直接注射慢病毒载体突出大鼠脊髓中的多种运动途径

摘要

该协议演示了在大鼠脊髓组织中注射一种具有可追溯性的可转移性病毒载体。载体在突触处被占据, 并被输送到目标神经元的细胞体。该模型适用于重要脊柱通路的逆行追踪或基因治疗应用中的靶向细胞。

摘要

将感兴趣的蛋白质引入神经系统的细胞是具有挑战性的, 因为固有的生物屏障限制了对大多数分子的访问。直接注射到脊髓组织绕过这些障碍, 提供进入细胞体或突触的机会, 在那里可以纳入分子。将病毒载体技术与这种方法相结合, 可以将目标基因引入神经组织, 用于基因治疗或肠道追踪。在这里, 一种为高效逆行转运 (Hirat) 而设计的病毒被引入到外源间神经元 (Pn) 突触上, 以鼓励向脊髓和脑干核的神经元进行特定的迁移。瞄准 Pn 利用了他们从运动通路 (如脊椎和网状脊椎通道) 获得的众多连接, 以及它们在整个脊髓段之间的相互连接。使用 HiRet 矢量和本构活性绿色荧光蛋白 (GFP) 进行代表性追踪, 显示胸椎 Pn 和网状网状结构中网状脊髓神经元的细胞体、轴突和树突状乔木的高保真度细节。Hiraet 很好地融入了脑干通路和 Pn, 但显示年龄依赖性整合到皮质脊髓神经元中。总之, 脊髓注射使用病毒载体是一个合适的方法, 将感兴趣的蛋白质引入目标区域的神经元。

引言

病毒载体是重要的生物工具, 可以将遗传物质引入细胞, 以补偿有缺陷的基因, 增强重要的生长蛋白或制造标记蛋白, 突出的结构和突触连接他们的目标。本文的重点是直接注射一个高效的逆行可转移性慢病毒载体到大鼠脊髓, 以突出主要运动途径与荧光追踪。 这种方法也是高度适用于轴突再生和再生研究, 以引入感兴趣的蛋白质的不同群体的神经元, 并已被用来沉默神经元的功能映射研究^1,2。

通过 bda 和氟金 3^、4^、5、6、^7等经典示踪剂的直接注射研究, 阐明了脊柱运动通路的许多解剖细节。^,8. 这些示踪剂被认为是金本位, 但可能有某些缺点, 如受损的轴突吸收, 或在注射部位^{9、10、11周围}的白质中的轴突吸收.这可能会导致对途径连接的不正确解释, 并可能是再生研究中的一个缺点, 在后来的分析12中, 受损或被切断的轴突吸收染料^可能会被误认为是再生纤维。

慢病毒载体在基因治疗研究中很受欢迎, 因为它们在^{13、14、15、16、17、18的神经元}群中提供稳定、长期的表达 ^,19。然而, 传统上包装的慢病毒载体可能有有限的逆行运输, 并可能触发免疫系统反应时, 在体内^使用4^{,20, 21}。加藤等人通过使用狂犬病毒糖蛋白修饰病毒包络, 以创建一种混合载体, 改善逆行运输 22^,23,^从而生产出一种名为 hiret 的高效逆行运输^载体。

逆行追踪将一个矢量引入目标神经元的突触空间, 使其被该细胞的轴突占据并输送到细胞体。hiraet 的成功运输已经被证明从神经元突^触到小鼠和灵长类动物的大脑 23, 24 和从肌肉到运动神经元²²。该方案演示注射到腰椎脊髓, 特别是针对突触端子的内脊髓间神经元和脑干神经元。Pn 接受来自许多不同脊髓通路的连接, 因此可以用来针对脊髓和脑干中不同的神经元群。这项研究中的标记神经元代表了与后肢运动功能相关的刺激运动神经元池的电路。坚固的标记可以在脊髓和脑干中看到, 包括树突乔木和轴突末端的高保真细节。我们在以前的颈髓研究中也使用了这种方法来标记本体和脑干网状脊髓通路²⁵。

该方案演示了在大鼠腰椎脊髓注射病毒载体的方法。如电影 1所示, 切口的目标是识别位于最后一根肋骨的 l1 椎体。这被用作一个月额地标为3-4 厘米的切口, 暴露在 L1-l4 脊髓肌肉组织。对 T11-t13 椎骨背侧的椎体进行层压, 将斜玻璃针从中线侧向0.8 毫米, 降低1.5 毫米深到灰质中注入病毒。

方案

以下所有手术和动物护理程序都已获得坦普尔大学动物护理和使用委员会的批准。

1. 手术前制剂

1. 在手术前几天使用3.5 纳米管玻璃毛细管移液器准备用于病毒注射的拉拉玻璃针。根据制造商的说明, 将每个移液器拉上两步针拉拔器, 以创建两个针头模板。
2. 用微型剪刀切割约1-2 毫米的多余玻璃, 以细化针头模板的尖端。使用显微镜校准幻灯片在显微镜下测量近似孔径大小, 以隔离具有30-40 微米孔径的针头。
3. 针头定位在 30°, 使用微型移液器斜面创建一个具有30-40 微米孔径和45°斜角的尖端。使用校准幻灯片上的 Vernier 刻度验证孔径宽度。使用带有柔性针头附件的注射器将水和乙醇通过玻璃针, 以冲洗掉杂物, 并定期用黑色标记标记针头。
4. 将针头放入以前用70% 乙醇清洗的覆盖的 Petri 培养皿中, 并在紫外线下的生物安全罩中消毒30分钟。
5. 在手术前立即从冰柜中取出合适的体积, 准备 hiret 慢病毒。
   注: 合适的体积包括注射所需的量 (每次注射1微克 x 注射次数), 以及少量的额外体积, 以考虑移液和装载损失。不使用时将病毒运输并储存在冰上。
6. 通过将喷油器插入微泵并将其放入具有 Vernier 刻度的微机械手来准备喷油器。
7. 要准备玻璃针, 请小心地装载彩色染料, 如红色油, 并配以灵活的针头。确保针头中没有气泡。在处理针头时使用无菌技术, 不要触摸针头。
8. 将玻璃针头插入喷射器, 确保针头正确地安装在垫圈中, 将喷射器盖拧紧, 并将钢制喷射针延长约为玻璃针的长度。病毒可以在稍后的步骤中加载到针头中。

2. 麻醉和手术部位准备

1. 在数字尺度上称重动物。记录术前重量, 以确定所需麻醉的体积, 并允许监测术后的重量。本协议中使用了雌性 Sprague-Dawley 大鼠约200–250克。
2. 使用吸入异氟醚或注射的酮胺-木糖溶液 (k/x) 对大鼠进行麻醉。在这里, 氯胺酮以 67 mg kg 的腹腔注射, 在 6.7 mg/kg 的剂量下注射 xylazine。
3. 用牢牢地捏脚确认合适的麻醉平面。如果发生反身取款, 请再等待几分钟, 然后再继续。
   注: 还要观察胡须、眼睛和呼吸速率, 以寻找意识的迹象。如果胡须在抽搐, 眼睛轻轻触摸时闪烁, 或呼吸迅速而浅, 等待麻醉平面更深的进行协议。此外, 在整个椎板切除术和注射手术中也会监测这些体征。如果动物显示浅麻醉平面, 管理氯胺酮的助推器镜头只能等于原来的 k/剂量的一半。
4. 从臀部到肩周骨的下角, 沿着背侧中线的老鼠。拉动物的皮肤拉紧, 更容易和更精确的剃须。
5. 将眼药膏涂在两只眼睛上。
6. 在剃光部位涂上防腐剂, 对部位进行消毒。第一次擦洗时, 用5% 的碘溶液浸泡无菌纱布, 并擦拭所有头发和杂物。通过在70% 乙醇中浸泡的无菌纱布的单向刷子, 实现这一点, 因此不会有两次接触区域。使用同样的技术交替碘和乙醇浸泡纱布两次。

3. 手术领域和仪器制备

1. 准备一套高压灭菌的手术工具, 包括手术刀、斜刀、大鼠牙钳、弹簧剪刀、止血仪、中点弯曲钳和牵引器或加权挂钩, 通过解包无菌包装创建无菌场。
2. 打开一包无菌手术手套, 并将无菌手套包装放在桌子上。使用它作为一个额外的无菌领域的使用工具, 以防止污染无菌包装。
3. 将 #10 手术刀刀片放在无菌场上。用止血器将刀片固定在手柄上。将无菌盐水、4.0 铬肠缝合线和控制出血的材料, 如烧焦剂、无菌纱布、无菌棉尖施药器 (用于肌肉出血) 或明胶或骨 (用于骨出血) 放置在可进入的地方。
4. 找回动物, 并将其放在无菌布上。在膀胱下面放置纱布以收集尿液。用腹部下的卷起的毛巾支撑目标区域。如果可用, 请将手术加热垫放在无菌布下面, 特别是用于较长的手术。
   注: 不育是重要的生存手术。将70% 乙醇的喷雾瓶放在手边, 以保持戴手套的手的无菌性, 并使用珠消毒器, 如果仪器不育被破坏, 或在个别手术之间。

4. 暴露脊柱和确定椎板切除术部位

1. 通过轻轻按压手指在最后一根肋骨上定位 L1 椎体, 确定皮肤切口的部位。使用此作为地标, 使3-4 厘米的皮肤切口与 #10 手术手术刀结束只是低于 L1, 以暴露肌肉。用轻轻的展开, 紧致皮肤, 用手术刀刀片用力按压, 以确保切口干净。
2. 必要时, 用钳子和剪刀切割和涂抹浅表脂肪。(根据目标椎体的不同, 肌肉可能有或没有一个大的脂肪垫)。
3. 用手术刀刀片或手指的扁平来感受刺过程。通常中线区域将由两侧的白色筋膜 "v" 勾勒出。做一个小的滚切, 让空间用老鼠的牙齿钳安全地抓住一个上面的过程, 然后使2个长的, 深的切割尽可能接近的过程。在切割的最深点, 可以用手术刀刀片感觉到椎骨的背侧表面。
4. 用牵引器或加权挂钩将侧向肌肉放在一边, 以提高能见度。用手术刀、弹簧剪刀或长皮草清除周围的肌肉, 以确定他们头部的形状。
   注: 请记住, 脊髓不会延长脊柱的全长, 因为脊髓组织停止生长早于骨骼。这意味着目标脊椎水平可能位于不同名称的椎体下。
5. 找到 T11 和相邻的 T12 和 T13 进程。
   注: 在大鼠脊髓图集和先前概述小鼠地标的研究中, 可以找到针对正确椎体水平的帮助, 小鼠的椎体结构^非常相似, 有 6^{, 33}。留下一个祖先的刺过程, 如 T9 不受干扰, 给一个中线地标。

5. 进行椎板切除术

1. 一旦正确识别了目标区域, 就对 T11-t13 的背侧进行分层切除。轻轻地展开椎体, 露出椎间韧带, 这是很好的部位, 插入龙骨的最初咬伤。将长在半封闭的位置上, 以增加精细控制。
2. 通过对脊椎进行小口伤, 去除椎骨的刺过程和背侧。注意不要损坏脊髓或打扰硬脑膜。用大鼠的牙钳稍微抬起, 以帮助将脊髓从椎骨上拉开, 并减少击中脊髓组织的倾向。
3. 清除骨头远离中线, 以便观察中线血管。留一个窗户, 清楚地显示脊髓组织, 没有碎片。
4. 用钳子轻轻触摸脊髓。有些动物即使麻醉平面很深, 也可能会本能地跳跃。在注射过程中, 直接在脊髓上涂抹几滴麻木剂, 如利多卡因, 以防止跳跃。
5. 通过将稳定钳固定在脊柱支架上, 将动物固定在椎板切除术窗口的脊椎内。提高动物的腹部, 使用脊柱持有人, 以否定呼吸运动的影响。这将增加针头的稳定性, 并确保适当的注射深度。

6. 装病毒并定位注射器

1. 将病毒输送到注射器中, 方法是将大约5μl 移入一块副体, 并将针头定位, 使尖端位于滴内。
2. 使用微泵以 20–100 Nl\ 的速度提取多达4μl 的病毒。
3. 将控制器设置为注入并从针头释放少量病毒, 以确保针头不被堵塞。用实验室擦拭清除多余的病毒。
   注: 带有钢针的哈密顿注射器可作为拉玻璃移液器的替代品。
4. 放置微机械手, 使 Vernier 刻度可见, 并将针头定位在脊髓的中线。
   注: 中线有时可以定位在脊髓前表面上的大血管。然而, 这在个别老鼠身上可能有所不同, 中线目标应该通过与完整的刺过程进行比较来确认。
5. 使用微机械手上的 Vernier 刻度侧向引导针头 0.8 mm。
6. 将针头降低到脊髓, 直到它被缩进, 但不刺破硬脑膜。使用快速扭转运动, 用针头刺穿硬脑膜, 直到它沉入1.5 毫米的深度。

7. 将病毒注射到脊髓

1. 一旦针头就位, 以 400 nlmin 的速度对注射器进行注射, 通过观察染料前部的进展情况, 确认病毒正在进入脊髓。脊髓组织不应明显渗漏或鼓胀。如果观察到泄漏, 有时可以通过将注射速度降低到 200 nL/min 来缓解。
2. 注射完成后, 让针头在脊髓中停留 2-5分钟 (取决于注射量), 以促进病毒的扩散。
3. 慢慢地取出针头, 移动到下一个注射部位。在沿 L1-l4 脊柱组织长度相距约1毫米的6个均匀分布部位中, 向每个区域注入1μl 病毒。每次注射都可以使用相同的针头, 只要它继续正常工作。

8. 伤口闭合和术后护理

1. 从脊椎支架上取下动物, 取出用于传播外侧肌肉的牵引器或钩子。关闭前确保伤口清除所有碎屑。
2. 使用4.0 致变色的肠胃缝合缝合肌肉。将缝合线切割到靠近结的螺纹, 以减少内部皮肤刺激的可能性。
3. 用9毫米的伤口夹缝合皮肤。为了实现最佳的愈合, 在装订前, 先将皮肤的边缘排成一行。
4. 将动物放在水对流加热垫上, 并进行监测, 直到醒来。
5. 注射5-10 毫升的无菌盐水皮下注射, 以补充液体和抗生素, 如头孢唑啉, 以防止感染。当动物是流动的, 把它放回家里的笼子, 并提供最初的镇痛药。 监测老鼠的疼痛和痛苦的迹象, 并根据您的 IACUC 批准的减轻疼痛的程序进行治疗。

结果

病毒载体的成功注射和运输应导致脊髓和某些脑干核中的单侧神经元的强群的传导。图 1显示了胸腔脊髓和脑桥网状脑干在注射后四周形成的神经元和轴突的定型标记。在注射侧同侧的胸脊髓灰质神经元中可见显著的 GFP 表达 (图 1 a, 盒装区域)。在对侧也观察到一些神经元, 特别是在中线附近。在白质中, GFP 的表达是在同侧脐带 (图 1a、箭头和箭头) 的轴突中观察到的, 特别是在本体骨轴突 (箭头) 的典型区域。图 1a '显示了 a 中盒装区域的较高放大倍率, 显示了神经元细胞体和树突中的典型表达。神经元中 GFP 的表达也可以在脑干核中观察到, 如桥状网状形成 (图 1 b,图 1 b 中盒装面积的放大倍率较高)。

讨论

基因操纵的神经元在大脑和脊髓已有助于突出感觉, 运动和自主途径通过荧光追踪, 并探索损伤 27, 28 后神经元束^的再生潜力,^{29,30,31,32,33}. 将具有逆行可运输的病毒载体直接注入脊髓, 可以通过神经元的突触连接针对神经元群, 使这一方法成为绘制中枢神经系统通路的绝佳选择。hiret 载体特别显示在^22、24、25神经元突触处的选择性吸收, 以前用类似结构的载体追踪显示, 没有扩散...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#10 手术刀刀片	Roboz	RS-9801-10	用于手术刀。
1 mL 注射器	Becton， Dickinson and Company	309659	用于麻醉剂 IP 注射、潜在的麻醉剂加强针和抗生素注射。
10mL 注射器	Becton， Dickinson and Company	309604	动物注射生理盐水。
4.0 铬肠线缝合	DemeTECH	NN374-16	在闭合过程中重新结合肌肉。
48000 微量移液器 斜面机	World Precision Instruments	32416	用于对拉动的玻璃毛细管的尖端进行斜面处理，以形成功能性玻璃针头。
5% 碘溶液	Purdue Products L.P.	L01020-08	用于手术部位的消毒。
70% 乙醇	N/A	N/A	用于对新制备的玻璃针、手术准备期间的动物模型和手术期间的外科医生手进行消毒，以及所有其他轻微的无菌维持。
麻醉剂 （氯胺酮/甲苯噻嗪溶液）	Zoetis	240048	用于在手术过程中使动物保持在正确的意识平面。
抗生素（头孢唑啉）	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	皮下注射以防止术后感染。
微珠灭菌器	CellPoint	5-1450	用于对手术器械进行加热灭菌。
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	在骨出血的情况下密封骨头。
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00	密封手术过程中切断的任何动脉或静脉，以防止失血过多。
数字秤	Okaus	REV.005	用于在手术准备期间对动物进行称重。
柔性针附件	World Precision Instruments	MF34G-5	用于清洁玻璃针和将红油加入玻璃针中。
Gelfoam	辉瑞	H68079	在骨出血的情况下密封骨头。
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	对于拉扯玻璃针 - 应设计为纳升注射器。
理发器	Oster	111038-060-000	用于清理手术部位的头发。
止血钳	Roboz	RS-7231	用于外科手术的一般用途。
Kimwipes	Kimtech	34155	用于外科手术的一般用途。
中尖弯曲镊子	Roboz	RS-5136	用于手术的一般用途。
带有游标尺的显微作器	Kanetec	N/A	用于手术中的精确定位。
微型剪刀	Roboz	RS-5621	用于从新拉出的玻璃毛细管上切割玻璃耳语。
带光和游标刻度的显微镜 目镜	Leitz Wetzlar	N/A	用于可视化和测量拉动的玻璃毛细管向功能性玻璃针的斜面。
MicroInject Pump 控制器	World Precision Instruments	62403	控制注射速度。
Nanoliter 2000 泵头注射器	World Precision Instruments	500150	以受控方式加载和注射病毒。
拔针器	Narishige	PC-100	加热和拉开玻璃毛细管以形成玻璃针。
眼药膏	Dechra 兽医产品	RAC 0119	在手术过程中保护动物的眼睛。
石蜡膜	Bemis	PM-996	协助将病毒装入纳米注射器。
PrecisionGlide 针头 （25G x 5/8）	Becton， Dickinson and Company	305122	用于 1 mL 和 10 mL 注射器，以便注射动物模型。
大鼠牙镊子	Roboz	RS-5152	用于夹持棘突。
Red Oil	N/A	N/A	为注射过程中病毒进入组织的可视化提供一个前部。
牵开	Roboz	RS-6510	保持手术伤口张开。
Rimadyl 片	Bio Serv	MP275-050	用于术后疼痛管理。
Rongeurs	Roboz	RS-8300	在手术过程中从脊柱中取出肌肉。
手术刀刀片手柄	Roboz	RS-9843	在手术过程中切片动物模型的开放皮肤和脂肪垫。
剪刀	Roboz	RS-5980	用于手术的一般用途。
Stainless Steal Wound Clips	CellPoint	201-1000	在闭合过程中捆绑手术伤口的皮肤。
订书钉去除钳	Kent Scientific	INS750347	要取出订书钉，如果它们应用不正确。
无菌布	Phenix Research Products	BP-989	为手术提供无菌表面。
无菌棉头涂抹器	Puritan	806-WC	吸收手术伤口中的血液，同时保持无菌。
无菌纱布	Covidien	2146	在保持无菌的同时清洁手术区域和手术工具。
无菌盐水	Baxter Healthcare Corporation	281324	用于血液净化和术后补充液体。
手术手套	N/A	N/A	供外科医生在手术过程中保持无菌区域。
手术加热垫	N/A	N/A	用于在手术过程中维持动物模型的体温。
手术显微镜	N/A	N/A	用于增强手术伤口的可视化。
外科吻合器	Kent Scientific	INS750546	应用订书钉。
T/Pump 热疗水泵	Gaymar	TP500C	将温水泵入水对流加热垫。
水对流加热垫	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	用于术后恢复区域，以维持失去知觉的动物的体温。
加重钩	N/A	N/A	保持手术伤口开放。