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高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

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DOI：

10.3791/59156

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2019年3月19日

 ,  , 
1Electron Microscopy Core Unit, Max Planck Institute of Experimental Medicine, 2Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB)

本文内容

摘要

本文介绍了一种结合两种样品处理技术的实验方案：高压冷冻与微波辅助样品处理，随后进行极小树脂包埋，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）获取数据。本方法以小鼠胫神经样品和Caenorhabditis elegans为例进行了演示。

摘要

本描述的样品制备技术旨在将超微结构保存的最佳质量与聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）成像模式所需的最适对比度相结合，以获取用于三维重建和建模的连续图像序列。高压冷冻（HPF）可实现接近天然状态的结构保存，但后续的冷冻置换往往无法提供足够的对比度，尤其是对于较大尺寸的样品，而这类样品在需要用于三维重建的高质量SEM成像时是必需的。因此，在本方案中，冷冻置换之后在室温下进行额外的染色增强步骤。尽管这些步骤在微波处理仪中完成，但也可采用传统的台面处理方法，后者需要更长的孵育时间。随后使用极少量树脂包埋，有助于在FIB-SEM中实现更快且更精确的靶向定位与制样。该方案特别适用于那些需要通过高压冷冻来可靠保存超微结构、但在冷冻置换过程中未能获得足够对比度以进行FIB-SEM体积成像的样品。结合极小量树脂包埋，本方案为高质量体积数据的获取提供了一条高效的实验流程。

引言

高压冷冻是获得高质量超微结构保存的首选样品制备方法，相较于使用化学固定的常规制备方法，该技术能更真实地反映样品的天然状态1。这种冷冻制备方法适用于如髓鞘化的小鼠组织2等样品，并且是模式生物 Caenorhabditis elegans3 所必须采用的技术。经过冷冻置换和树脂包埋后，这些样品通常通过透射电子显微镜（TEM）或电子断层扫描（ET）进行分析。如果需要利用FIB-SEM或连续块面成像对较大体积进行高分辨率的大规模三维重建，则在实际操作中，我们发现由于对比度不足，常会阻碍SEM的正常成像。在FIB-SEM中，图像通常通过检测来自初级电子束的背散射电子来获取。背散射电子的产率与样品中重金属含量成正比。因此，为提高体积成像的对比度，已专门设计出通过额外重金属浸渍增强对比度的实验方案。这类方法基于化学固定的样品，采用四氧化锇-硫代碳酰肼-四氧化锇的组合染色法4，如Knott等人5针对连续块面成像和聚焦离子束扫描电子显微镜所描述的方法。包括使用甲酰胺和没食子酸6或天冬氨酸铅7在内的多种改良方法，已成功应用于不同的成像技术。

本方案结合了高压冷冻（HPF）和冷冻置换技术对样品进行冷冻制备，随后采用微波辅助处理，在室温下使用丙酮中的硫代碳酰肼/四氧化锇以增强对比度。我们以小鼠有髓鞘的胫神经和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为例进行演示，这些样品需要通过高压冷冻来实现高质量的超微结构保存。此外，本文还展示了在脱水和渗透处理后，如何用尽可能少的树脂对样品进行包埋。这种最小量树脂包埋8有助于更快地定位目标结构，缩短样品处理时间，包括减少离子束暴露目标区域所需的时间。在显微镜内完成进一步的样品制备步骤后，连续进行样品的成像与切削，以获取一系列图像堆栈。对于三维可视化，使用图像处理软件（IMOD）对数据集的部分内容进行重建。

本工作流程描述了如何将最适合体积成像的样品对比方法与通过高压冷冻（HPF）和冷冻置换实现的最佳超微结构保存效果相结合。该方法适用于必须进行冷冻制备的样品。其应用范围仅限于可通过高压冷冻制备的小型样品。对于不同性质的样品，如植物材料或微生物，本方案需要相应调整。

方案

本研究所涉及的所有动物实验均已获得机构动物护理委员会以及下萨克森州消费者保护与食品安全局（LAVES）的批准。

1. 高压冷冻与冷冻置换

  1. 从小鼠（例如 C57Bl6N，12 周龄，雌性）中分离坐骨神经的胫神经分支9.
  2. 将坐骨神经浸入含有20%聚乙烯吡咯烷酮（1 g PVP溶于5 mL磷酸盐缓冲液PBS）的液滴中，切成2 mm长的小段。然后用精细镊子将其放入金属样品载具（A型，深度0.2 mm）中。另取一个涂有薄层十六烷的平面载具（B型）作为盖子盖上，将此组装体插入样品盒中。
  3. 转移数个 秀丽隐杆线虫 悬浮于含20%牛血清白蛋白（BSA）的M9溶液液滴中（参见 材料表用一次性塑料移液管将样品加入金属载体（A型）中，然后将第二个载体作为盖子置于其上（B型），组装成完整的 cartridge。
  4. 对于两个样品均按以下步骤操作：将样品载体组件逐个装入高压冷冻机装载站的三件式卡匣中，然后按照制造商的操作说明按下运行按钮，进行高压冷冻。
    注意：后续的冷冻置换步骤中可同时处理这两类样品。
  5. 将样品放入含有2 mL冷冻的0.1%单宁酸丙酮溶液的冻存管中。在液氮浴中进行转移操作，注意避免将液氮溅入冻存管内。随后将冻存管转移至自动冷冻置换仪中10 设定为 -90 °C 并启动程序。
    注意：样品在 -90 °C 下保存 100 小时。在四氧化锇处理前使用单宁酸作为媒染剂，以增强四氧化锇的摄取。11.
  6. 在冷冻置换装置中，于 -90 °C 条件下，用 2 mL 丙酮手动清洗样品，每次 30 分钟，共清洗 3 次。
  7. 将样品置于含有2%四氧化锇和0.1%醋酸铀的2 mL丙酮溶液中，在自动冷冻置换仪中于-90 °C继续染色7小时。
    警告：四氧化锇具有毒性，应在通风橱中操作，并佩戴防护装备。
    注意：冷冻置换仪以每小时5 °C的速率自动将温度升至-20 °C。样品在冷冻置换仪中于-20 °C下保持16小时。随后温度将以每小时10 °C的速率自动升至4 °C。
  8. 当温度降至 4 °C 时，将四氧化锇溶液更换为纯丙酮。从冷冻置换仪中取出冻存管。

2. 微波辅助处理

注意：使用温控装置在室温下进行以下所有步骤12，以保持温度稳定（参见材料表）。

  1. 在微波处理过程中保持反应管的管盖打开。
  2. 从冻存管中取出金属样品载体，并使用精细镊子或针头将样品从金属载体上取下，同时将样品保持在表面皿（150 mm）中的丙酮液体中。
  3. 使用精细镊子或移液器将样品转移至2 mL反应管中，加入1 mL丙酮，在250 W条件下洗涤4次，每次40秒。
    警告：硫代碳酰肼具有毒性，应在通风橱中操作，并佩戴防护装备。
  4. 使用1 mL含1%硫代碳酰肼的丙酮溶液对样品染色，在150 W条件下处理14分钟以增强对比度。染色操作步骤如下：将硫代碳酰肼溶液用移液器加入反应管中，将反应管放入微波炉，设置程序为150 W功率（开启真空功能），运行2分钟，关闭2分钟，循环至总时长14分钟。启动微波炉。
    注：硫代碳酰肼会与冷冻置换过程中施加的四氧化锇发生反应，形成桥接结构，从而允许更多四氧化锇沉积到原有的四氧化锇结合位点上13。
  5. 用1 mL丙酮在250 W条件下洗涤样品4次，每次40秒。将丙酮移入反应管，将反应管放入微波炉，选择250 W功率，运行40秒。启动微波炉。
  6. 使用1 mL含2%四氧化锇的丙酮溶液在150 W条件下染色14分钟。将四氧化锇溶液用移液器加入反应管中，将反应管放入微波炉，设置程序为150 W功率（开启真空功能），运行2分钟，关闭2分钟，循环至总时长14分钟。启动微波炉。
  7. 用1 mL丙酮在250 W条件下洗涤样品4次，每次40秒（操作同步骤2.5）。
  8. 使用1 mL丙酮中逐步增加浓度的树脂溶液（见材料表）进行渗透处理，浓度依次为25%、50%、75%、90%、100%和100%，每次3分钟，250 W条件下进行。将树脂溶液移入反应管，将反应管放入微波炉，设置程序为250 W功率（开启真空功能），运行3分钟。启动微波炉。

3. 最小树脂包埋8

  1. 用牙签从反应管中取出坐骨神经和 C. elegans，并将其放置在一片塑料膜上（参见材料表）。
  2. 使用牙签在塑料膜上轻轻推动样品，直至检测不到残留的树脂。使用卤素灯加热（参见材料表），使树脂黏度降低，从而更易于去除。将卤素灯放置在足够近的位置以加热树脂（注意避免烫伤手）。
  3. 将样品置于烘箱内的塑料膜上，在 60 °C 下至少聚合 48 小时。

4. 聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）的制备

  1. 使用剃刀将聚合后的样品连同塑料薄膜一起切割成适合 SEM 样品台的尺寸，然后使用导电银胶将其固定在 SEM 样品台上（参见 材料表）。在 60 °C 下再次聚合至少 4 小时或过夜。
  2. 使用溅射镀膜仪在 SEM 样品台上对样品进行镀金处理，条件为 35 mA 下持续 1 分钟（也可使用铂/钯，10 nm 厚的涂层已足够），然后将样品放入 FIB-SEM 中。

5. 在FIB-SEM内进行数据采集

  1. 使用驱动显微镜的基本软件和二次电子探测器对样品进行成像（参见材料表）。应调整样品方向，使感兴趣区域（例如胫神经的中段或C. elegans）位于视野范围内。
    注意：为进行数据采集，将样品台倾斜至适当工作距离（5 mm）下，使样品表面与离子束成90°角，即所谓的离子束与电子束重合点位置。使用本仪器时，该位置对应于样品台倾斜54°且工作距离为5 mm。
  2. 为设定样品的正确位置，先在0°倾角下使用二次电子探测器成像，并将一个共同特征居中。然后缓慢倾斜至54°（依次为5°、20°、54°），每次倾斜后通过移动M轴重新将同一物体居中。
  3. 在54°倾角下使用二次电子探测器成像，将某一特征居中；随后切换至聚焦离子束（FIB）模式，将该特征移至中心位置，以确定重合点。可通过在扫描电镜（SEM）软件中显示十字线来指示中心位置。首先使用SEM软件的居中功能，将选定的样品特征移至图像区域中心；然后通过调节Z轴移动样品台，使特征在y轴方向上居中。FIB与SEM之间的任何最终偏移均通过SEM束流偏移进行校正。
  4. 打开高级软件（参见材料表）以记录三维数据集，并逐步按照软件向导操作。
  5. 在感兴趣区域（ROI）表面使用3 nA电流沉积碳或铂（400 nm），以实现均匀切削并减少由电荷积累引起的伪影。
    注意：通过在FIB成像的样品表面绘制待切削区域（设定宽度、高度、深度），软件可自动计算并叠加不同样品制备结构的尺寸，例如待铣削的沟槽或铂/碳沉积区域。同时需注意避免使用过高的FIB电流对样品表面成像，以免损伤样品表面；50 pA的电流已足够用于成像。
  6. 使用聚焦离子束以15/30 nA电流铣削沟槽，以暴露感兴趣区域（ROI）。
  7. 使用聚焦离子束以7 nA电流对截面进行抛光。
  8. 完成样品制备后，设置以下成像参数：在FIB设置选项卡中设定FIB切削参数（FIB切削电流）；在设置选项卡中设定SEM成像参数；在SEM AutoTune选项卡中设定图像调谐参数（每60分钟执行一次自动对焦和自动消像散，像素尺寸50 nm，停留时间3，线平均3）。针对每个样品优化上述参数。
  9. 为防止热漂移导致在采集过程中块面发生位移，开始采集前至少离开实验室2小时。
  10. 以700 pA的FIB电流，采用连续切削与采集模式获取数据集。使用1.5 kV（分析模式，900 V）的ESB探测器，栅极电压设为400 V，利用高级软件（参见材料表）采集每幅像素尺寸为5 nm、切片厚度为50 nm的图像。每次图像采集约耗时1.5分钟，停留时间为6 µs。
  11. 启动数据采集。首先在切削电流下获取一幅FIB图像，以确认样品未发生移动且正确选定了感兴趣区域。如有必要，进行调整。

6. 数据可视化

  1. 通过将包含所有图像的文件夹拖入 Fiji 中打开图像，并选择Virtual Stack。
  2. 使用矩形工具裁剪感兴趣区域（Image > Crop）。
  3. 反转数据以显示传统的透射电子显微镜对比度，使膜结构呈现为深色（Edit > Invert）。
  4. 使用 TrackEM214（Fiji15）进行图像配准。点击layer，将数据加载到 TrackEM2 中（File > New > TrackEM2）。加载所有图像后，使用多层拼接功能进行配准（右键点击Image > Align > Align multi-layer mosaic）。配准完成后，将图像导出为单独的 TIFF 文件（右键点击image > Export > Make flat image），选择所有需要导出的图像，然后选择save to file。
  5. 进行后期处理时，在 Fiji 中应用高斯模糊（Process > Filters > Gaussian blur；sigma 为 2）和局部对比度增强（Process > Enhance Local Contrast；CLAHE：blocksize 为 127，直方图 bins 为 256，最大斜率为 1.5），以平滑图像并提高信噪比。
  6. 使用 IMOD16 对感兴趣结构进行手动分割并在三维中可视化。在 IMOD 中打开数据集，选择Drawing tools（Special > Drawing Tools）进行手动分割。可使用不同的手动工具在整个体积中追踪感兴趣结构（例如 Join、Sculpt）。使用 Microscopy Image Browser（MIB17）进行半自动分割。

结果

该实验流程从将样品（此处为新鲜解剖的小鼠胫神经）放入金属载样杯中进行高压冷冻开始（图1a）。随后将载样杯从液氮中取出（图1b），并置于冷冻置换仪中，放置在已冻结的第一种化学试剂混合液上方（图1c）。经过包含2%四氧化锇和0.1%醋酸铀酰的长时间冷冻置换程序后，样品在室温下从载样杯中取出（图1d）。为进一步增强对比度，将样品转移至塑料管中，进行微波处理（图1e）。使用真空腔室和温度控制单元以优化处理过程（图1f）。

进行最小树脂包埋时，需要使用牙签和塑料薄膜片（图2a）。在利用微波将样品浸入树脂后，将样品置于塑料薄膜片上并移动，直至样品表面无残留树脂。使用卤素灯帮助排出残余树脂，使样品在塑料薄膜上实现最小程度的包埋（图2b）。应注意，从样品顶部去除的树脂越多越好，但样品底部仍需保留少量树脂，以确保样品与基底保持连接。将附着于塑料薄膜上的样品切割后，用银导电胶将其固定在扫描电镜样品台（SEM stub）上（图2c）。在60 °C条件下对样品台进行至少4小时的聚合（图2d）。各组分应充分混合，否则可能导致混合物无法正确聚合。为避免在扫描电子显微镜内产生电荷积累，需对样品台进行金或铂/钯溅射镀膜（图2e）。

将样品置于聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）中，使用二次电子探测器成像，以定位目标区域（图3a，e）。利用离子束去除目标区域前方的材料，暴露出一个横截面（图3b-d，3f-h）。标准方案通常存在膜对比度不足的问题（图3b，f），而优化后的方案则提供了显著增强的膜对比度（图3c-d，3g-h）。

采用图像处理与建模软件 IMOD 对（经后期处理后的）电镜数据进行可视化，以更好地理解其三维信息，可对数据进行虚拟切片（图4a）。数据集中的不同结构通过人工方式进行分割（图4b-d）。

静态平衡；实验装置；光谱系统；DNA分离；色谱管。
图1：高压冷冻、冷冻置换及微波辅助处理。 (a) 装有小鼠胫神经的样品载体，比例尺为3 mm。(b) 经高压冷冻后的小鼠胫神经样品载体，比例尺为3 mm。(c) 自动冷冻置换（AFS）装置及其样品。插图：定制金属容器，可容纳最多23个样品管以及两个盛放化学试剂的大管，置于AFS中。(d) 在丙酮中从载体取出样品的玻璃培养皿，比例尺为3 mm。(e) 将用于微波处理的样品置于反应管中。(f) 微波设备的真空室和温度控制单元。请点击此处查看该图的放大版本。

含有晶体样品的培养皿装置；用于SEM成像的显微结构分析制备。
图2：用于FIB-SEM的最小树脂包埋及样品制备。 (a) 用于最小树脂包埋的塑料薄膜和牙签，比例尺为4 cm。 (b) 置于塑料薄膜上方、已去除树脂的胫神经，比例尺为250 µm。 (c) 在塑料薄膜上聚合后的胫神经，经切割后用银导电胶粘附于SEM样品台，比例尺为250 µm。 (d) 在SEM样品台上聚合的样品，比例尺为3 mm。 (e) 在SEM样品台上镀金的样品，比例尺为3 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞结构的显微镜分析；展示细胞形态的扫描电镜和透射电镜横截面图像。
图3：在FIB-SEM中制备样品。 (a 和 e) FIB-SEM中样品表面的二次电子图像。(a) Nervus tibialis，比例尺为100 µm。(e) C. elegans，比例尺为2 µm。(b–d) 和 (f–h) 使用ESB探测器成像的样品横截面。(b 和 c) Nervus tibialis，比例尺为2 µm。(f 和 g) C. elegans，比例尺分别为1 µm和200 nm。(b 和 f) 显示的是高压冷冻后未经增强的冷冻置换结果，而其余图像均显示增强型冷冻置换的结果。(d 和 h) 使用ESB探测器获得的样品细节图像。(d) Nervus tibialis，比例尺为200 nm。(h) C. elegans，比例尺为200 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

三维电子显微镜图像；神经元分割、体积分析、解剖定位。
图4：图像采集与可视化。 (a) 在IMOD中显示的电镜数据，包含虚拟重切的x/z和y/z平面，比例尺为2 µm。(b) 电镜数据上的分割结果：轴突（蓝色）、Remak束（红色）、髓鞘（黄色和橙色）以及线粒体（青绿色），比例尺为2 µm。(c 和 d) 三维模型，比例尺分别为2 µm和500 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案旨在展示如何对样品进行最佳保存和对比处理，以利用聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）进行连续块面成像。因此，我们选择采用冷冻固定，随后通过冷冻置换结合微波辅助处理进行后染色。因此，该方案仅适用于尺寸足够小、可进行高压冷冻的样品。样品的尺寸限制为宽3至6 mm、厚约200 µm，该限制由样品载网的尺寸决定，该尺寸与本技术能够充分冷冻的样品大小相匹配。这一点对小鼠神经样品尤为重要，因为坐骨神经的直径过大，无法放入确保充分冷冻所必需的0.2 mm载网中。因此，建议仔细分离较小的神经，如胫神经，或其他较细的神经，如股神经。由于髓鞘对拉伸敏感，在解剖新鲜且具有活性的神经时必须格外小心，以避免操作带来的人工假象。通常情况下，电子显微镜研究应仅使用具有活性的样品。

微波辅助处理与最小树脂包埋旨在加快样品制备与定位过程。采用改良OTO方案4的微波辅助处理用于室温化学固定。家用微波设备无法获得相同结果，因其微波分布不均、温度不可控，且无法施加真空。样品越小，化学试剂渗透效果越好，因此较小的样品可获得最佳结果。为避免样品因过热而受损，温度控制及施加最低必要微波功率至关重要。若无微波设备，微波辅助处理步骤可在实验台上手动进行，但会导致处理时间延长。为在扫描电镜（SEM）中直接定位目标结构，必须尽可能去除样品表面的树脂。在采集数据集后，需对原始数据进行后处理，以减小文件体积并提高信噪比。现代体成像技术会产生大量数据，因此为快速且充分地完成数据处理，工作站需配备充足的内存（RAM）。进行图像配准时，所需内存至少应为数据集大小的两倍。

该方案已在小鼠的胫神经以及 秀丽隐杆线虫. Hall 等.12 在室温下进行冷冻置换后的样品制备中采用了类似的增强步骤 秀丽隐杆线虫 对于斑马鱼等其他模式生物，可能需要对方案进行调整。一种可能的修改是改变冷冻置换混合液的成分，例如添加水以增强对比度18此外，冷冻置换的持续时间需根据样品进行调整，并可依据快速冷冻置换方案显著缩短。19一种可能的方法是采用振荡以加速冷冻置换过程20冷冻置换后，可进行进一步修饰，例如重复应用增强性化学试剂和四氧化锇21在微波处理过程中，可调整温度、孵育时间及功率设置，以优化不同样本的实验结果。

本方案表明，这种增强方法可与其他冷冻置换方案及不同类型的样品相结合，如 Hall12 所述，适用于聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）或连续块面扫描电子显微镜成像。这些成像技术需要更高的对比度，而透射电子显微镜对此要求较低。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

FIB-SEM 及 A.S.（FIB-SEM 操作员职位）由卓越集群和德国研究基金会（DFG）纳米级显微成像与脑部分子生理学研究中心（CNMPB）资助。我们感谢 Thomas Müller-Reichert 实验室提供 秀丽隐杆线虫 样本. 我们感谢 Ulrich Weikert 参与本视频的拍摄。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
Leica HPM100Leica
自动冷冻置换仪Leica
带温度控制单元的实验室微波仪Ted Pella
EM ACE600（带金靶）Leica
Crossbeam 540Zeiss
卤素灯 12 V/ 20 WOsram
烘箱VWR
冷冻
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2153
M9自制根据《秀丽隐杆线虫——一种实用方法》I.A. Hope
十六碳烯Sigma-Aldrich52276
聚乙烯吡咯烷酮Sigma-AldrichP2307
A型载样板Wohlwend GmbH#241
B型载样板Wohlwend GmbH#242
狭缝型载样板Wohlwend GmbH#446
塑料巴斯德吸管VWR612-1684
镊子FST11200-10
冷冻置换
丙酮science services10015
单宁酸Sigma-Aldrich403040
四氧化锇EMS19100
醋酸铀酰SPI-Chem02624-AB
丙酮EMS10015
硫代羰基肼Sigma-Aldrich223220
Nunc 冷冻管Sigma-AldrichV7884-450EA
表面皿，150 mmVWR216-2189H
Eppendorf 管Eppendorf0030 120.094
Durcupan 树脂Sigma-Aldrich44610
样品固定
SEM 样品台Science ServicesE75200
Aclar 膜Science Services50425-10
牙签
滤纸VWR512-3618
导电银胶EMS12670-EEEPO-TEK EE 129-4
软件
图像采集ZeissSmartSEM
图像采集ZeissAtlas5 A3D
图像处理开源Fijihttp://fiji.sc/#download
图像可视化开源IMODhttp://bio3d.colorado.edu/imod/

参考文献

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