来越多的科研人员具有重要价值。从临床角度来看，间质EVs可能具有重要的诊断潜力，尤其是在组织学评估受限的标本中。我们希望，本文所述方法能为从新鲜或冷冻的动物或人源手术标本中可重复地收获EVs提供一个可靠的基础，从而为未来揭示这些小囊泡在疾病发病机制中的重要作用铺平道路。

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方案

全脑组织经佛罗里达州立大学机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准获取。本研究使用了来自C57BL/6 J背景的共十二只小鼠的脑组织（每个年龄组3只，分别为2、4、6和8个月龄），用于细胞外囊泡（EV）的提取，提取方法如前所述16。肺部肿瘤标本由曼迪普·萨奇德瓦博士在佛罗里达农工大学IACUC批准下慷慨提供。这些肺部肿瘤来源于在免疫缺陷型Balb/c nu/nu裸鼠体内生长的人肺腺癌细胞系H1975。本研究重点展示了两个代表性肿瘤重复样本的数据。

注意： 囊泡分离与纯化方法的示意图见图1。

1. 组织解离与差速离心

  1. 每约 0.4–1.0 g 组织，用 Hibernate-E 培养基配制 10 mL 解离缓冲液（含 10 mg 木瓜蛋白酶；5.5 mM L-半胱氨酸；67 µM 2-巯基乙醇；1.1 mM EDTA）。注意，用于细胞外囊泡（EV）富集和纯化的所有溶液均应使用超纯过滤水稀释。
  2. 将完整的新鲜或冷冻组织加入 50 mL 锥形管中的解离缓冲液内，于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。如有需要，可在孵育前将组织切成更小的碎片。
  3. 孵育结束后，向含组织的解离缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，使其终浓度为 1×。
  4. 将含有组织的溶液倒入松配合的 Dounce 匀浆器中，每样本约用 30 次缓慢研磨动作轻柔解离组织。可根据组织的一致性调整研磨次数。
  5. 将解离后的组织连同缓冲液转移至 50 mL 锥形管中，在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，以沉淀细胞及残留的纤维性或凝聚性组织碎片。
  6. 将上清液转移至洁净的 50 mL 锥形管中，在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀并弃除较大的细胞碎片。
  7. 再次将上清液转移至洁净的 50 mL 锥形管中，在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 40 分钟，以沉淀不需要的较大囊泡或小型凋亡小体。
    注意： 如有需要，此沉淀物可保存用于对较大囊泡的进一步研究。
  8. 将上清液通过 0.45 µm 滤膜滤入洁净的 12 mL 超速离心管中。
    注意： 密集纤维化的组织样本可能难以过滤。此类样本可先通过 40 µm 细胞筛过滤，再依次通过更细的针头（18 G、20 G、22 G）处理，最后再通过 0.45 µm 滤膜过滤。
  9. 在 4 °C 下以 100,000 × g 超速离心 2 小时，以沉淀小细胞外囊泡（小 EVs）。
  10. 倒出上清液，并将超速离心管倒置 5–10 分钟，频繁轻敲以去除管壁残留液体。也可使用抽吸式真空移液器吸除残余液体。
  11. 用 1.5 mL 0.25 M 蔗糖缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4）重悬 EV 沉淀。此步骤中确保沉淀完全重悬至关重要。为实现充分重悬，可在涡旋前用封口膜密封管口，并将超速离心管在室温下轻轻摇动 15–20 分钟，最后再进行一次涡旋混匀。
  12. 短暂离心管子，离心速度不超过 1,000 × g，以使液体悬浮物沉降至管底。
  13. 继续进行下述梯度纯化步骤，或如有需要，可将 EV 悬液在 4 °C 下短期保存过夜。

2. 密度梯度纯化

  1. 向含有细胞外囊泡（EVs）的1.5 mL蔗糖/Tris缓冲液中加入1.5 mL 60%碘克沙醇（水中的储存液），配制成终浓度为30%碘克沙醇的溶液。反复吹打数次以充分混匀。由于碘克沙醇浓度较高，溶液黏稠，需注意避免移液枪头中残留液体造成损失。
  2. 将含有EVs的30%碘克沙醇缓冲液转移至5.5 mL超速离心管底部。
  3. 使用60%碘克沙醇储存液，在超纯水中为每个样品至少配制1.5 mL的20%和10%碘克沙醇溶液。
  4. 量取1.3 mL 20%碘克沙醇溶液，使用注射器和18 G针头小心地将其叠加在底部梯度层上方。为避免在密度界面处发生混合，应使针头斜面紧贴超速离心管内壁并位于弯月面稍上方，缓慢逐滴加入溶液。
  5. 采用相同技术，将1.2 mL 10%碘克沙醇溶液叠加在20%碘克沙醇层上方。
  6. 小心平衡并装载超速离心管至转子吊桶中，在4 °C条件下以268,000 × g离心50分钟。将离心机的加速度和减速度设置为允许的最低值，以防止破坏密度梯度层。
  7. 为每个样品标记十个1.5 mL微量离心管，对应密度梯度的第1至第10组分。第1组分为最上层，将首先被移除；第10组分为最底层，最后被移除。
  8. 密度梯度超速离心完成后，轻轻将离心管从转子吊桶中取出并置于稳定的支架中。目标组分中通常可见一条明显的囊泡条带。从梯度顶部开始，用移液器依次收集十份490 µL的组分至相应标记的离心管中。管底将残留少量液体，可能含有污染性蛋白质。该部分可弃去，或根据需要保留作为第11组分。
  9. 使用折射仪测定各组分的折射率。若需节约样品，也可同时平行运行一个对照梯度进行测量。将每份含碘克沙醇的组分取20–30 µL滴加至折射仪表面，通过将测得的折射率与已知碘克沙醇密度进行比对，估算其密度。注意：如需在进入下一步超速离心洗涤前暂时保存，各组分可在含碘克沙醇的溶液中于4 °C过夜存放。
  10. 将每个组分转移至洁净的12 mL超速离心管中。向管中加入5 mL 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH 7.4），并通过缓慢吹打混匀。
    注意：加入样品的PBS应无颗粒，可通过将无菌PBS经0.22 µm滤膜过滤，并在室温下储存以避免盐类析出。
  11. 再向管中顶部加入额外6 mL 1× PBS，并再次小心混匀。
  12. 在4 °C条件下以100,000 × g超速离心2小时，以重新沉淀小囊泡。离心后弃去上清液，轻拍管壁使残留液体干燥，随后进行囊泡裂解用于蛋白分析（步骤3）或重悬EVs用于形态学分析（步骤5）。

3. 细胞外囊泡蛋白的裂解与免疫印迹验证

注意：如果需要保存完整的囊泡以进行形态学表征或生物学活性分析，研究人员可直接进入第5步。在初始实验中，或在进行质谱分析之前，应对回收的所有组分进行免疫印迹分析，以确认含有细胞外囊泡蛋白的组分。

  1. 为了裂解细胞外囊泡（EV）以进行蛋白质分析，向超速离心管中的EV沉淀中加入40 µL强裂解缓冲液（5% SDS、10 mM EDTA、120 mM Tris-HCl pH 6.8、2.5% 2-巯基乙醇、8 M 尿素），并添加蛋白酶抑制剂。
    注意：若抗体检测蛋白时需要非还原条件，则在强裂解缓冲液中用超纯水替代2-巯基乙醇。
  2. 为确保沉淀完全重悬并在缓冲液中充分裂解EV，用封口膜封住超速离心管口，剧烈涡旋振荡，然后在室温下轻轻摇动20分钟，最后再进行一次涡旋。
  3. 在1,000 × g 条件下短暂离心30–60秒，以回收全部样品体积。将样品转移至新的1.5 mL微量离心管中，并在-20 °C至-80 °C下保存，直至后续处理。
  4. 为准备用于免疫印迹分析的纯化裂解物，向样品中加入5× Laemmli上样缓冲液（10% SDS、250 mM Tris pH 6.8、1 mg/mL 溴酚蓝、0.5 M DTT、50% 甘油、5% 2-巯基乙醇），使终浓度为1×。
    注意：若需要非还原条件，则用超纯水替代DTT和2-巯基乙醇。
  5. 若需使用全组织匀浆作为对照，将组织在上述含尿素的强裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）中裂解，然后在10,000 × g 条件下离心10分钟，弃去残留的细胞外基质、完整细胞或细胞碎片。向组织匀浆中加入5× Laemmli上样缓冲液，使终浓度为1×。
  6. 将含有EV或组织匀浆样品的上样缓冲液在95 °C下煮沸5–10分钟，然后将等体积的第1–10组分（相当于起始组织材料0.1–0.3 g；纯化EV蛋白1–2 µg）上样至10% SDS-PAGE凝胶中。组织匀浆应按等质量上样。对于灵敏度较低的抗体，可能需要上样更多体积的样品。
  7. 按照先前所述方法21进行凝胶电泳和Western印迹分析，以确认纯化裂解物中的EV蛋白，并比较各组分中EV的相对丰度。
    注意：一旦在稳定的组分中可重复检测到EV蛋白，则步骤2.12中所述的最终超速离心洗涤步骤可仅限于感兴趣的梯度组分。

4. 细胞外囊泡蛋白定量

  1. 若需对细胞外囊泡（EV）蛋白进行高灵敏度定量以用于后续分析，请使用兼容去污剂和尿素的基于荧光的检测方法（参见材料表）。请注意，某些基于荧光的检测方法兼容Laemmli上样缓冲液中存在的溴酚蓝，因此可根据需要直接将EV沉淀（步骤2.12中）裂解于该缓冲液中。
  2. 若使用上述基于荧光的蛋白质定量试剂盒，请将1 µL样品或标准品至少重复点样两次于提供的滤纸上，并按照制造商说明书继续进行蛋白质定量。

5. 细胞外囊泡形态的表征

  1. 为了在步骤 2.12 的最终离心洗涤后检测完整囊泡，需将 EV 沉淀充分重悬于无颗粒的 1× PBS 中。将 EV 储存于 4 °C，储存时间不超过一周，以避免冻融循环。
    注意：建议先前已通过免疫印迹分析确认某些组分中持续含有富集的 EV 蛋白质，以便将形态学分析限定于感兴趣的组分。
  2. 对完整的 EV 样品进行纳米颗粒追踪分析，以测定制备物中囊泡的浓度和大小，具体方法如前所述22。
  3. 如需进一步表征 EV 的形态并验证囊泡的尺寸测量结果，可进行电子显微镜观察。EM 载网可从步骤 5.1 后的囊泡悬液制备23，或 alternatively 可从步骤 2.12 后的沉淀制备成包埋块样品24。

6. 质谱分析用凝胶内纯化与胰蛋白酶消化

  1. 若需通过质谱法表征细胞外囊泡（EV）的蛋白质组，可将含有EV的组分以等量蛋白质量（至少10 µg蛋白）上样至预制聚丙烯酰胺凝胶中，以分离和纯化蛋白质。建议使用厂家提供的预制凝胶，以减少可能引入样品中的污染蛋白（如角蛋白）。
  2. 为纯化蛋白质，将样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移至少0.5英寸，随后用考马斯亮蓝染料进行固定和染色，具体操作如前文详述25。
  3. 将电泳条带切成1 mm3的小块，用于胰蛋白酶消化，具体步骤如前文所述19,26。
  4. 取5 µL消化后的肽段样品上样至液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仪器中，在分析柱上分离后，按照前文详细描述的参数进行质谱分析16。

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结果

组织解离、差速离心及囊泡梯度纯化的示意图见图1。梯度纯化细胞外囊泡（EVs）的形态学和免疫表型鉴定结果在图2中突出显示。图中展示了10-30%碘克沙醇梯度超速离心后可重复的密度分布情况，两种不同的囊泡群体根据组织类型的不同分别向上迁移至第2组分（轻度EVs）和第5组分（致密EVs）。梯度组分的代表性免疫印迹显示，在第5组分中实现了小肿瘤来源EVs的有效分离与纯化。值得注意的是，与此前从全脑组织中获得的轻度EVs（位于第2组分）相比，肺肿瘤样本中致密EVs含量更为丰富，这一点在本研究中再次得到证实。随着对不同组织来源EVs的全局性分析逐步开展，明确不同组织所产生的EVs各自特有的密度特征将具有重要意义。对主要含囊泡组分中组织来源囊泡进行的代表性纳米颗粒追踪分析和电子显微镜观察表明，完整囊泡得到了富集并保持了良好的结构，其大小和形态符合已知的小EVs特征。最后，图3展示了该方法在推动下游质谱分析梯度...

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讨论

关于小型细胞外囊泡（EV）在肿瘤微环境以及器官发育、成熟和功能中所起作用的研究已引起广泛关注。总体而言，本研究提供了一种从完整脑组织或肿瘤样本中提取完整EV的优化流程。尽管本文仅展示了该技术在肺癌来源EV中的应用，但该方法可轻松适用于其他实体组织，为深入进行体外表征具有广泛生物医学研究价值的小型分泌囊泡提供了可能。虽然超出本研究范围，但未来对EV内容物与其来源组织表达谱的比较分析，对于确立分离囊泡作为组织和疾病生物标志物的实用性也具有重要意义。

在我们实验室先前发表的研究中，我们明确展示了基于漂浮的密度梯度相较于沉降梯度在富集小细胞外囊泡纯化过程中的优势。本质上，基于浮力的分离方法通过避免污染物迁移至目标组分中，从而提高了囊泡的纯化效果。当起始材料为全组织等复杂样本时，这一原理显得尤为重要。尽管如此，我们仍强调对所分离囊泡进行分析前验证研究的重要性，包括通过电子显微镜和纳米颗粒追踪分析等互补技术对细胞外囊泡（EV）形态进行检测，以及包括免疫印迹在内的生物化学分析。在富集组分中，应至少使用三种公认的EV标志物（包括一种四跨膜蛋白）来确认EV蛋白的存在，如国际细胞外囊泡学会（ISEV）...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨向理查德·诺瓦科夫斯基博士（Dr. Richard Nowakowski）以及佛罗里达州立大学实验动物资源中心（Florida State University Laboratory Animal Resources）致以诚挚感谢，感谢他们为本方案的开发提供了实验动物并给予悉心照料。我们感谢刘霞、拉克什·辛格博士（Dr. Rakesh Singh）以及佛罗里达州立大学转化科学实验室（Florida State University Translational Science Laboratory）在用于后续囊泡表征的质谱分析工作中提供的协助，同时也感谢佛罗里达州立大学生物科学成像资源中心（FSU Biological Science Imaging Resource facility）为本研究提供透射电子显微镜的使用支持。最后，我们感谢佛罗里达农工大学（Florida A&M University）的曼迪普·萨赫德瓦博士（Dr. Mandip Sachdeva）捐赠了本方法开发过程中所使用的肿瘤标本。本研究得到了佛罗里达州卫生部Ed和Ethel Moore阿尔茨海默病研究项目向D.G.M.和J.M.O.（项目编号：6AZ11）提供的资助，以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所（National Cancer Institute of the National Institutes of Health）向D.G.M.授予的R01CA204621项目基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 µm 滤膜VWR28145-505
12 mL 超速离心管Beckman Coulter331372
5.5 mL 超速离心管Beckman Coulter344057
抗 Alix 抗体Santa Cruzsc-7129
抗 Calnexin 抗体Santa Cruzsc-11397
抗 CD63 抗体Abcamab59479
抗 CD81 抗体Santa Cruzsc-9158
抗 Flotillin 2 抗体Santa Cruzsc-25507
抗 HSC70 抗体Santa Cruzsc-7298
抗 Syntenin-1 抗体Santa Cruzsc-100336
抗 TSG101 抗体Santa Cruzsc-7964
EZQ 蛋白定量试剂盒ThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 转子 Eppendorf5820715006
FEI CM120 电子显微镜TSS Microscopy
山羊抗兔 IgG（Fab 片段）Genetex27171
HALT 磷酸酶抑制剂（100 倍溶液）ThermoFisher Scientific78420
HALT 蛋白酶抑制剂（100 倍溶液）ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E 培养基ThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 摆桶转子Beckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP 台式超速离心机 Beckman Coulter393315
Optima XE-100 超速离心机Beckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% 碘克沙醇无菌水溶液
Q Exactive HF 质谱仪ThermoFisher Scientific
兔抗山羊 IgGGenetex26741
兔抗小鼠 IgGGenetex26728
Refracto 30PX（折光仪）Mettler Toledo51324650
S-4-104 转子Eppendorf5820759003
SW 41 Ti 摆桶转子Beckman Coulter333790
台式 5804R 离心机Eppendorf22623508

参考文献

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