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方法文章

直接注射慢病毒载体突出显示大鼠脊髓中的多条运动通路

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DOI：

10.3791/59160

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2019年3月15日

 ,  ,  ,  , 
1Shriner's Pediatric Research Center, Temple University

本文内容

摘要

本方案演示了将一种可逆向运输的病毒载体注射到大鼠脊髓组织中的操作。该载体在突触处被摄取，并逆向运输至靶神经元的胞体。此模型适用于重要脊髓通路的逆向示踪，或用于基因治疗应用中对特定细胞的靶向递送。

摘要

将目标蛋白导入神经系统细胞具有挑战性，因为天然的生物屏障限制了大多数分子的进入。直接注射到脊髓组织可绕过这些屏障，使分子能够进入细胞体或突触并被整合。将病毒载体技术与该方法结合，可将目的基因导入神经组织，用于基因治疗或神经通路示踪。本文介绍了一种经过改造、具有高效逆向运输能力的病毒载体（HiRet），将其注射至脊髓固有中间神经元（PNs）的突触处，以促进其特异性逆向运输至脊髓和脑干核团中的神经元。靶向PNs的优势在于，这些神经元接收来自红核脊髓束和网状脊髓束等运动通路的广泛输入，并且在脊髓各节段之间相互连接。使用持续表达绿色荧光蛋白（GFP）的HiRet载体进行示踪的结果显示，胸段PNs以及脑桥网状结构中的网状脊髓神经元的细胞体、轴突和树突分支均被高保真地标记。HiRet载体在脑干通路和PNs中整合良好，但在皮质脊髓束神经元中的整合具有年龄依赖性。综上所述，利用病毒载体进行脊髓注射是一种适用于将目标蛋白导入特定神经通路神经元的有效方法。

引言

病毒载体是重要的生物学工具，可将遗传物质导入细胞，以弥补缺陷基因、上调重要的生长蛋白或产生标记蛋白，从而突出显示靶细胞的结构和突触连接。本文重点介绍将一种高效逆向运输的慢病毒载体直接注射到大鼠脊髓中，以通过荧光示踪技术标记主要的运动通路。  该方法也非常适用于轴突再生与再生研究，可将目的蛋白导入多种神经元群体，并已被用于沉默神经元以进行功能定位研究1,2。

脊髓运动通路的许多解剖学细节是通过使用经典示踪剂（如BDA和fluoro-gold3,4,5,6,7,8）进行直接注射研究而阐明的。这些示踪剂被视为金标准，但可能存在某些缺点，例如会被损伤的轴突或经过注射部位周围白质的穿行轴突摄取9,10,11。这可能导致对通路连接性的错误解释，在再生研究中尤其不利，因为在后期分析中，染料被损伤或切断的轴突吸收可能被误认为是再生的纤维12。

慢病毒载体在基因治疗研究中广受欢迎，因为它们可在神经元群体中实现稳定且长期的表达13,14,15,16,17,18,19然而，传统包装的慢病毒载体可能具有有限的逆行运输能力，并且在使用时可能引发免疫系统反应 体内4,20,21Kato 等人通过用狂犬病病毒糖蛋白修饰病毒包膜，构建了一种高效逆向转运载体，称为 HiRet，该载体为一种可增强逆向转运能力的杂合载体。22,23.

逆行示踪技术将载体引入目标神经元的突触间隙，使其被该细胞的轴突摄取并逆向运输至胞体。已有研究证实，HiRet 可成功从神经元突触进入小鼠和灵长类动物的大脑23,24，也可从肌肉进入运动神经元22。本实验方案演示了向腰段脊髓注射，特异性靶向脊内中间神经元和脑干神经元的突触终末。脊内神经元（PNs）接受来自多种不同脊髓通路的连接，因此可用于靶向脊髓和脑干中多样化的神经元群体。本研究中标记的神经元代表支配与后肢运动功能相关的运动神经元池的神经环路。在脊髓和脑干中均观察到强烈的标记信号，包括树突分支和轴突终末的高保真细节。在先前的研究中，我们也已在颈段脊髓应用该方法标记脊内通路及脑干网状脊髓通路25。

本方案演示了将病毒载体注射到大鼠腰段脊髓的过程。如视频1所示，通过识别位于最后一根肋骨处的L1椎骨来确定切口位置。以此作为尾侧标志，做一道3-4 cm的切口，暴露覆盖L1-L4脊髓节段的肌肉组织。随后对T11-T13椎骨的背侧进行椎板切除，将斜面玻璃针头置于中线外侧0.8 mm处，并插入灰质深部1.5 mm进行病毒注射。

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方案

以下所有外科手术和动物护理程序均已获得天普大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 术前准备

  1. 在手术前几天准备用于病毒注射的拉制玻璃针，使用专为纳升注射器设计的3.5纳升玻璃毛细移液管。按照制造商的说明，在两步式拉针仪上拉制每根毛细管，以制备两个针头模板。
  2. 使用显微剪裁去约1–2 mm多余的玻璃，以修整针头模板的尖端。在显微镜下利用显微镜校准载片测量近似孔径，筛选出孔径为30–40 µm的针头。
  3. 将针头以30°角放置，使用微移液管斜面研磨仪制备出具有30–40 µm孔径和45°斜面角度的针尖。利用校准载片上的游标尺验证孔径宽度。使用带有柔性针头附件的注射器将水和乙醇通过玻璃针，以清除碎屑，并用黑色记号笔在针管上等距标记。
  4. 将针头置于先前用70%乙醇清洁过的带盖培养皿中，在生物安全柜内用紫外灯照射30分钟进行灭菌。
  5. 在操作前立即从冷冻保存中取出适量的HiRet慢病毒。
    注意：适量包括注射所需体积（每次注射1 µL × 注射次数）以及额外少量，以补偿移液和装载过程中的损耗。不使用时，应将病毒置于冰上运输和保存。
  6. 通过将注射器插入微泵并将其安装到带有游标尺的显微操作器中，完成注射器的准备工作。
  7. 准备玻璃针时，使用配备柔性针头的注射器小心地装入红色油等有色染料。确保针内无气泡残留。 操作针头时应采用无菌技术，避免触碰针尖。
  8. 将玻璃针插入注射器，确保针头正确嵌入垫圈，注射器帽已拧紧，且钢制注射针伸出长度约为玻璃针长度的¾。病毒可在后续步骤中装入针内。

2. 麻醉与手术部位准备

  1. 使用电子天平称量动物体重。记录术前体重，以确定所需麻醉剂的用量，并便于术后体重监测。本方案中使用了体重约为200–250 g的雌性Sprague-Dawley大鼠。
  2. 使用异氟烷吸入或氯胺酮/甲苯噻嗪混合溶液（k/x）注射对大鼠进行麻醉。此处采用腹腔注射，氯胺酮剂量为67 mg/kg，甲苯噻嗪剂量为6.7 mg/kg。
  3. 通过用力捏压足部确认是否达到适当的麻醉平面。如果出现反射性回缩，需等待数分钟后再继续操作。
    注意：还需观察胡须、眼睛和呼吸频率以判断意识状态。若胡须出现抽动、轻触眼睛时有眨眼反应，或呼吸变得快速而浅表，应等待麻醉深度加深后再继续实验操作。在整个椎板切除术和注射手术过程中均需持续监测上述指标。若动物显示麻醉过浅，应追加注射仅含氯胺酮的麻醉剂，剂量为初始氯胺酮/赛拉嗪（k/x）剂量的½。
  4. 从髋部至肩胛骨下角沿背部中线剃除大鼠的毛发。拉紧动物皮肤以使剃除过程更轻松且精确。
  5. 双眼涂抹眼膏。
  6. 将消毒剂涂抹于剃毛区域以消毒手术部位。第一次清洁时，用无菌纱布浸透5%碘溶液，彻底擦去所有毛发和碎屑。随后用浸有70%乙醇的无菌纱布单向擦拭，确保每个区域仅接触一次。采用相同方法，交替使用浸有碘溶液和乙醇的无菌纱布重复操作两次。

3. 手术区域与器械准备

  1. 准备一套已灭菌的手术器械，包括手术刀、咬骨钳、鼠齿镊、弹簧剪、止血钳、中号弯头持针钳以及牵开器或带重物的挂钩，通过打开无菌包装以建立无菌区域。
  2. 打开一包无菌手术手套，将无菌手套的包装纸放置在桌面上，用作使用过的器械的额外无菌区域，以防止污染无菌包装。
  3. 将一片#10手术刀片放入无菌区域中，使用止血钳将刀片固定在刀柄上。将无菌生理盐水、4.0铬制肠线缝合线，以及用于控制出血的材料（如电凝器、无菌纱布、无菌棉签（用于肌肉出血）、明胶海绵或骨蜡（用于骨出血））放置在便于取用的位置。
  4. 取出实验动物并将其置于无菌布上，在膀胱下方垫上纱布以收集尿液。用卷起的毛巾垫高腹部下方，支撑手术区域。如有条件，可在无菌布下方放置手术加热垫，尤其适用于较长时间的手术。
    注意：在可存活动物手术过程中，无菌操作至关重要。应备有70%乙醇喷雾瓶，用于保持戴着手套的手部无菌；若器械无菌状态被破坏，或在不同动物手术之间，应使用干热灭菌器对器械进行灭菌。

4. 暴露椎体并确定椎板切除部位

  1. 通过用手指轻轻按压最后一根肋骨处以定位第一腰椎（L1），确定皮肤切口的位置。以此为解剖标志，在L1稍下方做一长度为3-4 cm的皮肤切口，以暴露下方肌肉。操作时用手将皮肤绷紧，用手术刀片 firm 地按压，确保切口整齐。
  2. 必要时用镊子和剪刀剪开并分离浅层脂肪组织  。（根据目标椎体的不同，肌肉表层可能存在或不存在较大的脂肪垫） 
  3. 用手术刀片的平面或手指触诊棘突位置。通常，中线区域两侧可见由白色筋膜构成的“V”形轮廓。先做一个小的向头侧切口，以便用鼠齿镊牢固夹住上方的棘突，然后尽可能贴近棘突做两个长而深的切口。在切口最深处，可用刀片触碰到椎体的背侧表面。
  4. 使用牵开器或带重钩将侧方肌肉牵开，以改善术野视野。用手术刀、弹簧剪或咬骨钳清除棘突周围的肌肉组织，以辨认其头部形态。
    注意：需牢记脊髓并不贯穿整个椎管全长，因为脊髓组织在发育过程中比骨骼更早停止生长。这意味着目标脊髓节段可能位于命名不同的椎体下方。
  5. 定位第11胸椎（T11）及其相邻的T12和T13棘突。
    注意：可参考大鼠脊髓图谱以及既往关于小鼠解剖标志的研究来辅助确定正确的椎体节段，小鼠的椎体结构与大鼠非常相似6,33。保留一个头侧的棘突（如T9）不受干扰，作为中线定位的参考标志。

5. 进行椎板切除术

  1. 确定目标区域后，对 T11-T13 节段的椎骨背侧进行椎板切除。轻柔撑开椎骨以暴露椎间韧带，此处是使用咬骨钳进行初次咬除骨组织的理想位置。将咬骨钳保持在半闭合状态，以增强精细控制。
  2. 使用咬骨钳小量分次咬除棘突及椎骨背侧部分。注意避免损伤脊髓或扰动硬脊膜。可用鼠齿钳轻轻上提，帮助将脊髓从椎骨处拉开，减少触碰脊髓组织的风险。
  3. 清除中线附近的骨碎片，以便观察中线处的血管。保留一个清晰显露脊髓组织且无碎屑遮挡的骨窗。
  4. 用镊子轻触脊髓表面。某些动物即使处于较深麻醉状态，也可能出现反射性跳跃。可在注射操作前直接向脊髓表面滴加数滴局部麻醉剂（如利多卡因），以防止注射过程中发生跳跃。
  5. 通过将固定钳夹紧在椎板切除窗前后方的棘突上，将动物固定于脊柱固定装置中。利用脊柱固定装置抬高动物腹部，以抵消呼吸运动带来的影响。此举可提高注射针的稳定性，并确保注射深度准确。

6. 加载病毒并定位注射器

  1. 用移液器吸取约 5 µL 病毒液，滴加到一片石蜡膜上，将注射针尖置于液滴内部，以加载病毒。
  2. 使用微泵以 20–100 nL/s 的速度回抽最多 4 µL 病毒液。
  3. 将控制器设为注射模式，从针尖释放少量病毒，以确认针尖未被堵塞。用实验室擦拭纸擦去多余的病毒。
    注意：可选用带有不锈钢针头的汉密尔顿注射器（Hamilton syringe）替代拉制的玻璃毛细管。
  4. 调整显微操作仪，使游标尺清晰可见，并将针头置于脊髓中线位置。
    注意：有时可通过观察脊髓腹侧表面沿中线走行的一条较大血管来定位中线。但该血管在不同个体大鼠中可能存在差异，因此应通过与完整的棘突进行比对，确认中线定位的准确性。
  5. 利用显微操作仪上的游标尺，将针头向侧方移动 0.8 mm。
  6. 将针头缓慢下降至脊髓表面，使其轻压但不穿透硬脊膜。随后以快速扭转动作刺穿硬脊膜，使针头进入深度达 1.5 mm。

7. 将病毒注射至脊髓

  1. 针头就位后，设置注射器以 400 nL/min 的速率进行注射。通过观察染料前沿的推进情况，确认病毒正在进入脊髓。脊髓组织应无明显渗漏或膨出。若观察到渗漏，可尝试将注射速度降低至 200 nL/min 以缓解。
  2. 注射完成后，将针头在脊髓中留置 2–5 分钟（根据注射体积而定），以促进病毒扩散。
  3. 缓慢撤出针头，移至下一个注射位点。沿 L1-L4 脊髓组织长度方向，每隔约 1 mm 选择一个位点，共 6 个等距位点，每个位点注射 1 µL 病毒。只要针头功能正常，可重复用于每次注射。

8. 伤口闭合与术后护理

  1. 将动物从脊柱固定装置中取出，并移除用于撑开侧肌的牵开器或钩子。在关闭切口前，确保伤口内无任何异物。
  2. 使用4.0铬制肠线缝合肌肉。将缝线剪至靠近结处，以降低引起皮肤内部刺激的可能性。
  3. 使用9 mm伤口夹将皮肤夹合闭合。为促进最佳愈合，在夹合前应将皮肤边缘对齐。
  4. 将动物置于水对流加热垫上，并持续监测直至其清醒。
  5. 皮下注射5–10 mL无菌生理盐水以补充液体，并注射头孢唑林等抗生素以预防感染。 当动物恢复自主活动能力后，将其放回原有饲养笼，并给予初始镇痛药物。 密切观察大鼠是否出现疼痛或痛苦迹象，并根据本机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的镇痛方案进行处理。

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结果

成功注射并运输病毒载体后，应在脊髓及某些脑干核团中实现大量单侧神经元的转导。图1展示了注射后四周胸段脊髓及脑干脑桥网状结构中神经元和轴突的典型标记。在注射同侧胸段脊髓灰质中可见显著的GFP表达（图1A，方框区域）。在对侧也观察到少量神经元，尤其靠近中线区域。在白质中，同侧脊髓的轴突可见GFP表达（图1A，箭头和箭头标示处），尤其是在典型的脊髓固有轴突分布区域（箭头标示处）。图1A’为图1A中方框区域的高倍放大图像，显示神经元胞体和树突中的典型表达。在脑干核团（如脑桥网状结构）的神经元中也可观察到GFP表达（图1B，方框区域的高倍放大图像见图1B’）。

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讨论

对脑和脊髓中神经元的遗传学操控已通过荧光示踪技术揭示了感觉、运动及自主神经通路，并可用于探索神经纤维束在损伤后的再生潜力27,28,29,30,31,32,33。将可逆向运输的病毒载体直接注射至脊髓，可通过突触连接靶向特定神经元群体，因此该方法是描绘中枢神经系统通路的理想选择。HiRet载体在神经元突触处具有特异性摄取能力22,24,25，既往使用结构相似载体进行的示踪研究表明，其不会扩散至受...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国家神经疾病与卒中研究所资助项目 R01 R01NS103481、儿童烧伤医院儿科研究资助项目 SHC 84051 和 SHC 86000，以及美国国防部项目（SC140089）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#10 手术刀片RobozRS-9801-10与手术刀配合使用。
1 mL 注射器Becton, Dickinson and Company309659用于麻醉剂腹腔注射、可能的麻醉加强注射以及抗生素注射。
10 mL 注射器Becton, Dickinson and Company309604用于术后向动物体内注射生理盐水。
4.0 铬制肠线缝合线DemeTECHNN374-16在关闭切口时重新缝合肌肉。
48000 微量移液器研磨仪World Precision Instruments32416用于将拉制的玻璃毛细管尖端研磨成可用的玻璃针头。
5% 碘溶液Purdue Products L.P.L01020-08用于手术部位的消毒。
70% 乙醇N/AN/A用于新制备玻璃针头的消毒、手术准备期间动物模型和外科医生手部的消毒，以及其他所有维持无菌环境的小规模操作。
麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪溶液）Zoetis240048用于在手术期间维持动物处于适当的意识状态。
抗生素（头孢唑林）West-Ward PharmaceuticalsNPC 0143-9924-90需皮下注射，以预防术后感染。
珠式灭菌器CellPoint5-1450用于加热灭菌外科器械。
骨蜡Fine Science Tools19009-00在发生骨出血时用于封闭骨组织。
电凝器Fine Science Tools18010-00用于封闭手术中切断的动脉或静脉，防止过度失血。
电子天平OkausREV.005用于手术准备期间称量动物体重。
柔性针头连接装置World Precision InstrumentsMF34G-5用于清洗玻璃针头并将红油装入玻璃针头。
明胶海绵（Gelfoam）PfizerH68079在发生骨出血时用于封闭骨组织。
玻璃毛细管World Precision Instruments4878用于拉制玻璃针头——应设计适用于纳升注射器。
毛发剪Oster111038-060-000用于清除手术部位的毛发。
止血钳RobozRS-7231用于手术中的常规操作。
吸水纸（Kimwipes）Kimtech34155用于手术中的常规操作。
中号尖头弯镊RobozRS-5136用于手术中的常规操作。
带游标刻度的显微操作仪KanetecN/A用于手术期间精确定位。
显微剪刀RobozRS-5621用于剪除新拉制玻璃毛细管上的细丝。
带光源和游标目镜刻度的显微镜Leitz WetzlarN/A用于观察和测量拉制玻璃毛细管研磨成可用玻璃针头的过程。
微量注射泵控制器World Precision Instruments62403用于控制注射速率。
纳升级2000泵头注射器World Precision Instruments500150用于以可控方式装载和注射病毒。
针头拉制仪NarishigePC-100用于加热并拉伸玻璃毛细管以形成玻璃针头。
眼膏Dechra Veterinary ProductsRAC 0119用于保护动物在手术期间的眼睛。
封口膜（Parafilm）BemisPM-996辅助将病毒装入纳米注射器。
精密滑动针头（25G × 5/8）Becton, Dickinson and Company305122与1 mL和10 mL注射器配合使用，以便对动物模型进行注射。
鼠齿镊RobozRS-5152用于夹持棘突。
红油N/AN/A在注射过程中提供可视化前沿，以便观察病毒进入组织的情况。
牵开器RobozRS-6510用于撑开手术切口。
Rimadyl 片剂Bio ServMP275-050用于术后镇痛管理。
咬骨钳RobozRS-8300用于手术期间从脊柱上移除肌肉。
手术刀片手柄RobozRS-9843用于在手术期间切开动物模型的皮肤和脂肪垫。
剪刀RobozRS-5980用于手术中的常规操作。
不锈钢伤口夹CellPoint201-1000用于在关闭切口时固定手术伤口的皮肤。
缝合钉拆除钳Kent ScientificINS750347用于拆除缝合钉，以防其安装不当。
无菌布巾Phenix Research ProductsBP-989为手术提供无菌操作表面。
无菌棉签Puritan806-WC用于在保持无菌条件下吸收手术切口中的血液。
无菌纱布Covidien2146用于在保持无菌条件下清洁手术区域和手术器械。
无菌生理盐水Baxter Healthcare Corporation281324用于清除血液以及术后补充体液。
外科手套N/AN/A供外科医生使用，以在手术期间维持无菌区域。
手术加热垫N/AN/A用于在手术期间维持动物模型的体温。
手术显微镜N/AN/A用于增强手术切口的可视化效果。
外科缝合器Kent ScientificINS750546用于施加缝合钉。
T/Pump 热疗水泵GaymarTP500C用于将温水泵入水对流加温垫中。
水对流加温垫Baxter Healthcare CorporationL1K018用于术后恢复区，以维持无意识动物的体温。
配重钩N/AN/A用于撑开手术切口。

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