利用离体叶片实验简化马铃薯在咀嚼式昆虫烟草天蛾（Manduca sexta）侵染期间的基因表达研究

摘要

本方法通过将烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫接种于马铃薯离体叶片，制备出具有自然植食性昆虫取食损伤的植物组织。随后检测该植物组织中六个转录因子同源基因在昆虫取食早期响应中的表达情况。

摘要

昆虫食草作用的基因表达研究具有多营养级特性，需要大量生物学重复，因而要求建立更简单、更高效的食草作用实验方案。通常在整株植物系统中研究咀嚼式昆虫造成的扰动。尽管这种全生物策略较为常用，但如果能在单个离体叶片中重现类似观察结果，则并非必须采用整株系统。其基本假设是，叶片自身即含有信号转导所需的基本组分。对于信号转导的早期事件而言，细胞只需接收来自扰动的信号，并将该信号传递给邻近细胞，随后检测这些邻近细胞的基因表达情况。

该方法仅改变了离体叶片的分离时机。在整株植物实验中，幼虫被限制在单个叶片上，随后该叶片从植株上分离，并用于基因表达分析。如果将分离顺序颠倒，即在离体实验中将分离步骤由整株实验中的最后一步变为第一步，则可简化取食实验的操作流程。

Solanum tuberosum var. Kennebec 可通过简单的组织培养基进行节段转移繁殖，必要时可进一步移栽至土壤中继续生长。从母株上切取叶片并转移至培养皿中，用于与烟草天蛾（M. sexta）幼虫进行取食实验。受损的叶片组织可用于检测信号转导过程中相对较早事件的表达情况。基因表达分析鉴定出与虫害特异性相关的Cys2-His2（C2H2）型转录因子，证实了利用离体叶片研究早期响应过程的可行性。该方法相比整株植物接种更为简便，且占用空间更少。

引言

植食性昆虫取食会引发一系列分子事件，使植物能够识别攻击并启动适当的防御反应以维持生存。植物从咀嚼类昆虫处接收到两种基本信号：一种来自组织受到的物理损伤，另一种来自昆虫特有的物质。组织因幼虫口器造成损伤后，会释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而触发明确的伤口反应，导致茉莉酸激素水平升高以及防御基因的转录¹。其中最著名的DAMP之一是系统素（systemin），它是一种多肽，由叶片受伤后前体蛋白prosystemin切割产生^2,3。茉莉酸介导的伤口反应进一步受到植食性昆虫相关分子模式（HAMPs）的调控，这些分子可来源于鳞翅目幼虫的唾液、肠道内容物（反吐物）和粪便（frass）⁴。昆虫利用这些物质来增强或逃避植物的防御反应⁵。随后，转录因子通过调控下游防御基因的表达，将激素信号传递至防御反应通路中^6,7,8。

一些在实验室环境中开展的植物-昆虫互作研究采用模拟方法，旨在近似昆虫的自然取食方式。模拟食草损伤通常通过使用各种工具对植物组织造成人工损伤来实现，这些工具可模拟昆虫口器的特定取食机制，足以诱导损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，并触发防御基因的表达。为了模拟昆虫特异性成分的作用，常会添加口腔分泌物或反吐物，以复制伤害相关分子模式（HAMPs）的贡献^9,10,11。这类研究的一个优势在于能够制造特定大小和类型的伤口，并精确施加定量的HAMPs，从而获得更可重复的实验结果。而在自然食草损伤研究中，植物组织的损伤由野外采集或实验室饲养的昆虫直接取食造成，通常更具挑战性，因为伤口大小和HAMPs的施加量受昆虫行为影响，增加了实验数据的变异性。自然取食与模拟取食方法各自的优缺点在文献中已有广泛讨论^12,13,14。

为了研究转录因子等早期信号事件，必须在相对较短的时间内取食一定比例的叶片，因此幼虫必须立即开始啃食，并持续取食直至叶片被冷冻用于分析。M. sexta 在多个幼虫阶段均会大量取食多种茄科植物，使其能够在相对较短时间内造成最大程度的取食损伤¹⁵。这在研究植物早期信号响应时尤为便利，因为植物的响应几乎在昆虫接触叶片表面后即刻发生^16,17。常用的夹式笼固定方法操作不便，因为在实验过程中需要不断调整多个笼子，以实现幼虫的移除或添加。同时，叶片必须足够大且足够坚韧，以支撑多只昆虫同时取食。这类马铃薯植株需要较大的空间才能进行取食观察。幼虫常会移动至叶片的背面，这使得取食行为的观察变得十分困难。因此，使用整株植物进行此类实验显然十分繁琐。

本研究采用在培养皿中分离的离体叶片，而非整株植物，以简化研究食草动物取食作用的整体植株方法。本实验方案的应用仅限于观察马铃薯叶片在烟草天蛾（M. sexta）幼虫取食损伤后早期诱导的一组C2H2转录因子。

方案

注意：以下实验方案设计为由一人完成设置、观察和样品采集。可将相同设置的多次运行合并，以增加生物学重复。任何额外的实验重复均应在每天同一时间进行设置，以消除基因表达可能受到的昼夜节律影响。本方案设计为针对5个不同的采收时间点，每个时间点制备3片“受侵染”叶片。每个时间点配备相应的对照叶片，共获得30个样品。实验可采用不同大小的叶片和不同龄期的幼虫，但建议在整个实验过程中保持叶片大小、幼虫龄期和侵染时间一致。

1. 马铃薯植株的准备

注意：所有需要无菌操作的步骤均须在组织培养罩内进行^18,19。

1. 从外植体来源制备Kennebec苗株。
   1. 准备扩增培养基。
      1. 在2 L的烧瓶中加入4.43 g含维生素的Murashige和Skoog（MS）培养基粉末、20 g蔗糖、2 g琼脂替代物及1 L经反渗透（RO）纯化的水，并放入磁力搅拌子。将烧瓶置于搅拌器上混合。持续搅拌条件下，用NaOH调节pH至5.8。
         注意：琼脂在高压灭菌前不会溶解。
      2. 加入1 mL防腐剂/杀菌剂，于液体循环条件下高压灭菌20分钟（121 °C，101.3 kPa）。灭菌程序结束后立即从高压灭菌器中取出培养基，并冷却至50 °C。在超净工作台内采用无菌操作技术，将100 mL无菌且已冷却的增殖培养基转移至无菌培养容器（如Magenta或Plantcon）中。
   2. 准备外植体材料。
      1. 获取Kennebec马铃薯种薯作为外植体来源，用自来水冲洗以去除所有土壤残留物₂O. 去除芽苗，并用无菌手术刀切成 2 cm 的片段。
      2. 将芽苗片段在70%乙醇中浸泡15秒进行表面消毒，随后在1:1漂白剂（1份反渗透水:1份浓缩杀菌级/商用漂白剂）中浸泡13分钟。用无菌水冲洗5次。₂O.
      3. 将外植体材料在超净工作台中用无菌操作技术转移至含有增殖培养基的无菌组织培养容器中。将培养容器转移至植物组织培养室，在24 °C、16小时光照（140 µmol·m⁻²·s⁻¹）、8小时黑暗条件下培养2‒3周，直至形成小植株。^-2·s^-1)/8 小时暗光周期。
2. 准备通过节段繁殖的组织培养马铃薯植株。
   1. 制备节点转移培养基。
      注意：此步骤可制备10个组织培养容器，可于当日使用，也可提前制备后于4 °C保存，直至进行节段转移。
      1. 在2 L的烧瓶中，将36.43 g营养琼脂混合物加入1 L反渗透纯化水中，并放入搅拌子。将烧瓶置于搅拌台上混合，同时持续搅拌，用KOH调节pH至5.8。
         注意：琼脂在高压灭菌前不会溶解。
      2. 在液体循环中高压灭菌20分钟（121 °C，101.3 kPa）。灭菌程序结束后立即从高压灭菌器中取出培养基，并冷却至50 °C。将100 mL无菌冷却的节段转移培养基转移至无菌培养容器中（参见 材料表使用无菌技术在组织培养罩内进行。
   2. 制备节段插条。
      1. 获取由外植体材料培养而成的肯尼贝克（Kennebec）苗株（于步骤1.1.2中制备）。苗株应具有至少3至4个节（分枝点）。使用无菌剪刀或解剖刀去除叶片。在靠近主茎处切割分枝，保留约2 mm的分枝组织。
      2. 从茎上剪取节段时，在每个分枝点或节的上下方约2 mm处进行切割。将节段插条按与前一个容器中相同的方向（分枝朝上）排列于含有节段转移培养基（步骤1.2.1.2制备）的无菌组织培养容器中。
      3. 将带有节段插条的容器转移至植物组织培养室，在24 °C、16小时光照（140 µmol·m⁻²·s⁻¹）、8小时黑暗条件下培养2‒3周。^-2·s^-1)/8 小时暗光周期。
         注意：每个节段切口均可发育成一株新植株。每瓶中接种的切段数量决定叶片大小，每瓶接种较少切段可获得较大叶片。每瓶接种3株时，2至3周后叶片大小约为15 mm × 20 mm。
3. （可选）准备种植于土壤中的Kennebec马铃薯植株。
   注意：为了获得更大的叶片，可将节段繁殖的马铃薯植株移栽至土壤中。
   1. 将继代培养基中生长的马铃薯苗轻轻从培养基中拔出，直至根部组织完全脱离琼脂，然后移栽至土壤中。
   2. 将幼苗移栽至土壤中，深度以根部上方第一个节位略高于土面为宜，并轻轻压实植株周围的土壤。轻柔浇水，确保土壤与根系充分接触。
   3. 置于光照培养箱中，16小时光照（140 µmol·m⁻²·s⁻¹），8小时黑暗，持续7天^-2·s^-18小时光照/16小时黑暗光周期，25/20 °C 昼/夜温度。
      注意：当顶部两片完全展开的叶片达到适合检测的大小时，植物即可用于实验。
4. （可选）准备块茎繁殖的马铃薯植株。
   注意：使用块茎种植的马铃薯植株体型更大、更健壮，若需在植株上饲养幼虫或进行过夜幼虫取食，此种植株可能更为适用。
   1. 将一个马铃薯块茎种植于装有土壤混合物的10英寸花盆中，深度为6英寸，并添加10 mL颗粒状缓释肥料。
   2. 置于光照培养箱中，16小时光照（140 µmol·m^-2·s^-1)/8小时黑暗光周期和25/20 °C昼/夜温度。自块茎种植后约30‒40天，植株即可准备就绪。
      注意：不要使用已经开始开花的植株。

2. 准备用于饲喂的昆虫

1. 获取所需龄期的 M. sexta 幼虫。
   注：本研究中幼虫在人工饲料上饲养至五龄幼虫期²⁰，并由本单位昆虫饲养室有经验的人员进行龄期鉴定。幼虫也可部分或完全在植物组织上饲养。幼虫在蜕皮前通常不进食，而在蜕皮后最有可能开始取食，因此准确的龄期判定非常重要²¹。
2. 根据幼虫大小，将幼虫转移至合适的 containment 容器中（例如 6 孔、12 孔或 24 孔细胞培养板），每孔放置一只幼虫。
   注：若无食物来源，幼虫可能表现出领地性或同类相食行为，共同饲养时易造成损伤。
3. （可选）饥饿处理幼虫最多 2 小时，此操作可能有助于提高幼虫摄食效率。
   注：此期间幼虫应置于生长培养箱内的 containment 容器中。

3. 虫害实验的组件设置

注意：见图1中的示意图总结。

1. 为每个采收时间点制作放置模板。
   注意：为每个采收时间点准备5个不同的托盘会很有帮助。这样可以保持样品有序，并允许整套培养皿作为一个整体更高效地移动，而不改变其排列方式。如果需要进行损伤百分比计算，则此步骤至关重要，因为侵染前和侵染后的图像必须在相同的焦距下拍摄。
   1. 准备5个坚固的托盘，每个托盘能够容纳一组六个合适尺寸的培养皿，并在托盘内铺上白纸。
      注意：培养皿的尺寸取决于取食实验所选用的叶片大小。叶片应能轻松放入培养皿中，且不接触皿壁。例如，60 mm × 15 mm 的培养皿适用于长度或宽度不超过 50 mm 的叶片。
   2. 使用合适尺寸的培养皿在每个托盘的纸上描出六组圆形。将其中三组圆形标记为“对照”A、B 和 C，另外三组标记为“侵染”A、B 和 C。同时在每个放置模板上标注相应的采收时间点。
2. （可选）设置相机用于拍摄“侵染前”和“侵染后”的图像。
   1. 将相机固定在支架上，调整至适合拍摄放置模板中所有培养皿图像的焦距。
3. 标记采收时间点对应的离心管。
   1. 准备一组30个1.7 mL 微量离心管，分别对应放置模板中的每个圆形位置。在管壁上清晰标注处理类型（对照/侵染）、植物重复编号（A、B 或 C）以及采收时间点（侵染后分钟数）。
4. 准备步骤 3.1.1 中选定的培养皿。
   1. 在步骤 3.1.1 中的30个培养皿中各放入一片无菌滤纸圆片，加入无菌水润湿滤纸；注意不要让过多水分积聚在培养皿底部。将每个培养皿分别放置于各个放置模板的六个圆形位置中。
   2. 在每个放置模板旁边放置三株马铃薯植株。确保所有植株的生长年龄和相对大小一致。

4. 进行寄生

注意：每次仅设置一个收获时间点/放置模板。

1. 使用无菌剪刀从每株植物上取下顶部两片大小匹配的叶片，并将其中一片放入对照培养皿中，另一片放入已接种的培养皿中（A、B 和 C 每株植物各一片）。该操作应尽快完成。
2. （可选）将放置模板转移至相机支架，以拍摄“接种前”图像。
3. 使用轻触镊子尽快将幼虫转移至每个接种培养皿中。设定所需的“接种时间”计时器。
   注意：幼虫取食叶片组织的时间段即为“接种时间”。该时间可通过在正式接种前使用少量测试叶片/幼虫进行预实验经验性确定。所有接种叶片的“接种时间”应保持一致。
   注意：应使用轻触镊子小心操作幼虫。2 至 4 龄幼虫可轻轻夹住其尾角或中段进行操作。
4. 观察取食情况，确保所有幼虫均在进食。应根据幼虫的取食行为决定是否添加或移除幼虫。应尽可能保持培养皿盖处于盖合状态。
   注意：每片叶片可使用多只幼虫。
5. 在接种时间结束时，将幼虫从叶片上移除，并开始计时收获时间。
6. （可选）将放置模板转移至相机支架，以拍摄“接种后”图像。
   注意：放置模板中的全部六片叶片均应在指定的收获时间统一收获。

5. 采集叶片

1. 在每次采收时间点结束时，将每片叶片转移至相应标记的试管中，并立即将试管浸入液氮（N₂）中进行速冻。将采集的植物组织于 -80 °C 保存，直至进行 RNA 提取。
2. 针对每个采收时间点，重复步骤 4‒5.1。

6. 基因表达分析用叶片组织的处理

1. 使用微型研钵将冷冻的叶片组织研磨成粉末。
2. 提取总RNA，并按照先前所述方法进行基因表达分析²²。

7. （可选）估算叶片损伤

1. 通过目测估计叶片受损百分比，或通过虫害前后图像计算叶片面积。
2. 使用软件工具测量叶片面积（例如 Phenophyte）²³。
3. 根据叶片面积测量结果，按以下公式计算受损百分比：
   % 受损 = [(虫害前叶片面积 – 虫害后叶片面积) / 虫害前叶片面积] × 100。

结果

取食叶片的情况决定了实验方案的成败。健康且发育阶段准确的幼虫在被放置于叶片表面后应立即开始取食，并在整个接虫期间保持相对稳定的取食行为。视频1中，上方的幼虫在放置后立即开始啃食，并在取食过程中保持稳定的速率。如果需要检测接虫后早期的基因表达变化，这一点尤为重要。而下方的幼虫未取食任何叶片组织，属于接虫失败的实例。

在取食过程中通过视觉估算叶片消耗情况，以确保产生足够的取食损伤。可通过采集植株受害前后叶片的图像，计算叶片组织被取食的比例，从而量化取食量。图2展示了不同发育阶段的烟草天蛾（M. sexta）幼虫在不同类型马铃薯植株上取食速率的差异。图2A中的叶片取自2周龄的节点繁殖组织培养植株。该图中所有叶片大小相同，但分别由不同发育阶段的幼虫在5分钟内进行取食。

讨论

采用现有的整株植物取食方法对于实现本研究的特定目标（即筛选一组候选基因对虫害的响应）而言并非必要。使用离体叶片改良方法的明显优势在于缩短了取食实验所需的时间。该方法消除了使用夹式笼具处理整株植物时操作不便的问题，并且由于仅需两周龄的幼苗即可采收叶片，实验能够更早开展。此外，该方法在取食过程中占用空间更小，所需生长室空间也更少；当这些资源有限时，这两点尤为重要。

该实验方法的局限性在于取样时可能导致的叶片脱离问题，尤其是在检测防御基因表达时会遇到这一情况。脱离本身会引发伤口响应，因此有必要评估脱离对防御基因基础表达水平的影响。在一项模拟植食性昆虫取食的研究中，已知的防御基因蛋白酶抑制剂II(PIN2)在脱离的马铃薯叶片对照组中的转录水平意外地升高，这很可能是由于"叶片采集过程中造成的伤口"²⁵所致。然而，施加来自M. sexta的昆虫口腔分泌物显著增强了PIN2基因的表达水平。这说明必须设置适当的对照，以区分脱离所引起的效应与虫害响应之间的差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂替代物	PhytoTechnology Laboratories	G3251	产品为 Gelzan
培养容器（6、12 或 24 孔板）	Fisher Scientific	08-772-49, 08-772-50, 08-72-51	许多其他公司也销售此类产品
烟草天蛾卵	Carolina Biological Supply Company	143880	30–50 枚卵
烟草天蛾卵	Great Lakes Hornworm	NA	50、100、250 或 500 枚卵
烟草天蛾幼虫	Carolina Biological Supply Company	具体龄期请电话咨询	任意龄期
烟草天蛾幼虫	Great Lakes Hornworm	具体龄期请电话咨询	任意龄期
微量离心管，1.7 ml	Thomas Scientific	1158R22	已测试可在液氮中使用，不会爆炸
含维生素的 Murashige & Skoog (MS) 基础培养基	PhytoTechnology Laboratories	M519	用于配制增殖培养基
营养琼脂混合物	PhytoTechnology Laboratories	M5825	产品为含维生素、蔗糖和 Gelzan 的 Murashige & Skoog 基础培养基
滤纸片	Fisher Scientific	09-805A	Whatman 圆片——购买时需适配培养皿尺寸
培养皿，60×15 mm 或 100×15 mm	Fisher Scientific	FB0875713A 或 FB0875712	根据叶片大小选择合适尺寸
马铃薯块茎	任意来源	B 级（非有机）	建议选用 Maine Farmer’s Exchange
花盆，10"	Griffin Greenhouse Supplies, Inc.	41PT1000CN2
防腐剂/杀菌剂	Plant Cell Technology	NA	产品为 PPM（植物防腐剂混合物）
用于外植体来源的种薯	任意来源	B 级（非有机）	建议选用 Maine Farmer’s Exchange
缓释肥料（14-14-14）	任意品牌	NA	Osmocote 是常用品牌
软头镊子	BioQuip	4750
土壤混合物	Griffin Greenhouse Supplies, Inc.	65-51121	产品为 Sunshine LC1 混合土
无菌培养容器	PhytoTechnology Laboratories	C2100	Maganta 型容器，PTL-100
无菌培养容器	Fisher Scientific	ICN2672206	产品为 MP Biomedicals Plantcon