我们报道了一种简单且通用的方法，可用于对拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片进行长时间的荧光活体成像。我们以一种转基因拟南芥（Arabidopsis）植株为例，该植株在免疫相关启动子的调控下表达荧光报告基因，可用于研究植物免疫反应的时空动态特征。
本文内容
摘要
摘要
与全基因组转录重编程相关的植物免疫反应在感染位点启动，因此该免疫反应受到时空上的精确调控。利用免疫相关启动子驱动的荧光基因结合自动化荧光显微镜技术，是研究植物免疫时空调控机制的一种简便方法。尽管根组织已被广泛用于多种活体荧光成像实验，但针对叶片组织的活体荧光成像实例却极为有限，而叶片正是多种空气传播微生物侵染的主要靶标。因此，我们开发了一种简便的方法，用于固定拟南芥叶片以进行活体荧光成像。 拟南芥 用于长时间活细胞成像的植物。我们使用了转基因 拟南芥 表达该基因的植物 黄色荧光蛋白 (YFP) 基因与核定位信号（NLS）融合，受防御相关标记基因启动子的调控， 病程相关蛋白1 (PR1）。我们用转基因叶片进行了渗透处理 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000 (avrRpt2）菌株（Pst_a2）并使用自动荧光体视显微镜对YFP信号进行长达40小时的活体延时成像。该方法不仅可用于植物免疫反应的研究，还可用于分析叶片组织中发生的多种发育过程及环境响应。
引言
植物免疫反应涉及由多种转录因子和植物激素共同调控的动态转录重编程1。转录组数据的积累为获取植物免疫系统的信息提供了机会：例如，信号级联的网络结构2。然而，我们对植物免疫反应在时空上的动态变化仍知之甚少3,4,5。
在以往的研究中，防御相关基因表达的时空调控主要通过原位杂交和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因检测进行分析6,7,8这些方法能够让我们原位可视化多种目的基因的转录激活情况。然而，这些操作需要对样本进行化学固定，因而导致所有时间维度信息的丢失。生物学事件（如免疫反应）是随时间动态发展的。利用荧光素酶作为报告基因，可实现对目的启动子时间动态变化的捕捉。3然而，基于荧光素酶的检测需要昂贵的底物和高灵敏度的检测设备。为了通过一种简单的实验流程加深对植物免疫反应时空特性的理解，我们构建了转基因植株 拟南芥 表达该基因的植物 黄色荧光蛋白 (YFP) 基因与核定位信号（YFP-NLS）融合，受防御相关标记基因启动子的调控， 病程相关蛋白1 (PR1)9我们利用叶绿素自发荧光（活细胞的标志）来捕捉程序性细胞死亡（PCD）的过程，该过程常在效应子触发的免疫（ETI）期间发生，ETI是一种由特定病原体感染诱导的植物免疫形式。9,10. 监测自由移动物体（如活体）荧光信号强度的时间动态变化 拟南芥 叶片，需要使用复杂的图像处理软件，无论是自行开发还是商业化的软件。或者，防止样本移动是解决该问题的一种简单方法。在此，我们开发了一种通用且简便的方法，用于固定转基因植物的活体叶片 拟南芥 在自动化荧光体视显微镜下对植物进行长期观察。该方法使我们能够在数天内捕捉到土壤中生长的完整植物叶片内的启动子动态变化。
方案
注意：在延时成像过程中，必须防止活体叶片样本发生睡眠运动。为尽量减少对叶片的机械应力，需对叶片进行轻柔固定。只有经过充分准备的叶片样本，才能获得适用于多种图像分析的延时成像结果。以下为使用转基因植株的实验方案 拟南芥 表达的植物 YFP-NLS 在控制下的融合 PR1 基因启动子（pPR1-YFP-NLS 植物）和 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000（avrRpt2）菌株（Pst_a2如下所述为一个示例。
1. 植物与病原体的准备
- 填充塑料细胞插件板（材料表）与经高压灭菌的土壤混合。
- 播种一株转基因植株 拟南芥 每细胞种子数（图1A).
- 将托盘转移至保持在23 °C的生长室中，在持续白光条件下培养植株2-3周。
- 在接种病原体前两天，划线接种 Pseudomonas syringae pv. 番茄 DC3000 avrRpt2 菌株（Pst_a2从甘油菌种保存液中取菌接种于含100 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的NYG培养基（5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母提取物，20 mL/L甘油，15 g/L细菌学琼脂，pH 7.0）上，28 °C培养48 h。
- 用塑料吸头收集培养基表面出现的细菌细胞，转移至含有10 mM MgCl₂的塑料离心管中2，重悬。在600 nm处测定溶液的光密度（OD）600）。将细菌细胞的最终浓度调整至108 菌落形成单位（CFU）/mL，通常对应于OD600 = 0.211.
2. 病原体接种
- 小心地切下含有2-3周龄植株的细胞插块，避免损伤植株。将该插块置于空的细胞插盘中（2×2个插孔即可），以保持良好平衡。图1B).
- 选择一片外观健康的叶片进行接种。通常选择第三、第四和第五片叶（分别记为#3、#4和#5） 图1C从植株底部选取的叶片易于操作。为提高实验的可重复性，建议在同一组实验中使用位置相同的叶片。在接种前为植株浇水，以利于长期延时成像。
- 可选地，在分析应激反应型启动子（如 pPR1为确保植物未处于自然胁迫状态，在病原菌接种前，需在荧光体视显微镜下检查叶片，确认无YFP信号。凡显示YFP信号的叶片应排除在实验之外。
- 操作前佩戴一次性乳胶手套，以避免与病原体直接接触。使用1 mL无针塑料注射器，将细菌悬浮液（108 CFU/mL11 (图1D）。将少量菌液接种于叶片的一半，可实现良好的可视化观察 pPR1 活性；与叶片其余部分相比，渗透区域会呈现较深的绿色而变得可见。在渗透过程中需格外小心，避免对叶片造成任何机械损伤。
注意：确保侵染区域的所有细胞间隙均被病原菌悬浮液完全（垂直）充满；否则，程序性细胞死亡（PCD）区域将难以在荧光体视显微镜下观察。可通过侵染区域是否完全变深绿色来简单确认。 - 用柔软的纸巾吸去浸润叶片周围区域多余的细菌悬浮液。
3. 接种叶片的固定
- 接种后立即使用手术胶带（材料表）将玻璃载片固定在塑料托盘上，使浸润过的叶片位于玻璃载片中央。确保接种的叶片完全位于玻璃载片范围内（图2A）。
- 准备双层塑料胶带（若使用厚度为0.2 mm的胶带，参见材料表），并将其裁剪成两片（图2B；片1和片2），以适配浸润叶片叶柄两侧的空间。将这两片胶带的长度（图2B中双头箭头所示）调整为与图2A中双头箭头所示长度相匹配。
注意：从每片胶带的一角裁去一小部分有助于避免损伤叶片（图2B，箭头所示；另见下文步骤3.4）。任何厚度相似的塑料胶带均适用于在叶柄上方形成桥接结构。塑料胶带的刚性对于后续操作步骤中的便捷操作至关重要。 - 使用精细镊子，将胶带片1和片2分别粘贴在叶柄两侧，使每片胶带的裁角部分与叶片基部对齐（图2C）。确保胶带片不接触叶柄或叶片本身。
注意：叶片基部两侧的双层塑料胶带片起到间隔作用，可防止在安装过程中对叶柄造成物理应力。 - 另取一片双层塑料胶带（图2B，片3），将其裁剪至与图2B中双头箭头所示尺寸相匹配，并将其粘贴在胶带片1和片2的上方，以在叶柄上方形成桥接结构（图2D,E）。操作时需格外小心，避免在图2D,E中箭头所示位置将叶柄或叶片直接夹在胶带之间。
- 使用精细镊子，将一小片手术胶带（图2F，片4）轻轻粘贴在玻璃载片上叶片尖端的上方，使叶片非常轻柔地固定在玻璃载片上。仅用力按压手术胶带中直接接触玻璃载片的部分（图2F，虚线红框标示区域），不要按压覆盖在叶片上方的其余部分。
- 再取一小片手术胶带（图2G，片5），轻轻粘贴在叶柄与塑料胶带片（1、2和3）交界处，使叶柄非常轻柔地固定在玻璃载片和塑料胶带片上。仅将手术胶带中直接接触玻璃载片的部分牢固粘附在玻璃载片和塑料胶带片上（图2G，虚线红框标示区域），不要按压覆盖在叶柄上方的其余部分。
- 使用200 µL移液器吸头（图2H）防止邻近叶片进入显微镜视野。将吸头插入土壤中，以轻柔地将邻近叶片与浸润叶片隔开。注意不要将吸头插入过深，以免造成根系损伤。
注意：制备完成的植株现已可用于荧光体视显微镜成像。
4. 显微镜延时观察
- 打开荧光体视显微镜。
注意：此处使用一台配备高灵敏度140万像素单色数码相机（12位模式）的自动化体视显微镜（材料表）。在进行延时成像期间，显微镜应置于装有空调设备的暗室中，或置于通风良好的暗柜内，以维持室温在23 °C。 - 将植物放置于体视显微镜物镜上方的成像区域。
- 设置延时成像的参数（参见表1中的示例）。务必在延时成像的时间间隔中编程设置光照步骤，因为光照对植物免疫具有显著影响12。
- 使用常规YFP滤光片（激发光波长500–520 nm；发射光波长540–580 nm）来观察YFP信号。
- 使用Texas Red（TXR）滤光片（激发光波长540–580 nm；发射光波长610 nm长通）来观察叶绿素自发荧光，从而使程序性细胞死亡（PCD）区域表现为无自发荧光的暗区，周围被YFP阳性细胞层包围9（图3A）。
- 使用常规落射明场装置进行额外的光照步骤。
注意：实验前应测量落射明场光源的光强，并将其调节至与植物自身生长条件相匹配的水平。
- 运行延时成像程序。若需进行持续数天的长期观察，可在光照步骤期间适当为植物补充水分。
- 图像采集完成后，从数据集中剔除用于间隔期光照的额外通道（对应于表1中的通道3–8）。使用多种方法（如感兴趣区域（ROI）分析）及不同的图像分析软件（如Fiji9）对数据进行分析。
结果
本研究以Pst_a2诱导的效应子触发免疫（ETI）为例进行延时成像。延时数据以一系列图像形式获取，其中部分图像如图3B所示，并以延时视频形式提供（补充视频1）9。在利用pPR1-YFP-NLS成功开展的Pst_a2诱导ETI实验中，可观察到pPR1的瞬时激活，表现为YFP表达焦点，出现在程序性细胞死亡（PCD）区域周围多个细胞层中（图3B）9。pPR1在PCD区域周围细胞中的激活通常始于接种后约5小时（hpi），在约12 hpi时达到峰值，可持续至40 hpi（图3B）9。由于图像采用落射荧光系统采集，此处获得的YFP信号来自多个近轴细胞层，包括表皮细胞和上部叶肉细胞。
图1：细菌病原体接种至Arabidopsis thaliana叶片的方法。（A）将生长2至3周的Arabidopsis植株培养于细胞插盘中。（B）将含有待接种和观察植株的单个细胞插块剪下，并移至空的细胞插盘中以保持平衡。（C）第三、第四和第五片叶（分别记为#3、#4和#5）适用于图像分析。（D）使用无针头注射器将病原菌悬浮液接种至选定叶片。接种区域因颜色较周围叶片更深的绿色而可被识别。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：用于固定已浸润样本的方法 拟南芥 用于延时成像的叶片 (A) 拍摄的图像 拟南芥 将接种叶片下方固定载玻片的植株放置好。浸润过的叶片位于载玻片中央。双头箭头指示塑料胶带间隔物的长度。B塑料胶带垫片和桥接片的制备。将双层塑料胶带裁剪成两片（1 和 2），用作垫片；另取一片（3，以红色虚线标出轮廓）裁剪制备桥接片。双箭头的长度与（中双箭头的长度几乎相同A）。用箭头标示的1号和2号片段的四个角之一被剪去。C使用精细镊子将两片双层塑料胶带（编号为1和2）沿叶柄小心地粘贴到载玻片上，避免直接接触叶柄和叶片。D）另一段双层塑料胶带（编号为3），由（B），放置在两个基部垫片（1 和 2）上，以在叶柄上方形成桥接结构，同时确保在箭头所示位置处，叶柄未被夹在胶带 1 和 2 之间。E) 图示用胶带固定的叶柄。需要注意的是，在箭头所示位置，切勿将植物组织直接夹在塑料胶带之间。F) 将一小片手术胶带（编号为4）轻轻粘贴在载玻片上叶片尖端周围。仅虚线红框标示的区域被牢固地压在载玻片上。G另一小片手术胶带（编号为5）被轻轻粘贴在叶柄与塑料胶带片的交界处。仅按压虚线红框标示的区域，以将叶柄轻柔地固定在载玻片和塑料胶带片上。H使用两个一次性移液器吸头插入土壤中的适当位置，以防止相邻叶片进入体视显微镜的视野。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：使用该方法的代表性结果 拟南芥 叶片固定方法 (A荧光体视显微镜图像，来自转基因个体 拟南芥 叶片（pPR1-YFP-NLS 植株）。将叶片的一部分用 Pst_a2 (108 CFU/mL）接种于其背面，并在接种后22小时（hpi）拍摄图像。其中细胞核的 pPR1 使用YFP滤光片检测启动子的激活，通过Texas Red（TXR）滤光片根据叶绿素自发荧光的丧失来检测程序性细胞死亡（PCD）。比例尺 = 2.5 mm。B) 从采用本方案获得的800张图像中选取的若干时间序列图像。这些数据提供了 体内 时空动态概述 pPR1 40 hpi 时的活性。显示的是 YFP 与 TXR 图像的合并结果。比例尺 = 2.5 mm。（C) 转基因叶片的对照侵染（pPR1-YFP-NLS 植株）。在对照侵染中，使用 10 mM MgCl₂2 从叶片的远轴面进行渗透，随后进行延时成像。对照处理未引起异位表达 pPR1 活性，且在13 hpi时未干扰叶绿素的自发荧光。箭头指示模拟侵染的位置。比例尺 = 2.5 mm. 这些图像经修改自先前的一项研究9. 请点击此处以查看此图的放大版本。
表 1：本研究中使用的延时成像程序。
补充视频 1：时间推移视频，显示在由Pst_a2接种诱导的效应子触发免疫（ETI）后，转基因拟南芥叶片中pPR1激活的时空动态。 携带pPR1-YFP-NLS构建体的转基因叶片的远轴面部分用Pst_a2（108 CFU/mL）进行浸润。图像以每3分钟一次的频率采集，共持续40小时。显示的时间戳格式为dd:hh:mm:ss.sss。本视频改编自先前的研究9。 请点击此处观看该视频。（右键单击可下载。）
讨论
本文报道了一种简单的方法，用于将表达荧光报告基因的活体Arabidopsis叶片固定在载片上，该报告基因受特定启动子调控，可用于自动化荧光体视显微镜下的长期观察。荧光报告基因的时间序列成像通常在根组织中进行；然而，在叶片组织中开展的类似研究却极为有限。这很可能是因为叶片在空间中能够自由移动，而根则通常埋藏于固体琼脂培养基中并被固定。
在本报告中，我们重点关注由Pst_a2诱导的ETI过程中pPR1活性的时空动态。除了上述对叶片的轻柔固定外，清晰地可视化诸如启动子激活和PCD等细胞事件的时空动态也至关重要。如果显示pPR1活性的细胞与发生PCD的细胞之间的界限不清晰，需确保浸润区域内的所有细胞间隙均完全充满病原菌悬浮液（参见步骤2.4）。这一点在使用宽场荧光体视显微镜时尤为关键，因为此类显微镜会捕获样本在同一垂直位置上所有可检测到的信号。位于PCD区域细胞上方或下方的存活细胞所产生的叶绿素自发荧光很容易掩盖不具自发荧光的死亡细胞，YFP信号同样如此。
为了建立延时成像的实验条件，需要在不同实验条件下进行多次预实验以优化参数。延时成像的参数取决于多种因素，例如显微系统、转基因植物材料以及病原菌种类。 为确定这些参数，我们首先分析了在接种后7小时（hpi）时，浸润叶片中YFP荧光信号强度随不同曝光时间的变化情况，此时点几乎与pPR1启动子的初始激活时间一致。结果表明，使用本研究中的体视荧光显微镜，5秒的曝光时间适合捕获YFP信号。我们同样对叶绿素自发荧光的成像条件进行了测试。在延时成像程序中，设定每3分钟对样品进行一次光照成像，其中明场成像采用最大允许曝光时间。我们的系统（材料表）在完成YFP、TXR和明场成像后，尚可额外提供2.5分钟的时间。这一时间限制是选择3分钟间隔的主要原因。随后，我们确认该延时成像条件不会对植物样品造成明显损伤，也不会诱导pPR1发生异位的光胁迫相关激活（图3B,C）。基于上述结果，最终确定了本研究中所使用的成像程序。因此，每3分钟进行一次荧光成像被认为足以有效捕捉Pst_a2介导的ETI过程中pPR1的动态变化9。
启动子-报告基因载体，尤其是带有与核定位信号（NLS）融合的荧光报告蛋白的载体，已被多个研究团队广泛使用，并且在科研界易于获得；我们采用了Kubo et al.13发表的载体。因此，只要具备合适的转基因植株，本文所述的实验方案可应用于任何针对叶片组织的植物生物学研究。我们这一简单易行的实验流程为希望分析叶片中任何生物学事件时空动态（例如免疫反应）的研究人员提供了极佳的机会。使用胶带片段的方法可能会对样品造成轻微的物理胁迫，这是可能的。然而，通过在实验中设置适当的阳性和阴性对照（如模拟处理），可以有效控制这一问题（图3C）。通过在不同条件下分析这些对照，还可进一步修改和优化实验条件。
近年来，成像仪器与技术的快速发展激发了研究人员对生物事件复杂时空特征的研究兴趣。在任何成像分析中，样本的适当固定与封片都是最为关键的问题之一。一种简单且通用的活体样本封片方法 拟南芥 本研究中开发的叶片可应用于多种成像实验，并可进一步优化。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由日本科学技术振兴机构（JST）[PRESTO117665（授予 S.B.），ERATOJPMJER1502（授予 N.N.）] 和日本学术振兴会（JSPS）（科研启动基金 [22880008（授予 S.B.）] 及青年科学家基金 B [23780040（授予 S.B.）]）提供资助。我们感谢 A. Senzaki、Y. Suzuki、Y. Sugisawa 和 E. Betsuyaku 提供出色的技术支持，感谢 J. Parker 提供 Pst_a2 菌株，感谢 T. Demura 提供 pBGYN 载体。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bacto 琼脂 | BD 生物科学 | 214010 | |
| Bacto蛋白胨No. 3 | BD生物科学 | 211693 | |
| 酵母提取物（Bacto） | BD生物科学 | 212750 | |
| BM2 土壤 | Berger | ||
| 甘油 | nacalai tesque | 17017-35 | |
| 硫酸卡那霉素 | 和光 | 113-00343 | |
| Leica M205FA 配备 DFC365FX、LED_MCI 和 Leica EL6000（由 Las X 软件调控） | 徕卡显微系统 | 已安装黄色荧光蛋白（YFP）和德克萨斯红（TXR）滤光片 | |
| 六水合氯化镁 | 和光 | 135-00165 | |
| 显微载玻片（尺寸：76 mm × 26 毫米，厚度：1.0–1.2 mm | MATSUNAMI | S1112 | |
| 微孔手术胶带（1.25 cm） × 9 m | 3M | 1530-0 | |
| 无针式1 ml塑料注射器 | Terumo | SS-01T | |
| 塑料细胞插片培养盘（细胞孔尺寸：44 mm） × 44毫米 × 44 mm | Tanaka sangyo，日本 | htray-bk72 | 任何 可使用细胞大小相似的培养皿 |
| 利福平 | nacalai tesque | 30259-81 | |
| 塑料胶带（0.2 mm 厚） × 19 mm 宽 × 10 米长 | 山本 | No0200-19-1 | 任何带有塑料/乙烯基胶带的 可使用相似厚度的材料 |
参考文献
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